方法論記事

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

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DOI:

10.3791/67598

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2024年11月29日

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

この記事について

サマリー

ここでは、エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドの急性遺伝子操作について紹介します。これらの皮質オルガノイドモデルは、スライス後に心室のような構造を容易に特定できるため、特に注射に適しており、ヒトの皮質発達、神経発達障害、および皮質進化の機能的研究を可能にします。

要約

ヒト皮質オルガノイドは、ヒトの脳の発達、神経発達障害、およびヒトの脳の進化を研究するための重要なツールとなっています。過剰発現またはノックアウトによる遺伝子機能の解析は、新皮質発生の調節に関するメカニズムの洞察を提供する動物モデルに役立っています。ここでは、スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションによるCRISPR/Cas9を介した急性遺伝子ノックアウトの詳細なプロトコールを紹介します。皮質オルガノイドのスライスは、注射およびその後のエレクトロポレーションのための心室様構造の同定に役立ち、これをヒト皮質発生中の急性遺伝子操作に特に適したモデルにします。ガイドRNAの設計と、 in vitro および皮質オルガノイドにおけるターゲティング効率の検証について説明します。皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、神経原性中期に行われ、頂端橈骨グリア、基底前駆細胞、ニューロンなど、発生中の新皮質のほとんどの主要な細胞クラスを標的化することができます。まとめると、スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、皮質発生中の遺伝子機能、遺伝子調節、および細胞形態を調査するための強力な技術を表しています。

概要

新皮質とは、大脳半球の外側を覆うものを指し、哺乳類に特有の構造です。新皮質は、高次認知機能の座を表しています1,2,3,4,5。発生中、神経幹細胞と前駆細胞は、ニューロン新生と呼ばれるプロセスでニューロンを生じさせます。ヒト新皮質の発達を研究する機能的研究は、ヒト神経幹細胞の調節、神経病理、およびヒトの脳進化の根底にあるメカニズムを解明するための基礎を提供します2,6,7。

歴史的に、ヒトの脳の発達に関する研究は、死後組織を用いた記述的な組織学的アプローチに依存しており、最近では、ヒト胎児組織を用いた機能的研究を可能にするフリーフローティング組織培養システムを用いている8,9。さらに、ヒト胎児の脳組織は、長期拡大オルガノイドに自己組織化する能力を持っていることが示されました10。胎児組織研究は、ヒトの発達11,12に関する重要な洞察を提供してきたが、組織の入手可能性や倫理的配慮が限られているにもかかわらず、ヒトの脳発達の機構研究への広範な応用は限られている。過去10年間で、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から三次元神経オルガノイドの生成を可能にするプロトコルが開発されてきた、これにはヒト人工PSC(hiPSC)13,14が含まれる。

脳オルガノイドは、心室様構造の形成、頂端基底極性、皮質細胞構造、放射状グリア分裂中の運動間核移動、ニューロン移動など、発達中の脳の重要な特徴を示します。重要なことに、これらの新しいヒトオルガノイドモデルは、マウスではうまくモデル化されていないヒトの発達中の脳の特徴を再現しており、これには進化的に関連する主要な神経前駆細胞タイプ、特に基底放射状グリア(または外側放射状グリア)が含まれます7,14,15。初期の脳オルガノイドプロトコルのいくつかの限界 - オルガノイドの不均一性の問題、内部コアへの限られた栄養素供給、および多様な地域アイデンティティの問題など - は、最近のプロトコルの進歩で対処されており、今後数年間でさらなる改善が期待できます15,16,17,18,19。ヒトの脳オルガノイドと皮質オルガノイドは、ヒトの皮質発達20、神経障害21,22,23,24、脳の進化25,26,27,28,29を研究し、大規模なスクリーニングアプローチ30,31,32を実行するための重要なモデルとなった。

急性遺伝子操作については、主に新皮質発生の動物モデルにおいて、標的細胞の感染によるウイルス送達33と子宮内またはin vitroエレクトロポレーション34,35の2つの方法が用いられてきた。DNA(そして最近ではCRISPR/Cas9リボ核タンパク質(RNP)複合体36)を側脳室に注入し、続いてエレクトロポレーションを行うと、エレクトロポレーション電極の向きに基づいて脳の特定の領域を標的にできるという利点があります。エレクトロポレーションには、細胞膜の透過性を一時的に増加させる短い電気パルスが含まれ、DNAやその他の荷電分子を細胞に導入することができます。子宮内エレクトロポレーションは、マウス37で最初に行われ、急速に発生神経生物学の方法論として広く応用されました。その後、この方法は、ラット38,39やフェレット40,41,42、新皮質の拡張と皮質の折り畳みを研究するために使用される回脳種3,43,44,45などの他の種にも適用されました。

エレクトロポレーションは、ヒトの脳オルガノイド研究においても重要な方法となっている46。脳オルガノイドでは、エレクトロポレーションは、細胞形態およびニューロン軸索の可視化14,47、遺伝子ノックダウン試薬の送達22,48,49、および過剰発現による遺伝子機能の研究50に適用されている。この方法はヒトモデルに限定されず、霊長類の脳オルガノイド50,51の遺伝子改変にも適用されている。さらに、スピンΩスピニングバイオリアクターで生成された皮質オルガノイドのエレクトロポレーションが記載されている52。

