HeLa細胞を用いた抗MDA5自己抗体の検出と光学顕微鏡による免疫細胞化学

一般に筋炎と呼ばれる特発性炎症性ミオパチー (IIM) は、慢性筋肉の炎症、さまざまな臨床症状、および多様な治療結果を特徴とする自己免疫疾患の不均一なグループです。一般的な症状には、筋力低下、持久力の低下、筋肉痛¹ などがあります。IIM の主なサブタイプには、多発性筋炎 (PM) と皮膚筋炎 (DM) が含まれますが、臨床的に筋症性皮膚筋炎 (CADM) は、DM に見られるものと同様の特徴的な皮膚発疹によって区別されますが、筋肉の関与は最小限またはまったくありません。PM、DM、および CADM の主な合併症は間質性肺疾患 (ILD) であり、これは患者の約 40% に影響を及ぼし、死亡率の増加と関連しています²。

IIM における ILD の臨床経過と予後は大きく異なります。DM および CADM (DM-/CADM-ILD) に関連する ILD (DM-/CADM-ILD) は、PM 関連 ILD と比較して治療抵抗性が高く、予後が悪い傾向があります。このうち、^3ヵ月以内に急速に進行する急性または亜急性ILDは特に重症で、5年生存率は52%と報告されているのに対し、進行が遅いか安定した慢性ILDは87%である。急性/亜急性 ILD のサブタイプである急速進行性 ILD (RP-ILD) は、呼吸困難の急速な発症と胸部画像で見える広範な肺胞損傷を特徴とします。RP-ILD は予後不良の生命を脅かす状態であり、患者の転帰を改善するための早期診断と迅速な介入が緊急に必要であることが強調されています ^4,5,6。

筋炎特異的自己抗体 (MSA) は、筋炎関連 ILD の重要なバイオマーカーとして浮上しており、抗 MDA5 自己抗体が特に重要な役割を果たしています。これらの自己抗体は、PM-/DM-/CADM-ILD 患者で頻繁に検出され、RP-ILD ^7,8,9 の重要な予後指標として機能します。MDA5(黒色腫分化関連遺伝子5)は、ウイルスおよびミトコンドリアの二本鎖RNAを検出し、インターフェロンを介した免疫応答を開始するインターフェロン誘導遺伝子によってコードされる細胞質ゾルパターン認識受容体です¹⁰。正確な病原性メカニズムは不明のままですが、抗 MDA5 自己抗体は MDA5 の機能を破壊し、それによって自己免疫の病因に寄与すると考えられています。

抗MDA5自己抗体のタイムリーな検出は、RP-ILDの早期同定と管理に不可欠です。伝統的に、³⁵個のS-メチオニン標識K562細胞抽出物を使用した放射性標識免疫沈降(IP)は、抗MDA5自己抗体を検出するためのゴールドスタンダードと考えられてきました¹¹。しかし、この方法は、コストが高く、特殊な機器と訓練を受けた人員に依存し、放射性廃棄物処理規制が厳格であること、放射性標識試薬の保存期間が限られているため、日常的な臨床使用には実用的ではありません。臨床現場では、ブロットアッセイが代替手段として一般的に採用されています。ただし、これらは抗 MDA5 自己抗体の高い偽陽性率と関連しており^12,13、診断精度に関する懸念が生じています。したがって、陽性結果を検証し、診断の信頼性を向上させるために、信頼性の高い非放射性確認アッセイが緊急に必要とされています。

このギャップに対処するために、抗 MDA5 自己抗体の補助的な確認検査として免疫細胞化学 (ICC) の使用を提案します。このアプローチには、HeLa細胞にMDA5コンストラクトをトランスフェクトし、細胞を患者の血漿でインキュベートし、酵素結合二次抗体(西洋わさびペルオキシダーゼなど)を発色基質と組み合わせて結合した抗MDA5自己抗体を検出して光学顕微鏡下で視覚化することが含まれます。ICCは、細胞コンパートメント内の抗MDA5自己抗体を視覚化するための非放射性、高感度、標準化されたプラットフォームを提供します。この方法は、ICC をブロット アッセイと統合することで、偽陽性率を減らし、診断精度を向上させ、最終的に患者の臨床管理と転帰を向上させることを目的としています。

この研究の目的は、抗 MDA5 自己抗体を検出するための堅牢な非放射性プロトコルを確立し、現在の検出方法の限界に対処し、PM、DM、および CADM 患者の RP-ILD の早期診断のための実用的で信頼性の高いツールを臨床医に提供することです。付随するビデオナレーションでは、この生命を脅かす経過は口語的に「急速な死」と表現されています。科学的には、急速に進行するILD(RP-ILD)に相当します。この研究は既存の証拠に基づいており、臨床現場における予後評価と治療上の意思決定を大幅に改善する可能性があります。

