方法論記事

挿入型突然変異誘発細胞ライブラリーにおける機能関連レンチウイルス組み込み部位の同定

DOI：

10.3791/67552

⸱

2025年1月10日

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

挿入突然変異誘発は、機能的なゲノム要素を特定するための前方遺伝学において不可欠なツールです。ここでは、レンチウイルスベースの挿入突然変異誘発細胞ライブラリー内のレンチウイルス統合部位を検出する方法であるInSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒトゲノム内の機能配列の範囲は、生物学において極めて重要でありながら議論の余地のあるトピックです。ハイスループットのリバースジェネティックスクリーニングは、この研究において進歩を遂げてきましたが、多くの場合、その範囲を既知のゲノム要素に限定し、非特異的な影響をもたらす可能性があります。このことは、ゲノムの機能をより深く、偏りなく理解することを可能にする新しい機能ゲノミクスツールが緊急に必要とされていることを強調しています。このプロトコルでは、レンチウイルスベースの挿入突然変異誘発細胞ライブラリー内のレンチウイルス統合部位を同定する方法であるInSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)を導入します。InSETは、隣接する配列の検出と定量に使用される次世代シーケンシングにより、ゲノムワイドなレンチウイルス統合部位の捕捉を容易にします。InSETのデザインは、表現型スクリーニングにおける統合部位の存在量の変動を大規模に解析することを可能にし、フォワードジェネティクスおよび機能的ゲノム要素の同定のための堅牢なツールとしての地位を確立しています。InSETの主な利点は、タンパク質コードRNAとノンコーディングRNAの両方の新規機能的エクソンを含む、これまで同定されていなかったゲノム要素を明らかにする能力です。全体として、InSETは、多くのゲノム要素が機能特性評価を待っているヒトゲノムとトランスクリプトームの複雑な複雑さを研究する上で大きな価値を持っています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機能ゲノミクスは、ポストゲノムの時代においても重要で挑戦的な分野であり、ゲノム領域のかなりの部分が依然として機能特性評価を欠いています。これらの課題の主な理由は、ヒトゲノムとトランスクリプトームの複雑な性質にあり、タンパク質コード領域と非コード領域の両方での広範な転写と普遍的な選択的スプライシングを特徴としています1,2,3,4,5.この複雑さは、RNAを標的とした濃縮研究を通じて広く強調されています6,7,8,9。ヒトゲノムの十分に注釈されたセグメントに加えて、多数の新規ゲノム要素がマッピングされておらず、機能的に注釈が付けられていないことがますます認識されています10,11,12

。

近年、RNA干渉(RNAi)やCRISPR/Casシステムなどの逆遺伝学ツールの進歩が見られます13,14,15,16,17,18,19,20,<しかし、これらの方法には、短いヘアピンRNA(shRNA)またはシングルガイドRNA(sgRNA)の複雑なライブラリの生成に関連する非特異的な影響や高コストなどの顕著な欠点があります。22,23,24,25.さらに、これらの方法は主に注釈付きゲノム要素に焦点を当てています。対照的に、フォワードジェネティクスには、新規で注釈のない機能ゲノム要素を特定するという利点があります。ヒトゲノムとトランスクリプトームの複雑さ、そして膨大な数の新規ゲノム要素を考えると、このフォワードジェネティクスの能力は非常に重要です。

フォワードジェネティクス細胞ライブラリーは、ランダムなレトロウイルス統合によって生成されることが多く、フォワードジェネティクスアッセイではゲノムワイドな組み込み部位の効率的な検出が極めて重要です。これらの組み込み部位を検出するには、通常、ゲノムウォーキングツール26を使用します。これらのツールには大きな進歩が見られましたが、次世代シーケンシング(NGS)アプリケーションに最適化され、その後挿入突然変異誘発研究に適用されるものはほとんどありません。細胞株の挿入突然変異誘発は、多くの場合、インバースPCR(I-PCR)や線形増幅媒介PCR(LAM-PCR)などの方法を利用して、組み込み部位を検出します27,28,29。しかし、これらの方法は通常、制限酵素の消化やライゲーションのステップを必要とするため、効率が低下し、結果にバイアスが生じる可能性があります。

