方法論記事

HeLa細胞を用いた抗MDA5自己抗体の検出と光学顕微鏡による免疫細胞化学

DOI：

10.3791/67575

⸱

2025年10月31日

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1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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抗MDA5を検出するための段階的な免疫細胞化学(ICC)方法論を提供します。このアプローチには、細胞固定、透過処理、抗体インキュベーション、およびイメージング技術が含まれており、抗 MDA5 自己抗体の正確な検出を可能にし、筋炎患者の急速に進行する間質性肺疾患の診断に役立ちます。

要約

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抗 MDA5 自己抗体は、皮膚筋炎 (DM)、筋症性皮膚筋炎 (CADM)、および多発性筋炎 (PM) の重要なバイオマーカーであり、特に急速に進行する間質性肺疾患 (RP-ILD) のリスクがある患者を特定する上で重要です。診断が遅れると予後不良につながることが多いため、これらの自己抗体の早期発見は患者の転帰を改善するために不可欠です。現在、ラジオイムノアッセイは抗 MDA5 を検出するためのゴールド スタンダードですが、その使用は高コスト、長期にわたる手順、専門知識の必要性により制限されています。さらに、広く使用されている臨床ツールであるブロット検査は、MDA5 自己抗体の偽陽性率が高く、診断精度が損なわれる可能性があります。これらの限界に対処するために、免疫細胞化学(ICC)を使用した非放射性、高感度、標準化された確認検査法を提案します。このプロトコルには、HeLa細胞をMDA5コンストラクトで処理し、一次抗MDA5自己抗体の結合を促進するためにTriton X-100で細胞を透過化し、酵素結合二次抗体(西洋わさびペルオキシダーゼなど)と顕微鏡イメージング用のDAB発色原を使用して結合抗体を検出することが含まれます。ICCは、細胞構造内の抗MDA5自己抗体を視覚化するための実用的で費用対効果が高く、高感度のアプローチを提供します。この研究は、ICC を補足的な確認手順として統合することにより、抗 MDA5 検出の信頼性を高め、それによって DM、CADM、および PM 患者における RP-ILD の診断および予後戦略を改善することを目的としています。

概要

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一般に筋炎と呼ばれる特発性炎症性ミオパチー (IIM) は、慢性筋肉の炎症、さまざまな臨床症状、および多様な治療結果を特徴とする自己免疫疾患の不均一なグループです。一般的な症状には、筋力低下、持久力の低下、筋肉痛1 などがあります。IIM の主なサブタイプには、多発性筋炎 (PM) と皮膚筋炎 (DM) が含まれますが、臨床的に筋症性皮膚筋炎 (CADM) は、DM に見られるものと同様の特徴的な皮膚発疹によって区別されますが、筋肉の関与は最小限またはまったくありません。PM、DM、および CADM の主な合併症は間質性肺疾患 (ILD) であり、これは患者の約 40% に影響を及ぼし、死亡率の増加と関連しています2。

IIM における ILD の臨床経過と予後は大きく異なります。DM および CADM (DM-/CADM-ILD) に関連する ILD (DM-/CADM-ILD) は、PM 関連 ILD と比較して治療抵抗性が高く、予後が悪い傾向があります。このうち、3ヵ月以内に急速に進行する急性または亜急性ILDは特に重症で、5年生存率は52%と報告されているのに対し、進行が遅いか安定した慢性ILDは87%である。急性/亜急性 ILD のサブタイプである急速進行性 ILD (RP-ILD) は、呼吸困難の急速な発症と胸部画像で見える広範な肺胞損傷を特徴とします。RP-ILD は予後不良の生命を脅かす状態であり、患者の転帰を改善するための早期診断と迅速な介入が緊急に必要であることが強調されています 4,5,6。

筋炎特異的自己抗体 (MSA) は、筋炎関連 ILD の重要なバイオマーカーとして浮上しており、抗 MDA5 自己抗体が特に重要な役割を果たしています。これらの自己抗体は、PM-/DM-/CADM-ILD 患者で頻繁に検出され、RP-ILD 7,8,9 の重要な予後指標として機能します。MDA5(黒色腫分化関連遺伝子5)は、ウイルスおよびミトコンドリアの二本鎖RNAを検出し、インターフェロンを介した免疫応答を開始するインターフェロン誘導遺伝子によってコードされる細胞質ゾルパターン認識受容体です10。正確な病原性メカニズムは不明のままですが、抗 MDA5 自己抗体は MDA5 の機能を破壊し、それによって自己免疫の病因に寄与すると考えられています。