1. 細胞培養とトランスフェクション

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質-抗真菌薬を含むDulbeccoのModified Eagle培地で、加湿された5%CO₂ 雰囲気で37°CでHeLa細胞を維持します。
2. 細胞を2〜3日ごとに、または細胞が90%〜100%のコンフルエントに達したときに継代します。
3. トランスフェクションの24時間前に、24ウェルプレート(1.9 cm² /ウェル)の各ウェルに7細胞×10個4HeLa細胞を播種し、細胞を約90%のコンフルエンシーに到達させます。
4. プラスミド(pENTER-MDA5)500 ngとトランスフェクション試薬1.5 μLをそれぞれ25 μLの還元血清培地で希釈します。
5. 希釈したトランスフェクション試薬に希釈したDNAを加えます(1:1の比率)。よく混ぜて5分間インキュベートします。
6. 混合物を1日前に播種した細胞に加え、攪拌してすぐにDNA-脂質複合体を混合します。細胞が80%〜90%コンフルエントであることを確認します。
7. 細胞を37°Cで加湿した5%CO₂ 雰囲気中で24時間インキュベートし、ICCの実行に進みます。
   注:市販のベクター(pEnter-MDA5)を使用しました。詳細については、 材料表 .トランスフェクション効果は~50%です。
   トランスフェクションの成功と標的タンパク質の発現は、蛍光タンパク質発現プラスミドを細胞にトランスフェクトし、ウェスタンブロットを実施して標的タンパク質の発現を視覚化することによって判断できます。

2.細胞固定

1. インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄して、残りの培地を除去します。
   注意: 洗浄は、オービタルシェーカーでプレートを振ることによって実行できます。
2. PBSの4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。細胞を室温で15分間放置します。
   注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な取り扱いガイドラインを使用してください。
3. 固定試薬を吸引し、PBSを使用して細胞を2回洗浄します。

3. 細胞透過処理

1. Triton X-100試薬(PBS中0.3%)を加え、細胞を室温で10分間放置します。
2. 10分後、洗剤を廃棄します。
3. PBSを加えて細胞を一度洗浄します。

4. 細胞遮断

1. PBS(1x)中の10%ウシ胎児血清でブロッキングを行い、細胞を室温で1時間インキュベートします。
2. ブロッキング試薬を取り出し、PBSを加えて細胞を一度洗浄します。

5. 患者の抗体のハイブリダイゼーション

1. 希釈した患者血漿を細胞に加えます。使用前に必ず患者サンプル(PBSで1:5,000希釈)をPBSで希釈してください。
   注:必要に応じて、希釈を調整して信号を増強したり、バックグラウンドを減らしたりします。公平な結果を保証するために、検査を実施するスタッフは、どのサンプルが患者のもので、どのサンプルが健康な個人からのものであるかを知りませんでした。
2. サンプルを4°Cで12〜16時間(一晩)インキュベートします。
3. インキュベーション期間の後、患者サンプルを除去し、細胞をPBSで3回洗浄します。

6. 二次抗体のハイブリダイゼーション

1. 希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG(PBSで1:250希釈)で細胞を処理し、細胞を室温で1時間放置します。
2. 1時間後、二次抗体を廃棄します。
3. PBS 3xですすいでください。

7.細胞染色

1. 細胞を洗浄した後、300 μLのDABワーキング溶液/ウェルで細胞を染色します。
   注:この溶液は、製造元の指示に従って、DAB発色原濃縮物とDAB希釈液を混合することによって調製されました。
2. 細胞を5分間染色した後、色素を取り除き、脱イオン蒸留水ですすぎ、5分間振とうします。

8. 細胞対比染色

1. 希釈したヘマトキシリンで細胞核を対比染色します。
   注:ヘマトキシリン鰓IIを10倍希釈して使用し、染色プロセスまで5分間待ちます。
2. 5分後、ヘマトキシリンを廃棄し、脱イオン蒸留水で2 x 5分間洗浄します。

9. 観察

1. 光学顕微鏡を使用して染色結果を観察します。
   注:真陽性は、MDA5を発現するHeLa細胞内に強い茶色染色を示します。これにより、患者のサンプル中の抗MDA5自己抗体が確認されます。陰性の結果は、HeLa細胞に茶色染色がなく、抗MDA5自己抗体がないことを示しています。偽陽性の結果は、MDA5発現に関係なく、すべての細胞で広範な褐色染色を示します。他の自己免疫疾患で見られるこの非特異的染色は、誤診を避けるために真陽性と区別する必要があります。

検査を実施する職員は、評価プロセスにおける潜在的なバイアスを最小限に抑えるために、サンプルを採取した特定の患者を含むサンプルの身元を知らされませんでした。ただし、健康な対照サンプルは盲検化を受けませんでしたが、一貫して明確で明白な結果が得られました。