フォワードジェネティクススクリーニングにおけるゲノムワイドな組み込み部位の効率的な検出を強化するために、ここではInsertion-based Screen for functional Elements and Transcripts(InSET)法と呼ばれる方法が導入されました。InSETは、ゲノムウォーキングとNGSを統合することにより、レンチウイルスベースの挿入突然変異導入ライブラリにおけるレンチウイルス統合部位のハイスループット同定を可能にします。既存の方法27,28,29と比較すると、InSETは比較的簡単でシンプルで、制限酵素の消化やライゲーションのステップを排除し、より便利でアクセスしやすくなっています。さらに、哺乳類細胞における既存の順遺伝学スクリーニングは、ごく少数の一倍体または一倍体に近い細胞株に限定されていますが27,28,29,30<sup class="xref">31、InSETは異数性細胞株で機能することが証明されています32。

このスタディは、InSETメソッドを実装するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。さらに、挿入突然変異誘発研究におけるInSETの応用を実証しています。InSETは、ヒト細胞株のタンパク質コードRNAとノンコーディングRNAの両方を網羅するゲノム要素内の新規エクソンを同定するための強力なツールとして機能します。

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プロトコル

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図 1 は、InSET メソッドの概略を示しています。最適なカバレッジを得るには、1 μg のゲノム DNA から 5 つのパラレルライブラリーを調製し、それらをプールして次世代シーケンシングを行います。この手順は、以前のテストで継続的に正常に完了していますが、ユーザーは自分の裁量に基づいて一時停止ポイントを導入できます。この研究で使用した試薬と機器の詳細については、資料表をご覧ください。

1. ゲノム中のレンチウイルス組み込み部位の捕捉

  1. 以前の研究32に記載されているように、レンチウイルスベースの挿入突然変異誘発細胞ライブラリーから単離されたゲノムDNAを、1x Taq Buffer、2.5 U Taq DNAポリメラーゼ、4 μLのdNTP混合物(各2.5 mM)、および0.3 μMのビオチン化プライマー3-LTR_prime(表1)を含む50 μL反応液の線形PCRのテンプレートとして使用します。
    注:3-LTR_primeプライマーは、レンチウイルス配列のLTR領域にアニーリングします。それが5' LTRにアニールすると、増幅されたフラグメントには隣接するゲノム配列が含まれます。3' LTRにアニーリングすると、増幅されたフラグメントには内部レンチウイルス配列が含まれていますが、これは宿主ゲノムにアラインメントできないため、ダウンストリームのシーケンシングデータ解析中にフィルタリングされます。このプライマーは、挿入突然変異誘発細胞ライブラリーの生成に使用される他のタイプのベクターに適応するように改変することもできます。
  2. 標準的なPCRサーモサイクラーで50サイクルのリニアPCRを行い、開始時に2.5 UのTaq DNAポリメラーゼを添加し、25サイクル直後に再度添加します。PCR条件は以下の通りです:94°Cで5分間;94 °C で 30 秒、55 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒の 50 サイクル。72 °C で 5 分間
    注:長時間の反応中にTaq DNAポリメラーゼの活性を維持するために、反応の開始点と中間点の両方に酵素を添加することをお勧めします。
  3. PCR産物を新しい清潔な1.5 mL遠心チューブに移します。
  4. PCR産物を10 μLのビオチン-ストレプトアビジン磁気ビーズと十分に混合します。
  5. 金属浴中で400rpmで振とうしながら、室温で2時間インキュベートします><。 注意: チューブを取り出して、15分ごとにピペットとよく混ぜます。
  6. 磁気スタンドを使用してビーズを収集し、上清を慎重に取り除きます。
  7. ビーズを300 μLのBinding/Wash Buffer(10 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 mM of EDTA、1 MのNaCl、0.1% Tween-20)で6回洗浄し、上清を捨てます。
  8. 300 μL (65 °C) DNase/RNaseフリー蒸留水で2回洗浄し、上清を捨てます。
  9. 第2鎖合成では、1x Klenow Fragment Buffer、2 μLのdNTP混合物(各2.5 mM)、および6.25 μMのP5_N6プライマー(表1)を含む24 μLの反応容量にビーズを再懸濁します
    注:プライマーの100 μMストック溶液P5_N6調製します。P5_N6プライマーは、5'末端の固定P5アダプター配列と3'末端のランダムなヘキサマー配列で構成されています。ランダム六量体は、多様な標的配列に結合できるため、リニアPCRで生成されたさまざまなDNA断片の増幅に適しています。
  10. 混合物を15°Cで20分間、PCRサーモサイクラーで事前にインキュベートします。
  11. 2 UのKlenowフラグメント(Large Fragment E.coli DNA Polymerase)を添加します。
  12. 以下の条件でPCRサーモサイクラーで混合物をインキュベートします:0.5 °C/分で15 °Cから25 °Cまでゆっくりとランプし、続いて30分間インキュベーションします。次に、0.5 °C/分でゆっくりとランプして37 °Cまでゆっくりとランプし、続いて1時間のインキュベーションを行います。
  13. PCR産物を新しい清潔な1.5 mL遠心チューブに移します。
  14. 磁気スタンドを使用してビーズを捕捉し、上清を捨てます。
  15. ビーズを300 μLの4 °C DNase/RNaseフリー蒸留水でやさしく洗浄します。ビーズを集めて上清を捨てます。