抗MDA5自己抗体のタイムリーな検出は、RP-ILDの早期同定と管理に不可欠です。伝統的に、35個のS-メチオニン標識K562細胞抽出物を使用した放射性標識免疫沈降(IP)は、抗MDA5自己抗体を検出するためのゴールドスタンダードと考えられてきました11。しかし、この方法は、コストが高く、特殊な機器と訓練を受けた人員に依存し、放射性廃棄物処理規制が厳格であること、放射性標識試薬の保存期間が限られているため、日常的な臨床使用には実用的ではありません。臨床現場では、ブロットアッセイが代替手段として一般的に採用されています。ただし、これらは抗 MDA5 自己抗体の高い偽陽性率と関連しており12,13、診断精度に関する懸念が生じています。したがって、陽性結果を検証し、診断の信頼性を向上させるために、信頼性の高い非放射性確認アッセイが緊急に必要とされています。

このギャップに対処するために、抗 MDA5 自己抗体の補助的な確認検査として免疫細胞化学 (ICC) の使用を提案します。このアプローチには、HeLa細胞にMDA5コンストラクトをトランスフェクトし、細胞を患者の血漿でインキュベートし、酵素結合二次抗体(西洋わさびペルオキシダーゼなど)を発色基質と組み合わせて結合した抗MDA5自己抗体を検出して光学顕微鏡下で視覚化することが含まれます。ICCは、細胞コンパートメント内の抗MDA5自己抗体を視覚化するための非放射性、高感度、標準化されたプラットフォームを提供します。この方法は、ICC をブロット アッセイと統合することで、偽陽性率を減らし、診断精度を向上させ、最終的に患者の臨床管理と転帰を向上させることを目的としています。

この研究の目的は、抗 MDA5 自己抗体を検出するための堅牢な非放射性プロトコルを確立し、現在の検出方法の限界に対処し、PM、DM、および CADM 患者の RP-ILD の早期診断のための実用的で信頼性の高いツールを臨床医に提供することです。付随するビデオナレーションでは、この生命を脅かす経過は口語的に「急速な死」と表現されています。科学的には、急速に進行するILD(RP-ILD)に相当します。この研究は既存の証拠に基づいており、臨床現場における予後評価と治療上の意思決定を大幅に改善する可能性があります。

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プロトコル

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1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質-抗真菌薬を含むDulbeccoのModified Eagle培地で、加湿された5%CO2 雰囲気で37°CでHeLa細胞を維持します。
  2. 細胞を2〜3日ごとに、または細胞が90%〜100%のコンフルエントに達したときに継代します。
  3. トランスフェクションの24時間前に、24ウェルプレート(1.9 cm2 /ウェル)の各ウェルに7細胞×10個4HeLa細胞を播種し、細胞を約90%のコンフルエンシーに到達させます。
  4. プラスミド(pENTER-MDA5)500 ngとトランスフェクション試薬1.5 μLをそれぞれ25 μLの還元血清培地で希釈します。
  5. 希釈したトランスフェクション試薬に希釈したDNAを加えます(1:1の比率)。よく混ぜて5分間インキュベートします。
  6. 混合物を1日前に播種した細胞に加え、攪拌してすぐにDNA-脂質複合体を混合します。細胞が80%〜90%コンフルエントであることを確認します。
  7. 細胞を37°Cで加湿した5%CO2 雰囲気中で24時間インキュベートし、ICCの実行に進みます。
    注:市販のベクター(pEnter-MDA5)を使用しました。詳細については、 材料表 .トランスフェクション効果は~50%です。
    トランスフェクションの成功と標的タンパク質の発現は、蛍光タンパク質発現プラスミドを細胞にトランスフェクトし、ウェスタンブロットを実施して標的タンパク質の発現を視覚化することによって判断できます。

2.細胞固定

  1. インキュベーション後、細胞をPBSで2回洗浄して、残りの培地を除去します。
    注意: 洗浄は、オービタルシェーカーでプレートを振ることによって実行できます。
  2. PBSの4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。細胞を室温で15分間放置します。
    注意:パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な取り扱いガイドラインを使用してください。
  3. 固定試薬を吸引し、PBSを使用して細胞を2回洗浄します。

3. 細胞透過処理

  1. Triton X-100試薬(PBS中0.3%)を加え、細胞を室温で10分間放置します。
  2. 10分後、洗剤を廃棄します。
  3. PBSを加えて細胞を一度洗浄します。

4. 細胞遮断

  1. PBS(1x)中の10%ウシ胎児血清でブロッキングを行い、細胞を室温で1時間インキュベートします。
  2. ブロッキング試薬を取り出し、PBSを加えて細胞を一度洗浄します。

5. 患者の抗体のハイブリダイゼーション

  1. 希釈した患者血漿を細胞に加えます。使用前に必ず患者サンプル(PBSで1:5,000希釈)をPBSで希釈してください。
    注:必要に応じて、希釈を調整して信号を増強したり、バックグラウンドを減らしたりします。公平な結果を保証するために、検査を実施するスタッフは、どのサンプルが患者のもので、どのサンプルが健康な個人からのものであるかを知りませんでした。
  2. サンプルを4°Cで12〜16時間(一晩)インキュベートします。
  3. インキュベーション期間の後、患者サンプルを除去し、細胞をPBSで3回洗浄します。