このプロトコルでは、皮質発達における遺伝子機能の研究のために、スライスされたヒト皮質オルガノイド15のエレクトロポレーションを概説します。脳領域特異的オルガノイドは、疾患モデリングなどの定量分析を成功させるために重要な再現性と一貫性を向上させます。スライスされたヒト皮質オルガノイドプロトコル15では、強力なパターニング手がかりがiPS細胞分化中に適用され、背側前脳前駆細胞の均質な集団が得られ、その後、より少ない指示シグナル53,54で組織成長を促進する培養培地の適用が続く。皮質オルガノイドのスライスは、オルガノイドコア15の栄養素と酸素の利用可能性の低下に起因する細胞死を減少させることが示されています。さらに、スライシングは、豊富な基底橈骨グリアを含む心室様構造の発達をサポートし、持続的な神経新生により、拡張された皮質板状領域の形成につながる15。また、このプロトコールではスライスを繰り返すことで、これらの皮質オルガノイドはエレクトロポレーションに特に適したものとなり、心室内腔を容易に同定し、注射によって標的とすることができます。スライスした皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、遺伝子調節領域と皮質進化の研究に適用されています26,55。

エレクトロポレーション手順では、注入混合物が心室様構造の内腔に送達されます。パルス電界が印加されると、混合物は心室を覆う頂端橈骨グリアによって取り込まれます。頂端橈骨グリアが分裂し、より献身的な細胞型4を生じさせると、エレクトロポレーションされた薬剤は基底前駆細胞およびニューロンに伝達されます。エレクトロポレーションされた子孫は、3日後に心室ゾーン(VZ)および心室下ゾーン(SVZ)に分布し、エレクトロポレーション後7日で中期神経原性ステージ26,55の皮質プレート(CP)様領域を含む皮質壁の大部分に分布します。

ここでは、スライスしたヒト皮質オルガノイド26におけるエレクトロポレーションによるCRISPR/Cas9を介した遺伝子破壊56について説明する。さらに、エレクトロポレーション法は、遺伝子の過剰発現、蛍光タンパク質の発現による細胞形態および細胞プロセスの可視化、Massive Parallel Reporter Assays(MPRA)のためのプラスミドライブラリーの送達、エピゲノム編集ツールの送達、およびライブイメージングのための細胞の標識にも適用できます。

プロトコル

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むすべての実験は、1964年のヘルシンキ宣言に概説された倫理基準に従って実施され、ドレスデン大学病院倫理審査委員会(IRB00001473;IORG0001076;倫理承認番号 SR-EK-456092021)。

1. 急性CRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトのためのガイドRNAの設計

  1. ソフトウェアやオンラインツールを使用して、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)間の距離が理想的には7〜11 bp(3 bpの倍数を避ける)で同じエクソンを標的とするガイドRNA(gRNA)のペアを設計し、タンパク質破壊の可能性を高めます。
    注:理想的には、機能ドメインをコードするエクソンを標的とすべきです。あるいは、転写産物の最初のエクソンを選択することもできます(図1A)。ガイドRNAは、活性スコア(1に近い)57 および特異度スコア(100%に近い)58に基づいて選択します。

2. ヒト人工多能性幹細胞の培養

  1. ヒト皮質オルガノイドを作製し、gRNAの機能を検証するには、健康なドナーに由来するhiPSC系統CRTDi004-A59 を使用します。
  2. 標準条件(37°C、5%CO2)で幹細胞培地中の基底膜マトリックス被覆6ウェルプレート上で、前述の60のiPS細胞を培養する。誘導されたPSCは、最初の24時間にROCK経路阻害剤(1:1,000)を補給して、単一細胞解離用の酵素を使用して80%の密度で継代する必要があります。
    注:オルガノイドの生成やgRNAの検証には、他のiPS細胞株を使用することもできます。

3. ヒト人工多能性幹細胞からのゲノムDNAの抽出

  1. ゲノムDNA抽出には、6ウェルプレートの80%-90%コンフルエントhiPSCの2ウェルを使用します。プレートから細胞を酵素で解離して、単一細胞懸濁液を作ります。幹細胞培地1mL(総容量)に細胞を取り込み、600 x g で10分間遠心し、上清を除去します。
  2. 細胞ペレットを250 μLの溶解バッファー(50 mM TrisHCl(pH 7.5)、100 mM NaCl、0.5 % SDS、5 mM EDTA、H2O)および12.5 μLのプロテイナーゼK(10 mg/mLストック)に再懸濁します。55°C、250rpmで2時間インキュベートします。
  3. 100 μL の 5 mM NaCl を混合します。18,000 x g 、4°Cで10分間遠心し、上清を新しい1.5 mL反応チューブに移します。
  4. 250 μLのイソプロパノールを加え、チューブを数回反転させ、18,000 x g 、4°Cで15分間撹拌します。
  5. 上清を取り除き、500 μLの70 % EtOH(分子生物学グレード)で洗浄し、チューブを反転させ、4°Cで18,000 x g で10分間遠心します。
  6. 最後に、上清を慎重にピペッティングし、開いた反応チューブをペーパータオルで押して、上清を完全に取り除きます。
  7. ペレットを室温で10分間自然乾燥させた後、ペレットを100μLのヌクレアーゼフリー水に37°Cで30分間溶解します。
  8. 分光器でDNAの濃度を測定します。単離されたゲノムDNAは、-20°Cで数ヶ月間安定です。

4. gRNA(in vitro)によるテンプレート認識の検証

注:gRNAによる成功したテンプレート認識を検証するための最初のアプローチとして、二本鎖DNAがアガロースゲル電気泳動40,61,62によって区別できる2つのフラグメントに切断されるin vitro Cas9反応を実行する。