2. ネストPCRを用いたNGSライブラリの構築

  1. ステップ 1.15 のビーズを、1x Taq Buffer、1.25 U Taq DNA ポリメラーゼ、0.5 μM のプライマー P5 (表 1)、2 μL の dNTP Mixture (各 2.5 mM)、および 0.5 μM のプライマー 3-LTR_Nest (表 1) を含む 25 μL PCR 反応液中に再懸濁します。
  2. PCRサーモサイクラーでPCR反応を以下の条件下で実施します:94 °Cで3分間、94 °Cで30秒間、55 °Cで30秒間、72 °Cで30秒間、72 °Cで7分間
    3. 。
  3. ステップ 2.2 の PCR 産物 5 μL を、1x Taq Buffer、2.5 U Taq DNA ポリメラーゼ、4 μL の dNTP 混合物 (各 2.5 mM)、0.4 μM のプライマー Illumina_P5 (表 1)、0.4 μM のプライマー Illumina_P7-3LTR を含む 50 μL の PCR のテンプレートとして、ステップ 2.2 の PCR 産物 5 μL を次のラウンドの PCR のテンプレートとして使用します。
  4. PCRサーモサイクラーでPCR反応を以下の条件下で実施します:94 °Cで3分間、94 °Cで30秒間、55 °Cで30秒間、72 °Cで30秒間、72 °Cで7分間。
  5. PCR産物を清潔な1.5 mL遠心チューブに移します.
    注:このステップでプロトコールを一時停止し、サンプルを-20°Cで保存できます。
  6. 1.2倍の容量のDNAクリーンビーズを使用してPCR産物を精製し、最終容量を21 μL.
    にします。 注:並行して調製した5つのライブラリのそれぞれから10 μLのPCR産物を取り出し、それらを一緒にプールし、最終容量21 μLまで精製します。PCR産物の精製プロトコルは、DNAクリーンビーズの製造元の指示書から適応されています(材料の表を参照)。
    1. ビーズを2〜8°Cから室温まで30分間平衡化します。
    2. ビーズを反転またはボルテックスして完全に混合します。
    3. 1.2倍の量のビーズを清潔な1.5 mL遠心チューブにピペット
      4. で入れます。
    4. PCR産物をビーズに加え、ピペッティングで10回上下して十分に混合します。
    5. 室温で5分間インキュベートし、DNAがビーズに結合します。
    6. サンプルを磁気スタンドに置き、溶液が透明になったら(約5分間)上清を取り除きます。
    7. 80%エタノール200μLを加えてビーズを洗浄し、室温で30秒間インキュベートし、上清
      注:80%エタノールは新たに調製する必要があります。
    8. 手順 2.6.7 を 1 回繰り返します。
    9. 蓋を開けた状態でビーズを室温で約5分間風乾します。
    10. チューブをマグネットスタンドから取り出し、DNase/RNaseフリー蒸留水22μLを加え、ピペッティングで10回上下させて十分に混合し、室温で2分間放置します。
    11. 溶液が透明になるまで(約2分間)、チューブを磁気スタンドに置き、その後、21μLの上清をきれいな1.5mL遠心チューブに移します><。 注:このステップでプロトコールを一時停止し、サンプルを-20°Cで保存できます。
  7. 1 μL の精製 PCR 産物を使用し、Fluorometer と市販の dsDNA 蛍光検出キット (材料表を参照) を使用して濃度を測定します。
    注:濃度測定プロトコルは、dsDNA検出キットの製造元の指示に従っています。
    1. 試薬とバッファー(キットに付属)を1:200の比率で混合することにより、標準溶液調製物を調製します。
    2. 10 μL の標準試料 #1 と 10 μL の標準試料 #2 (キットに付属) をそれぞれ 190 μL のワーキング溶液と混合して、アッセイ標準試料を調製します。混合物を2〜3秒間穏やかにボルテックスします。
    3. 精製したPCR産物1 μLとワーキング溶液190 μLを混合して、アッセイサンプルを調製します。混合物を2〜3秒間穏やかにボルテックスします。
    4. アッセイスタンダードとアッセイサンプルを室温で2分間インキュベートし、光から保護します。
    5. フルオロメーターをオンにします。
    6. メインメニューからdsDNA高感度プログラムを選択します。
    7. キャリブレーションを行うには、スタンダード#1をマシンに挿入し、Read standardボタンを押して最初のスタンダードを測定し、次にスタンダード#2を挿入してRead standardボタンを押して2番目のスタンダードを測定します。
    8. サンプル測定の場合は、[サンプルの実行]ボタンを押してサンプル測定ページに移動します。アッセイサンプルが入った各チューブを挿入し、Read tubeボタンを押して濃度を求めます
      注:このステップでプロトコールを一時停止し、サンプルを-20°Cで保存できます。
  8. 30 ギガベース (GB) スケールでペアエンド 150 bp (PE150) 戦略を使用して、Illumina プラットフォームで NGS を実行します
    注:このステップは通常、シーケンシング会社にアウトソーシングされます。