6. 二次抗体のハイブリダイゼーション

  1. 希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG(PBSで1:250希釈)で細胞を処理し、細胞を室温で1時間放置します。
  2. 1時間後、二次抗体を廃棄します。
  3. PBS 3xですすいでください。

7.細胞染色

  1. 細胞を洗浄した後、300 μLのDABワーキング溶液/ウェルで細胞を染色します。
    注:この溶液は、製造元の指示に従って、DAB発色原濃縮物とDAB希釈液を混合することによって調製されました。
  2. 細胞を5分間染色した後、色素を取り除き、脱イオン蒸留水ですすぎ、5分間振とうします。

8. 細胞対比染色

  1. 希釈したヘマトキシリンで細胞核を対比染色します。
    注:ヘマトキシリン鰓IIを10倍希釈して使用し、染色プロセスまで5分間待ちます。
  2. 5分後、ヘマトキシリンを廃棄し、脱イオン蒸留水で2 x 5分間洗浄します。

9. 観察

  1. 光学顕微鏡を使用して染色結果を観察します。
    注:真陽性は、MDA5を発現するHeLa細胞内に強い茶色染色を示します。これにより、患者のサンプル中の抗MDA5自己抗体が確認されます。陰性の結果は、HeLa細胞に茶色染色がなく、抗MDA5自己抗体がないことを示しています。偽陽性の結果は、MDA5発現に関係なく、すべての細胞で広範な褐色染色を示します。他の自己免疫疾患で見られるこの非特異的染色は、誤診を避けるために真陽性と区別する必要があります。

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結果

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検査を実施する職員は、評価プロセスにおける潜在的なバイアスを最小限に抑えるために、サンプルを採取した特定の患者を含むサンプルの身元を知らされませんでした。ただし、健康な対照サンプルは盲検化を受けませんでしたが、一貫して明確で明白な結果が得られました。

図1A は、pENTER-MDA5コンストラクトをトランスフェクトしたHeLa細胞におけるMDA5の発現の成功を示しています。トランスフェクション効率を検証するために、市販の抗MDA5抗体を使用してICCを実施しました。トランスフェクトされた細胞の約50%で強い褐色の細胞質染色が観察され、MDA5タンパク質の発現が強固であることが示されました。対照的に、同一条件下で処理された非トランスフェクト細胞は細胞質染色を示さず、抗体の特異性と内因性MDA5発現の欠如が確認されました。

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ディスカッション

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抗MDA5自己抗体を同定するための当社のICCベースの技術は、ラインブロット分析やラジオイムノアッセイなどの従来の方法に比べて大きな利点を提供します。以前、Nombel et al. 抗 MDA5 陽性皮膚筋炎患者 23 名と抗 MDA5 陰性対照 22 名のコホートで、MDA5 トランスフェクト細胞の間接免疫蛍光 (IIF) を ELISA と比較することにより、それぞれ 96% と 100% の感度と特異度の値を報告しました14。ただし、このELISAは市販されておらず、研究用のみを目的としています。これらの発見に基づいて、私たちの研究は、ICC ベースの検出プロトコルの開発とデモンストレーションに焦点を当てています。ラジオイムノアッセイとは異なり、当社のICCアプローチは非放射性であるため、より安全で環境に優しいものになっています。これらの利点に加えて、ICC プロトコルは放射性標識アッセイと比較して所要時間も短縮するため、サンプル処理の効率が向上し、より迅速な臨床上の意思決定が可能になります。これらの特徴により、当...