  1. テンプレートを生成するには、hiPSCから単離されたゲノムDNAに対して、ハイフィデリティPCRマスターミックスと10 μMプライマー(セクション3)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行い、98 °Cで30秒、40サイクルで初期変性[98 °C、10秒、60°C、30秒、72°C、1分]、72 °Cで5分間の最終伸長を行います。
    1. PCRプライマーに従ってアニーリング温度を調整します。アンプリコンのサイズが800 bpから1.5 kbで、gRNA結合部位の非対称な局在性があることを確認します。
    2. 1.5%アガロースゲル上でゲル電気泳動することによりPCR産物を分離し、ゲルから対応するバンドを切断し、DNA26を抽出する。
    3. 抽出したPCR産物のDNA濃度を分光器で測定します。
  2. 10 μM の CRISPR RNA (crRNA、カスタム配列、100 μM ストック) と 10 μM tracrRNA (100 μM ストック) をヌクレアーゼフリー二重バッファー (総容量 5 μL ) に組み合わせて、機能 gRNA をアセンブルします。混合物を95°Cで5分間インキュベートし、室温(RT)まで冷まします。
  3. ステップ 4.2 の 10 μM の gRNA と 1 μM の Cas9 酵素 ( Streptococcus pyogenes 由来、62 μM ストック) を PBS 中で RT で 15 分間 (総容量 25 μL ) 組み合わせて、リボ核タンパク質 (RNP) 複合体を作成します。
  4. in vitro消化反応を行うには、1 μMのRNP複合体(ステップ4.3)を0.1 μM DNAテンプレート(ステップ4.1のPCR産物)および1x Cas9ヌクレアーゼ反応バッファー(200 mM HEPES、1 M NaCl、50 mM MgCl2、1 mM EDTAを含む、pH 6.5、-20°Cでアリコートに保存可能)と混合します。
    1. 最終容量10μLまでヌクレアーゼフリーの水で満たします。
    2. 反応液を37°Cで1時間インキュベートします。
    3. 2 mg/mLのプロテイナーゼKを添加し、さらに56°Cで10分間インキュベートして、Cas9酵素からDNA基質を遊離させます。消化した反応ミックスを最終分析まで4°Cまたは-20°Cで保存します。
      注:最高の切断効率を得るためには、10:1モル比のCas9-RNP:DNA基質を使用することが推奨されます。必要に応じて、PCR産物をヌクレアーゼフリー水で必要な濃度に希釈します。ネガティブコントロールとして、gRNAまたはCas9酵素のいずれかを欠く反応混合物を一緒に摂取することができます。
  5. 2%アガロースゲル上でのアガロースゲル電気泳動により、切断された生成物を可視化します。
    注:理想的には、2つの異なるサイズのバンドが見え、テンプレートバンドが消えているか、効率的にgRNAを減少させる必要があります(図1B)。

5. ヒト人工多能性幹細胞におけるgRNA機能の検証

注:皮質オルガノイドが生成されるのと同じ細胞株を標的とするgRNAの効率をテストすることが推奨される26。このために、関連するgRNAを含むRNP複合体をGFP発現プラスミドとhiPS細胞に同時トランスフェクトし、細胞を3日間培養し、その後、ゲノムDNAをシーケンシング解析のために単離します。1回のgRNA検査には、約200,000個の細胞が必要です。細胞は70%〜80%を超えてコンフルエントであってはならず、解凍後に少なくとも2回継代されている必要があります。ネガティブコントロール(gLACZ)36,63と模擬条件(RNPなしのヌクレオフェクション溶液)を併用することが重要です。