3. データ分析

注:このセクションでは、ヒト細胞株での分析を例として使用しました。

  1. レンチウイルス統合サイトのマッピング
    1. fastp tool33 (資料表を参照) を使用して、50% を超える低品質塩基 (Phred スコア <20)、15 'N' 塩基、または 150 塩基未満のシーケンシングリードをフィルタリングします。
    2. LTR タグ "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      で始まる読み取り 2 を持つペアエンド読み取りのみを選択します ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      注:この配列は、挿入突然変異誘発細胞ライブラリの生成に使用されたベクターの配列に依存します。
    3. 手順 3.1.2 で選択したリードから LTR タグ シーケンスをトリミングします。
    4. デフォルト設定のBWA-MEM 34 (Materials の表を参照) を使用して、トリミングされたリードを GRCh37/hg19 に位置合わせします。
    5. 読み取り 1 と読み取り 2 の両方が、FLAG 147 と FLAG 163 で示される正しい構成と間隔でゲノムに一意にマッピングされている読み取りペアのみを保持します。
    6. 挿入位置を、トリムされた読み取り 2 の最初の位置合わせされたベースとして定義します。
    7. 各一意の挿入部位での読み取りカウントを、各サンプルの一意にアラインされた読み取りの合計数に正規化します。
  2. 細胞適応度に影響を与える挿入の同定(IACF)
    注:統計解析では、対照サンプルと処理サンプルの両方の3つの生物学的複製間でペアワイズ比較を行い、有意に濃縮された位置または枯渇した位置を特定することをお勧めします。上記の反復回数は最小限です。結果の信頼性と精度を確保するために、できるだけ多くの反復を実際に使用することをお勧めします。
    1. 各位置の正規化された読み取りカウントを10 個のログ値に変換します。
    2. ゼロ読み取りのポジションのログ10の値を-5に設定します。
    3. 対数10の値に対して両側対応のあるスチューデントのt検定を実行します。
    4. R環境内でBenjamini-Hochberg法を使用して、多重比較のp値を調整します。
    5. False Discovery Rate(FDR)のしきい値が25%のポジションをIACFとして選択します。
  3. 細胞適応度に影響を与えるクラスターの同定 (CACF)
    注:この分析には、コントロールサンプルと処理済みサンプルの3つの生物学的レプリケートが推奨されました。
    1. FDRしきい値が1%のSICER35(材料表を参照)を使用して、コントロールサンプルと処理済みサンプルの間の有意に濃縮または枯渇した挿入クラスターを特定します。SICER解析のコマンドは「sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01」です
      注:上記のコマンドのパラメータの意味は次のとおりです: ["InputDir"] ["処理済みサンプル挿入部位ベッドファイル"] ["制御サンプル挿入部位ベッドファイル"] ["OutputDir"] ["species"] ["冗長性しきい値"] ["ウィンドウサイズ(bp)"] ["フラグメントサイズ"] ["有効ゲノム画分"] ["ギャップサイズ(bp)"] ["E値"]。
    2. BEDTools suite36 (資料の表を参照) の "intersect" 関数を使用して、少なくとも 2 つの生物学的複製によって共有されるクラスター領域を取得し、これらのクラスター領域を CACF として示します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NGSライブラリの品質管理評価は、通常はシーケンシングプロバイダーによって行われ、シーケンシング前の標準的な品質チェックとして機能します。ライブラリの品質の影響を実証するために、2つのサンプルを比較しました。s2-20-15と標識された高品質ライブラリーは、標準的なネストPCRプロトコルを使用して調製され、2つの連続増幅ステップ(最初のステップは20サイクル、次に2番目のステップは15サイクル)で構成されています。対照的に、s1-30と標識された低品質のライブラリーは、Illuminaアダプターを組み込むために30サイクルのシングルステップPCRを使用して調製されました。