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開示事項

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著者には宣言すべき競合する利益はありません。

この原稿の一部は、OpenAI の GPT-4 の支援を受けて生成されました。著者は、正確性と独創性を確保するために内容をレビューおよび編集しました。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、Jye-Lin Hsu に授与された台湾国家科学技術委員会からの助成金によって支援されました (NSTC 114-2320-B-039-038 および NSTC 113-2320-B-039-032)。この研究は、Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 および C1110812016-12) に授与された中国医科大学および病院の助成金によっても部分的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
24ウェルプレート(1.9 cm²/well)コーニング354541
抗生物質-抗菌薬ギブコ15240062
ビーカーパイレックス1000-600
円錐形チューブ(15 mL)コーニング430052
円錐形チューブ(50 mL)コーニング430290
脱イオン蒸留水当社の脱イオン蒸留水は、Milli-Qシステム(第1列:Quantum TEX、SN:F4EB53476;第2列:プレパック、SN:F1CB11442)
胎児用牛血清の特徴付けシチバSH30396.03
目盛りシリンダー(50 mL)VITLAB64804
ヘマトキシリン・ギルIIライカ3801522
ハイクロン・ダルベッコ高グルコースの改良イーグルミディアムシチバSH30243.02
リポフェクタミン2000型トランスフェクション試薬インビトロジェン11668019トランスフェクション試薬
MDA-5(D74E4)ウサギmAb細胞シグナル伝達技術5321
マイクロ遠心分離機チューブ(1.5 mLエッペンドルフチューブ)アクシジェン142503
Opti-MEM I 還元血清培地ギブコ31985070
オービタルシェーカー(オプション)ファーステックS300R
パラホルムアルデヒドシグマ・オルドリッチ1倍PBSで4%
PBSプロテックME222605
pENTER-MDA5ヴィジーン・バイオサイエンス社CH863586
ペルオキシダーゼ アフィニピュア ヤギ抗ヒト IgG(H+L)ジャクソン免疫研究109-035-003
ピペットコントローラーサーモ・サイエンティフィック130165
ピペッテス ギルソン
ピペットおよびピペットチップ(10 & micro;L)QSP104-Q
ピペットおよびピペットチップ(200 & micro;L)QSPT090-Q
ピペットおよびピペットチップ(1000 & micro;L)QSP111-Q
血清学的ピペット(5 mL)SPL91005
血清学的ピペット(10 mL)SPL91010
血清学的ピペット(25 mL)SPL91025
SignalStainのDAB基板キット細胞シグナル伝達8059PBSでの0.3%

参考文献

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  1. Mehta, P., Machado, P. M., Gupta, L. Understanding and managing anti-MDA5 dermatomyositis, including potential COVID-19 mimicry. Rheumatol Int. 41 (6), 1021-1036 (2021).
  2. Tansley, S. L., McHugh, N. J., Wedderburn, L. R. Adult and juvenile dermatomyositis: are the distinct clinical features explained by our current understanding of serological subgroups and pathogenic mechanisms. Arthritis Res Ther. 15 (2), 211(2013).
  3. Fujisawa, T. Management of myositis-associated interstitial lung disease. Medicina. 57 (4), 347(2021).
  4. Sasaki, N., et al. Early initiation of plasma exchange therapy for a patient with anti-MDA5 autoantibody-positive dermatomyositis developing rapidly progressive interstitial lung disease. Mod Rheumatol Case Rep. 5 (1), 87-92 (2021).
  5. Go, D. J., et al. Survival benefit associated with early cyclosporine treatment for dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Rheumatol Int. 36 (2), 125-132 (2015).
  6. Tsuji, H., et al. Multicenter prospective study of the efficacy and safety of combined immunosuppressive therapy with high-dose glucocorticoid, tacrolimus, and cyclophosphamide in interstitial lung diseases accompanied by anti-melanoma differentiation-associated gene 5-positive dermatomyositis. Arthritis Rheumatol. 72 (3), 488-498 (2020).
  7. Hozumi, H., et al. Comprehensive assessment of myositis-specific autoantibodies in polymyositis/dermatomyositis-associated interstitial lung disease. Respir Med. 122, 1-8 (2016).
  8. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  9. Koga, T., et al. The diagnostic utility of anti-melanoma differentiation-associated gene 5 antibody testing for predicting the prognosis of Japanese patients with DM. Rheumatology. 51 (7), 1278-1284 (2012).
  10. Fuzzi, E., et al. Anti-MDA5 dermatomyositis: an update from bench to bedside. Curr Opin Rheumatol. 34 (6), 365-373 (2022).
  11. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  12. Tansley, S. L., Diederichsen, L. P., Zampeli, V. A., McHugh, N. J. The reliability of immunoassays to detect autoantibodies in patients with myositis is dependent on autoantibody specificity. Rheumatology. 59 (5), 1029-1034 (2020).
  13. Chen, Y. L., Li, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (3), 345-350 (2024).
  14. Nombel, A., Pin, J. J., Fabien, N., Miossec, P., Coutant, F. Evaluation of the performance of an indirect immunofluorescence assay for the detection of anti-MDA5 antibodies. Biomedicines. 10 (12), 3125(2022).
  15. Nakashima, R., Hosono, Y., Mimori, T. Clinical significance and new detection system of autoantibodies in myositis with interstitial lung disease. Lupus. 25 (8), 925-933 (2016).
  16. Sato, S., et al. Autoantibodies to a 140-kd polypeptide, CADM-140, in Japanese patients with clinically amyopathic dermatomyositis. Arthritis Rheum. 52 (5), 1571-1576 (2005).
  17. Chang, Y. C., Yang, L., Budhram, A. Positive predictive value of myositis antibody line blot testing in patients with suspected idiopathic inflammatory myopathy. Muscle Nerve. 69 (5), 626-630 (2024).

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