  1. 実験の2時間前にhiPSCの培地をROCK阻害剤(1:1,000)を含むように変更して、細胞培養フード内の細胞の生存率を高めます。
  2. 6ウェルプレートの適切な数のウェルを基底膜マトリックスでコーティングします。
  3. ヌクレオフェクターユニット(16ウェルストリップの場合は「Xユニット」)を起動し、事前にプログラムされたプログラム「 ES細胞、H9」(パルスCB150)を選択します。ストリップの適切な数のウェルを選択します。
  4. Duplex Bufferで24 μM crRNAと24 μM tracrRNAを組み合わせてRNP複合体を調製します。
    1. 95°Cで5分間インキュベートし、ステップ4.2で説明したように室温まで冷まします。
    2. その間に、Cas9酵素をPBSで8μMに希釈します。
    3. 3 μL の gRNA と 3 μL の Cas9 を組み合わせ、室温で 15 分間インキュベートして RNP を組み立てます。
      注:モル比が3:1 gRNA:Cas9の場合、最適な切断効率が得られます。gRNAをペアとして試験するには、各RNPを別々に調製し、最後に各RNPを1.5μL組み合わせます。
  5. 15分間のRNPインキュベーション中に、細胞培養フードの下で核形成のためにhiPSCを調製します。
    1. 基底膜コーティングを、ROCK阻害剤(1:1,000)と1ウェルあたり1xペニシリン/ストレプトマイシンを添加した幹細胞培地1.5 mLと交換します。
    2. ヌクレオフェクション溶液をマスターミックスとして氷上に調製し、製造元の指示に従ってください。
    3. プレートからhiPSCを剥離して単一細胞懸濁液を作製し(セクション2で説明)、ノイバウアー計数チャンバーでトリパンブルー染色して細胞を計数します。
    4. gRNAペアあたり200,000個の生細胞を600 x g で5分間ペレット化します。
  6. 細胞培養フードで、氷上で3 μLのRNPを20 μLのヌクレオフェクション溶液に加え、0.2 μg/μL pCAG-GFPプラスミドを加えます。
  7. ペレット化した細胞を最終ヌクレオフェクションミックスの23 μLに再懸濁し、氷上の16ウェルヌクレオフェクションストリップの1ウェルに移します。
  8. すべての条件がストリップに入ったら、フードの外側にあるヌクレオフェクターマシンXユニットにストリップを置き、 スタート ボタンを押してヌクレオフェクションを開始します。
  9. その後、ヌクレオフェクションストリップを細胞培養フードの下に戻し、プレートから何らかの培地でストリップウェルを洗い流すことにより、ヌクレオフェクションした細胞を調製した6ウェルプレートに移します。
  10. hiPSCを3日間培養し、1xペニシリン/ストレプトマイシンを含む培地を毎日交換します。24時間後、ROCK阻害剤は不要になります。
  11. 従来の蛍光顕微鏡でGFPシグナルを確認します(図1C)。
    1. 3日目に、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によりGFP陽性細胞を選別し、回収します。
    2. PBS中の2% FBSを含むソーティングバッファーを調製し、4°Cに保ちます。
    3. 卓上型遠心分離機を4°Cに冷却します。 氷上でのFACS後の細胞の収集用に、ROCK阻害剤(1:1,000)を含む50 μLのソーティングバッファーを含む1.5 mLの反応チューブと、氷上で細胞ストレーナーキャップ付きの5 mLポリスチレン丸底チューブを調製します。
    4. 核球形成細胞の単一細胞懸濁液を作製します。
    5. ROCK阻害剤(1:1,000)を含む幹細胞培地1 mLに細胞を再懸濁し、600 x g で5分間遠心分離します。
    6. 上清を除去し、ROCK阻害剤(1:1,000)を含むソーティングバッファー200 μLに細胞を再懸濁し、0.4 μLのDAPI(2 ng/μL)を添加して、FACSで生細胞を同定します。
    7. 冷却した丸底チューブのセルストレーナーキャップを通して細胞溶液をピペットで動かし、残留した細胞塊を取り除きます。
      注:DAPIは時間の経過とともに細胞の生存率を低下させる可能性があるため、ソーティングする前に各サンプルに新鮮なものを加えるのが最善です。
    8. 10,000個のGFP陽性生細胞(DAPI陰性細胞)を、ROCK阻害剤を含む50 μLのソーティングバッファー(氷上)で、あらかじめ調製した1.5 mLの反応チューブにソーティングします。
  12. FACS後、選別した細胞から直接ゲノムDNAを抽出します。
    1. ソーティングバッファー内の収集およびソーティングされたセルを600 x g で10分間スピンダウンします。
    2. 上清を取り除き、サンプルあたり250 μLの溶解バッファーと12.5 μLのプロテイナーゼKに細胞ペレットを取り込みます。
    3. セクション 3 の説明に従って続行します。
    4. 最後に、DNAペレットを50μLのヌクレアーゼフリー水に溶解します。
  13. PCRを実行して、ステップ4.1で説明したようにサンガーシーケンシングのテンプレートを生成します。コントロールとして、gLACZ 条件のDNAと目的の遺伝子を標的とするプライマー(セクション4で使用したものと同じプライマー)を使用します。アガロースゲル電気泳動から適切なバンドを抽出し、カラム上で精製して、サンガーシーケンシングに送ってください。
  14. サンガーシーケンシングの結果をペアワイズのグローバルアラインメントを使用してアラインメントします。
    注:成功したターゲティングは、gRNA結合部位の周囲のランダムな挿入/欠失に起因するシグナルまたは不完全な配列によって識別できます(図1D)。

6. スライスしたヒト皮質オルガノイドの作製

注:ヒト皮質オルガノイド(hCO)は、以前に詳細15,60で説明したように、スライスされた新皮質オルガノイド(SNO)法に従って生成されます。

  1. 1 mg/mLコラゲナーゼを含む6ウェルプレートの1ウェルから小さなhiPSCコロニーを分離し、インキュベーター内で37°Cで30〜40分間インキュベートします。その間に、新しい6ウェルプレートを基底膜マトリックスでコーティングします。
    1. 1 mLの幹細胞培地で酵素を停止し、15 mLのコニカルチューブ内の5 mLの幹細胞培地に幅広の先端でコロニーを回収します。
      注:「ワイドボアピペットチップ」と記載されている手順は、チップを直径2mm以上の開口部にカットして実行することもできます。
    2. コロニーが底に落ち着いたら、古い培地を取り除き、新しい幹細胞培地と交換します。
    3. ワイドボアチップを使用して、コーティングされた6ウェルプレート上にコロニーを均等に分散させ、ウェルあたり1.5 mLの幹細胞培地を充填します。
    4. 標準的な条件下でhiPSCを2〜3日間培養します。
  2. hiPSCコロニーの直径が約1.5 mmに達したら、37°Cで最大1時間インキュベートすることにより、1 mg/mLコラゲナーゼですべてのコロニーを再度剥離します。
    1. 6 mLの前脳培地11 15 で酵素を停止し、幅広の先端を使用して15 mLの円錐管に分離したコロニーを収集します。
    2. コロニーが落ち着いたら、古い培地を取り出し、5mLの前脳培地1で洗浄します。
    3. 最後に、コロニーをウェルあたり3 mLの前脳培地1を含む超低接着6ウェルプレートに移し、先端が広いウェルで胚様体(EB)を形成します。このステップは、ヒト皮質オルガノイドプロトコルの0日目を示します。ここからは、公開された15のプロトコルに従ってください。
  3. 7日目に、EBを基底膜マトリックスに埋め込み、「クッキー」あたり約20のEBを埋め込み、前脳培地2 15で1週間培養します。14日目に、マトリックスからオルガノイドを機械的に放出し、120rpmのオービタルシェーカー上の前脳培地315 の6ウェル超低付着プレートで培養を続けます。
  4. 35日目から、1% v/v基底膜マトリックスを培地に添加します。
  5. 6週目に、オルガノイドを3%低融点アガロースに埋め込み、ビブラトームで厚さ500μmのスライスにカットします(図2A、B)、オルガノイド全体の酸素と栄養素の供給をサポートします。必要に応じて、オルガノイドのスライスを4週間ごとに繰り返します。
  6. 70日目から、前脳培地でオルガノイドを培養 415.

7. スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

注:ヒト皮質オルガノイドは、心室様構造が見えたらすぐに、およそ2週目以降に注入およびエレクトロポレーションできます。後期オルガノイド(5週目以降)の場合、オルガノイドのスライス26,55の2日後に手順が実行されるときに、エレクトロポレーションが最も効率的であり、細胞の生存率が最高になります。スライス後、心室のような構造を簡単に識別できるため、注入手順に役立ちます(図2C、D)。さらに、心室様構造はスライス後もしばらくの間部分的に開いたままであり、過剰な注入液を逃がすことを可能にし、心室の内側を覆う接着性ジャンクションベルトの完全性を保護します。スライススケジュールは、実験のタイムラインに合わせてシフトできます。スライスは、長期培養のために3〜4週間ごとに繰り返す必要があります。

  1. 次の設定で、マイクロキャピラリープーラーで注射用のホウケイ酸ガラスキャピラリーを引っ張ります:P 500、熱600、プル30、速度40、時間1。毛細血管をテープで固定する大きなシャーレに保管します。
  2. エレクトロポレーションの日に、ステップ 5.4 で説明したように、最終濃度 24 μM RNP の CRISPRR/Cas9 RNP 複合体を新たに調製します。0.1 μg/μL pCAG-GFPプラスミド(または他の蛍光レポーター)の共エレクトロポレーションは、エレクトロポレーション細胞の同定をサポートします。さらに、0.1% Fast Green水溶液を最終注入ミックスに加えることで、ミックスの正常な送達を確認できます。
    注:目的の遺伝子とgLACZ コントロールごとに別々のミックスを作成します。
  3. Tyrode溶液(1パックのTyrode塩、1 gのNaHCO3、1 LのdH2Oに1 mLの1 M HEPES pH 7.25)を37°Cに予温します。 残りのTyrode溶液を4°Cで数ヶ月間保存します。
  4. 十分に発達した心室様構造を持つhCOを選択し(図2E)、心室様構造を示さないオルガノイドは廃棄します(図2F)。最大10個のオルガノイドをTyrode溶液が入った6cmのシャーレに移し、残りのhCOをインキュベーターに保管します。
  5. マイクロローダーのピペットチップを使用してガラスマイクロキャピラリーに10μLの注入溶液を充填し、ピンセットで細い端をつまんでキャピラリーを開きます。キャピラリーが開いているかどうかを確認するには、Tyrodeの溶液に注入混合物を放出します。マイクロインジェクターを使用して、フットスイッチによる制御されたゲートを備えた連続的な設定で注射を行います。
  6. キャピラリーを心室様構造の中心に挿入し(図2C)、フットスイッチを押して0.2〜0.5μLの混合物を注入します。
    注:hCOごとに最大5つの心室を注入でき、複製ごとに合計7〜8個のhCOが処理されます。理想的には、hCOの外側に面した心室は、一般的に最もよく発達しているため、標的にする必要があります(図2G、H)。
  7. 細い鉗子を使用してオルガノイドを押し、動きを制限します。オルガノイドを実際につかまないでください(図2C)。
  8. 注入後、ワイドボアピペットチップを使用して、1-2個のオルガノイドをTyrode溶液を含むエレクトロポレーションチャンバーに移します(図2C、D)。
  9. 注入したオルガノイドを電極に向け、オルガノイドの外側に面した心室様領域の頂端橈骨グリアが標的となるようにします。
  10. オルガノイドの注入側を正極(アノード; 図 2D)。
  11. エレクトロポレーターマシンの パルス ボタンを押して、38 Vの5つのパルスをそれぞれ50ミリ秒間隔で1秒間隔でエレクトロポレートします。
    注意: エレクトロポレーション設定は、利用可能なエレクトロポレーターによって異なる場合があり、最適化が必要な場合があります。
  12. 必要な数のオルガノイドが処理されるまで、注入とエレクトロポレーションのステップを繰り返します。
  13. エレクトロポレーションされたオルガノイドをRTの培地に集め、同じ条件のすべてのサンプルが処理されるまで集めます。合計で30分以上インキュベーターの外にいないことを確認してください。
  14. その後、エレクトロポレーションされたhCOを適切な培地に戻し、最初の24時間振とうせずに培養します。
    注:2〜3日後、蛍光ステレオスコープ下のエレクトロポレーションhCOでGFPシグナルが見えるはずです(図2H)。エレクトロポレーション後の分析の時点は、答えるべき生物学的な問題に応じて選択する必要があります。3〜7日後、GFP陽性細胞はVZ、SVZ、およびCP15,60の横に配置されます。

8. エレクトロポレーションされたヒト皮質オルガノイドの固定と凍結切片

  1. エレクトロポレーションオルガノイドを4%パラホルムアルデヒド(PFA)に室温で30分間、2 mLの反応チューブで固定します。
    注意:PFAは毒性があり、発がん性があります。ドラフトの下でPFAを含むすべての手順を実行します。ニトリル手袋と安全ゴーグルの使用を強くお勧めします。
  2. PBSで1回5分間洗浄し、組織がスクロースで完全に飽和するまで、PBS中の滅菌ろ過された30%スクロースに4°Cで保存します。
  3. 凍結組織標本用の包埋培地に固定オルガノイドを埋め込み、ドライアイス上のブロックでPBS中の15%スクロースを埋め込みます。
  4. クライオスタットで20〜30μmの切片を調製し、接着スライド26,64上に組織を回収する。
    注:このプロトコールは、固定オルガノイドがショ糖中(4°Cで数ヶ月間安定)になったら一時停止するか、または包埋培地に包埋(凍結ブロックを-20°Cの密閉袋に数ヶ月から数年保存)することができます。