表2に示すように、蛍光とqPCRの両方で測定した場合、低品質サンプルは高品質サンプルと比較してライブラリ濃度が低くなっています。特に、qPCR濃度測定は、蛍光測定よりもNGSライブラリの品質を示す信頼性の高い指標です。ライブラリは、バイオアナライザーを使用してさらに分析されました。低品質のサンプルでは、83 bp付近のドミナントピークがアダプターダイマーの汚染を示しています(

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ディスカッション

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フォワード遺伝学解析では、挿入突然変異誘発細胞ライブラリーの組込み部位をプロファイリングするためにゲノムウォーキングが不可欠です。I-PCRやLAM-PCRなどの古典的なゲノムウォーキング法では、制限酵素の消化とライゲーションが必要になることが多く、ライブラリーの複雑さが軽減され、酵素部位依存性によるバイアスが生じる可能性があります27,28,29。InSET法は、制限消化とライゲーションのステップを排除することで、これらの制限を克服します。これは、隣接配列指数アンカーPCR(FLEA-PCR)37に似ていますが、レトロウイルス内部配列の増幅を避けるためにブロッキングオリゴヌクレオチドの使用を省略することによってさらに単純化されています。これらの配列は、代わりにNGSデータ分析中に除去されます。NGSアプリケーション用に設計されたInSETは、挿入変異誘発細胞ライブラリー内の組込み部位の検出に適しています...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. は、中国国家自然科学基金会 (32000441)、中国福建省自然科学基金会 (2023J01130)、華橋大学中央大学基礎研究費 (ZQN-924)、華橋大学科学研究基金 (18BS205) の支援を受けています。P.K. は、中国国家自然科学基金会 (32170619)、国立自然科学大学の国際上級科学者研究基金 (18BS205) の支援を受けています。中国科学財団(32150710525)、および中国福建省自然科学財団(2020J02006)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTAInvitrogenAM9260GTo make Binding/Wash Buffer
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)Invitrogen15568025To make Binding/Wash Buffer
10回;Klenowフラグメントバッファ タカラ2140A
10回;Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659結合/洗浄バッファー
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μm
BEDToolsSoftware, v2
https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ BWA-MEMSoftware, v0.7.12
dNTP MixtureTakara40302.5 mM each
Equalbit dsDNA HS Assay KitVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaSY-412-1001Illumina プラットフォーム、Novogene Corporation (北京) にアウトソーシング
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850 Illumina プラットフォーム、Novogene Corporation (北京) にアウトソーシング
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNAポリメラーゼTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328結合/洗浄バッファーUltraPure
水を作るために Invitrogen10977015
VAHTS DNAクリーンビーズVazymeN411-01
蒸留

参考文献

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