図1A は、pENTER-MDA5コンストラクトをトランスフェクトしたHeLa細胞におけるMDA5の発現の成功を示しています。トランスフェクション効率を検証するために、市販の抗MDA5抗体を使用してICCを実施しました。トランスフェクトされた細胞の約50%で強い褐色の細胞質染色が観察され、MDA5タンパク質の発現が強固であることが示されました。対照的に、同一条件下で処理された非トランスフェクト細胞は細胞質染色を示さず、抗体の特異性と内因性MDA5発現の欠如が確認されました。

ICCプロトコルに続いて、放射性標識免疫沈降によって確認された抗MDA5陽性患者からの代表的なサンプルは、MDA5発現HeLa細胞で透明な茶色の細胞質染色を示しましたが、トランスフェクションされていない細胞は染色されていないままでした(図1B)。この染色パターンは、患者の血漿中に抗 MDA5 自己抗体が存在することを示しており、 35個の S-メチオニン標識 K562 細胞抽出物を使用した確立されたゴールド スタンダード検出と一致しています。

患者の特徴は補 足表 S1 に要約されており、臨床診断、抗 MDA5 抗体の状態、および抗 MDA5 陽性、偽陽性、および健康対照の 3 つのグループへの分類が概説されています。抗体の状態に加えて、 補足表 S1 には、各コホートの年齢、性別、基礎診断などの患者の人口統計も要約されています。抗体反応性は、抗体レベルの増加を反映して、バンド強度に基づいて弱い(1+)、中程度(2+)、または強い(3+)に半定量的に等級付けされました。これは、本研究の主な方法論的焦点を維持しながら、ICC の結果を解釈するための臨床的背景を提供します。研究コホートには、抗MDA5自己抗体が確認された患者10人(陽性群)、市販ブロット検査で偽陽性の結果が得られた自己免疫疾患患者5人(偽陽性群)、および健康な個人10人(健康対照群)が含まれていました。各サンプルは、ポジティブおよびネガティブコントロールと一緒にテストされ、放射性標識免疫沈降を使用して独立して検証されました。明確で決定的な染色結果が得られたサンプルの場合、1回のICCランで十分であると見なされました。染色があいまいまたは境界線上にある場合は、正確な解釈を確保するために、連続希釈や再現 ICC アッセイなどのさらなるテストが実施されました。このアプローチにより、ICC ベースの検出方法のパフォーマンスを検証する際の方法論的厳密さとリソース効率の両方が保証されました。

偽陽性の結果を 図2に示します。これらのサンプルでは、特発性炎症性ミオパチー (IIM) 以外の自己免疫疾患患者の血漿が使用されました。 図1とは異なり、MDA5の発現状態に関係なく、すべての細胞で褐色細胞質染色が広範囲に観察されました。この染色パターンは非特異的結合を示しており、他の自己免疫疾患を持つ患者のサンプルにおける偽陽性の可能性を強調しています。陰性の結果を 図3に示し、健康な個人からの血漿を検査しました。トランスフェクトされたHeLa細胞またはトランスフェクトされていないHeLa細胞では、褐色の細胞質染色は実質的に観察されず、これらのサンプルに抗MDA5自己抗体が存在しないことを示しています。

図1:ICCを用いたMDA5発現の検証と抗MDA5自己抗体の検出。(A)MDA5発現プラスミドをトランスフェクトしたHeLa細胞を、市販の抗MDA5抗体を用いて染色しました。強い褐色の細胞質染色が観察され、強力なMDA5タンパク質の発現が示されました。対照的に、同一条件下で処理された非トランスフェクト細胞は染色を示さず、抗体特異性と内因性MDA5発現の欠如の両方を確認しました。 (B)MDA5をトランスフェクトしたHeLa細胞を、放射性標識免疫沈降により抗MDA5陽性であることが確認された患者の血漿とインキュベートした。透明な細胞質褐色染色が観察され、患者サンプル中に抗 MDA5 自己抗体が存在することが実証されました。スケールバー = 50 μm。略語:ICC =免疫細胞化学。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:IIM以外の自己免疫疾患患者からの血漿を用いた偽陽性シグナルの検出。 トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞の両方で広範な褐色細胞質染色が観察され、非特異的抗体結合が示唆されました。これらの結果は、抗MDA5陽性IIM患者とは無関係の自己免疫疾患患者の血漿を使用する場合、ラインブロットアッセイで偽陽性検出の可能性を示しています。スケールバー = 50 μm。略語:IIM =特発性炎症性ミオパチー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:健康な対照者からの血漿による陰性染色結果。 MDA5をトランスフェクトし、健康な人の血漿とインキュベートしたHeLa細胞は、褐色の細胞質染色をほとんどまたはまったく示さなかった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表 S1: 患者の特徴。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者には宣言すべき競合する利益はありません。

この原稿の一部は、OpenAI の GPT-4 の支援を受けて生成されました。著者は、正確性と独創性を確保するために内容をレビューおよび編集しました。