9. エレクトロポレーションヒト皮質オルガノイドの免疫組織化学的解析

  1. 免疫組織化学分析26,64のために、クエン酸緩衝液(10mMクエン酸ナトリウム、0.05%ポリソルベート20 in dH2O、pH 6.0)中で、水浴中で70°Cで1時間抗原賦活化を行う。
  2. PBSで5分間1回洗浄した後、スライドを短時間乾かし、ワックスペンでセクションを丸で囲みます。
  3. 0.1 MグリシンをPBS(pH 7.4)中で室温で30分間クエンチし、その後PBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
  4. ブロッキングバッファー(10%ウマ血清、0.1%オクトキシノール9含有PBS)で切片を覆い、RTで30分間インキュベートします。
  5. ブロッキングバッファーで一次抗体を調製し、切片上で4°Cで一晩インキュベートします。
  6. 翌日、PBSで各5分間3回洗浄し、二次抗体およびDAPIとブロッキングバッファーで室温で1時間インキュベートし、再度PBSで5分間各3回洗浄します。
  7. スライドを封入剤にセットし、蛍光顕微鏡でイメージングします(図3)。
    注:ネイティブシグナルは固定後に消光されることが多いため、標的細胞を特定するために、注射ミックスで使用される蛍光色素に対する抗体を含めることをお勧めします。 図3に示されているように、免疫蛍光染色に使用される抗体および色素を 表1に示します。

10. CRISPR/Cas9を介したノックアウトのタンパク質レベルでの検証

  1. タンパク質レベルでのノックアウトを検証するには、エレクトロポレーションオルガノイド上の標的タンパク質の免疫組織化学を行います(図3I)。
  2. gLACZ コントロールと標的オルガノイドの両方を同じ設定でイメージングし、蛍光強度を比較できるようにします(図3I、J)。これをゾーン固有の方法で行い、発達中の新皮質のさまざまな細胞タイプへの影響を比較します。ImageJ / Fiji( プラグインCell Counter)でセルをカウントするか、 StarDist プラグイン65を使用してセグメント化します。

結果

CRISPR/Cas9を介した遺伝子アブレーションには、gRNAの設計が必要です。一般に、目的の遺伝子の最初のエクソンの1つを、7〜11 bpの間隔で配置したgRNAのペアで標的とすると(3 bpの倍数を避ける)、うまく機能します(図1A)。第1の試験として、gRNAによるテンプレート認識の効率は、PCRテンプレート26,40,62を用いてin vitroで調べることができる。効率的なターゲティングとCas9を介した切断は、テンプレートDNAの還元とアガロースゲル上の切断されたDNA産物の出現に見られます(図1B)。皮質オルガノイドの生成に使用されるiPS細胞株では、さらなるgRNA試験を行うことができます。これにはiPS細胞のヌクレオフェクションが必要であり、これは蛍光レポーターの発現が成功することで可視化できます(図1C)。目的の遺伝子座の効率的なターゲティングは、サンガーシーケンシングによって検証することができ、その結果、標的部位の周囲で突然終了するか、または重ね合わせるクロマトグラム(図1D)が得られ、これは非相同末端結合による二本鎖切断修復からのインデルのスペクトルから生じる66。Guide RNA効率試験は、in vitroおよびiPSC細胞で、皮質オルガノイドの遺伝子アブレーションに有効なgRNAペアを選択するのに役立ちます。

エレクトロポレーションに先立って、皮質オルガノイドをスライスし、エレクトロポレーションミックスを注入するための心室内腔の同定をサポートします(図2A-C)。次に、注入されたオルガノイドをエレクトロポレーションチャンバーに移します(図2D)。エレクトロポレーションには、心室様構造の良好な皮質オルガノイドを使用し(図2E)、目に見える構造を持たない皮質オルガノイドは廃棄する必要があります(図2F)。エレクトロポレーションミックスには、処置中に注入された心室を視覚化できる色素が含まれています(図2G)。培養で1〜3日後、蛍光顕微鏡下でネイティブGFPシグナルにより、標的化に成功した心室が見えます(図2H)。

詳細な組織学的分析のために、凍結切片の免疫組織化学を行うことができます。理想的には、エレクトロポレーションされた皮質オルガノイド内に複数の標的心室が存在する(図3A、B)。最も最適なエレクトロポレーションは、オルガノイドの外側領域にある心室様構造を標的とし(図3C)、これらは通常、最も拡張した心室です。場合によっては、プラスミド濃度が高すぎる場合やエレクトロポレーション設定が最適でない場合など、エレクトロポレーションが過剰な細胞死につながる可能性があります(図3D、E)。オルガノイドの内部に面したエレクトロポレーション(図3F)は、多くの場合、外部と比較して心室様構造の拡張領域が少ないです。私たちの経験では、オルガノイドの定義された領域に定量分析を集中させることで、ばらつきを減らすことが有効です。エレクトロポレーションは、注入量が多すぎて心室が破裂したり、電気パルスが強すぎて細胞の層間剥離を引き起こしたりするなど、頂端表面の破壊を引き起こすことがあります(図3G)。最後に、隣接する2つの心室が標的とされると(図3H)、皮質ゾーンの境界と標的細胞の起源を割り当てることが困難になる可能性があります。

免疫組織化学は、目的細胞(図3I)におけるタンパク質レベルでのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトの成功を検証するために使用され、ここではPolycomb Repressive Complex 1(PRC1)タンパク質PCGF467を標的とすることによって例示されています。シグナル強度は、対照細胞と実験条件でGFP陽性細胞で分析できます(図3J)。あるいは、適切な抗体が利用できない場合、標的細胞を皮質オルガノイド60 からFACSによって単離し、さらにサンガーまたは次世代シーケンシング36によって分析することができる。さらに、タンパク質レベルの減少は、ウェスタンブロッティングを使用して分析することもできます。

figure-results-1
図1:急性CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトのためのガイドRNAの設計と検証 (A)ガイドRNA(gRNA)設計戦略の概略図、目的遺伝子のエクソンを標的とする2つのgRNAを使用。黒矢印は、gRNAバリデーションに使用されるテンプレート調製用のPCRプライマーを示しています。(B) in vitroでのgRNA効率の検証。PCR増幅されたテンプレートは、RNP複合体で消化されました。切断が成功すると、ゲル電気泳動後にサイズの異なる2つのバンドが見えますが(左)、低効率のgRNAではテンプレートがカットされないままです(右)。(C)RNP複合体とGFPプラスミドを用いたヌクレオフェクション3日後のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の明視野画像(左)、GFP蛍光(中央)、および結合画像(右)。スケールバー:350 μm. (D) GFP陽性細胞からの増幅DNAのサンガーシーケンシングによるhiPSCにおけるgRNA効率の検証。二本鎖DNAの切断が成功すると、シーケンシングトラックはgRNA標的部位から始まるシグナルの重ね合わせを示します(上、KO1)。ターゲティングに失敗した場合、DNA配列のトラックは LACZ コントロールと比較して変化しません(下、KO2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション (A)ヒト皮質オルガノイド(hCO)のエレクトロポレーションのワークフローを示す概略図。まず、hCOを厚さ500μmのスライスに切片化します。2日後、GFP発現プラスミドとFast Greenを含むRNPミックスを、hCOの外側領域に優先的に、心室様構造の内腔に注入します。エレクトロポレーションでは、hCOをエレクトロポレーションチャンバーに入れます。数日間の培養後、エレクトロポレーション領域でGFPシグナルを検出することができます。(B)hCOのビブラトーム切片化の画像。オルガノイドは、ブロック内の培地中の3%低融点アガロースに埋め込まれています(左)。ブロックを厚さ500μmのスライスに切断します(中央)。スライスされたオルガノイドは、ワイドボアピペットチップ(右)で培養皿に戻されます。(C

figure-results-3

ディスカッション

ヒトの脳オルガノイドと皮質オルガノイドは、ヒトの新皮質の発達を研究するための重要なモデルとなっている7,16,17。ヒト疾患のモデリングでは、アイソジェニックなhiPSC株とオルガノイドがゴールドスタンダードとなっています68。しかし、新規iPS細胞株の作製には時間と費用がかかるため、遺伝子機能の研究のための皮質オルガノイドモデルの急性操作が広く適用されてきました。

脳オルガノイドおよび皮質オルガノイド14、22、26、46、47、48、49、50、51、55のエレクトロポレーションは簡単に実施でき、従来、機能研究に動物モデルを使用してきた多くの研究室には必要なツールが装備されています。in vivoでの注射の場合、側脳室は通常、34,36,37,39,40,41,42を標的とします。これらは、皮質オルガノイドにおいて、同様に注入可能な中央内腔を特徴とする心室様構造によってモデル化されています。皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、主に心室の内側を覆う細胞の端足、通常は頂端橈骨グリア69を標的とする。ターゲティング効率は実験によって異なりますが、通常、エレクトロポレーションの3〜7日後には、オルガノイドあたり100〜1,000個のGFP陽性細胞が得られます。ヒト神経前駆細胞の細胞周期の持続時間は、頂端放射状グリアの細胞周期長が14時間、基底前駆細胞が23時間70であるマウスと比較して約2倍の長さです。したがって、3日後、主に頂端橈骨グリアと中間前駆細胞はGFP陽性であるのに対し、GFP陽性細胞は7日後にすべてのゾーンに分布します。エレクトロポレーション後数ヶ月経ってもGFPシグナルは観察でき、GFP陽性細胞はオルガノイド全体に散在するニューロンを主成分としているため、個々の細胞の形態を解析することができます。心室の内側を覆う神経前駆細胞の標的化は、明視野顕微鏡下で心室様領域が識別できる段階で実行可能です。現在のプロトコル15では、これは皮質オルガノイド発生の2週目から12週目まで可能であり、その後、心室は縮小して見えなくなります。経験豊富な実験者であれば、1回のセッションで50〜80個のオルガノイドを注入することは可能です。

頂端橈骨グリアの子孫は細胞分裂中に遺伝子操作試薬を受け継ぎますが、ニューロンやアストロサイトなどの成熟細胞を直接標的とすることは、標準的なエレクトロポレーションアプローチでは実現できません。その代わりに、ウイルスの標的化法が神経系の有糸分裂後細胞に適用されている33,71。特に、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)は、最終分化細胞を高効率で産生および形質導入することが容易であるため、神経系での遺伝子導入に広く使用されています71。さらに、AAVは特定のニューロン亜集団を標的とすることができます。アデノウイルス、仙台ウイルス、レンチウイルスの使用を含むさまざまなウイルス標的化アプローチは、すでに脳および皮質オルガノイド15、25、29、30、32、47、72、73、74に適用されています。

脳オルガノイドプロトコルの1つの制限は、酸素と栄養素の供給が限られているため、壊死性コアが発達することです。オルガノイド中心での細胞生存率を改善するために、回転バイオリアクター14,54でのオルガノイドの培養、内皮細胞の共培養またはモデル血管新生への生物工学的アプローチ75,76、げっ歯類モデルへのオルガノイド移植18,77、オルガノイドのスライス15,47など、いくつかの戦略が実施されています.ここでは、スライスしたヒト皮質オルガノイドプロトコルを使用し、オルガノイドコアの低酸素症の減少を示し、心室様構造と皮質板状領域15の拡張をサポートすることが示されました。さらに、脳オルガノイドのスライスは、脳室下ゾーンに位置する基底橈骨グリアのライブイメージングにも有益であり、細胞運命決定マップ72の生成を可能にする。同様に、ライブイメージングを使用して、ニューロンの生存と軸索伸長をサポートする気液界面で培養されたスライスされた脳オルガノイドを研究しました47。また、ヒト皮質オルガノイドをスライスすると、これらのオルガノイドモデルはエレクトロポレーションに特に適しており、スライス後に心室のような構造を容易に同定できることを発見しました。皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、遺伝子の過剰発現に古典的に使用され、最近では全プラスミドライブラリーの送達に用いられるDNAプラスミド55、および遺伝子機能の不活性化のためのCRISPR/Cas9遺伝子編集ツールの導入を可能にする26。

CRISPR/Cas9技術は、遺伝子機能56,57,58,63,66の研究に革命をもたらしました。このプロトコルでは、ヒト皮質オルガノイドにおける急性遺伝子不活性化に対するgRNA/Cas9リボ核タンパク質複合体36の応用について概説しました。gRNAの有効性の初期検証は、in vitroで、最初は試験管で、次にiPS細胞で行われました。これらの簡単な初期試験は、特に作用する抗体がない場合に、有望なgRNAペアの選択に役立つことがわかりました。CRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトのツールがますます特徴付けられるようになると、将来的には最初の検証ステップが省略される可能性があります。iPS細胞から単離された標的DNA領域の次世代シーケンシングは、より定量的で情報量が多い一方で、サンガーシーケンシングはgRNAのプレスクリーニングにおいてはるかに迅速な結果が得られることが多いことがわかりました。最終的に、皮質オルガノイドにおける効率的なCRISPR/Cas9編集の検証と、目的細胞のタンパク質レベルの減少は、CRISPR/Cas9を介した遺伝子アブレーションの成功の最も決定的な証拠です。

スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、機能獲得および機能喪失研究のための急性遺伝子操作、細胞形態およびニューロン軸索の可視化、スクリーニングアプローチおよび大規模パラレルレポーターアッセイのためのプラスミドライブラリの送達、ライブイメージングのための細胞の標識およびエピゲノム編集ツールの送達を可能にします。このように、スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーションは、ヒト皮質の発達、神経発達障害、および皮質の進化に関するメカニズムの洞察を明らかにすることができる強力な方法です。

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

CRTDとDresden ConceptのパートナーであるK.Neumann氏とStem Cell Engineering Facilityのチーム、H. Hartmann氏と光学顕微鏡施設のチーム、A. Gompf氏とFlow Cytometry Facilityのチーム、MPI-CBGワークショップのHartmut Wolf氏にエレクトロポレーションチャンバーの建設について多大な支援を提供してくださったことに感謝します。原稿に対するフィードバックを提供してくださったJoshua Schmidtに感謝します。MAは、ドレスデン工科大学再生治療センター、DFG(Emmy Noether、AL 2231/1-1)、およびSchramFoundationからの資金提供を認めています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL PP遠心チューブ、円錐Corning430791
4D-Nucleofector Core UnitLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 mLポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付きCorningFalcon 352235
6-well plate、nunclon 処理サーモフィッシャー140675hiPSC用培養
6 ウェルプレート、超低アタッチメントCorning3471オルガノイド培養用
A83-01STEMCELL Technologies72022フォアブレイン培地 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Air コンプレッサーAerotec
Alexa Fluor 488 ロバ アンチチキン IgY (IgG) (H+L)ジャクソン イムノ リサーチ703-545-155二次抗体、RRID:AB_2340375;希釈率1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572二次抗体、RRID:AB_162543;希釈率1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA、2 nmol統合DNAテクノロジーカスタムデザイン(2 nmolとして注文)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA統合DNAテクノロジー10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3統合DNA技術1081060100 & マイクロ;g、Streptococcus pyogenes
Amphotericin B(Fungizone)Gibco15290018Forebrain medium 2、3、および4から (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
抗GFP一次抗体(ニワトリ、ポリクローナル)アブカムab13970RRID:AB_300798;希釈率1:2000
抗PCGF4一次抗体(マウス、モノクローナル)ミリポア05-637 RRID: AB_309865; 希釈率 1:300
アポトーム 蛍光顕微鏡ツァイス
アスコルビン酸シグマ アルドリッチ1043003フォアブレイン メディウム 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-supplement (+ビタミンA)Gibco17504044Forebrain medium 3, 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
>バナナからマイクログラバーへのケーブルキットハーバード装置 BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR machine)Analytik Jena846-2-070-723
キャピラリー、フィラメント付きホウケイ酸ガラス、OD 1.2 mm;内径0.69 mm;長さ10cm科学製品BF120-69-10厚さに引っ張る必要があります
CHIR-99021STEMCELLテクノロジー72052前脳媒体2 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
コラゲナーゼ IV 型Gibco17104019
CRTDi004-A幹細胞工学施設 CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-Aの単一細胞適応 hiPSC 株
用に希釈した 1:1000 を使用
STEMCELL Technologies73884前脳中 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Forebrain medium 1, 2, and 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102前脳培地 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
>Dumont #55 鉗子、ストライトス、11 cmファインサイエンスツール11295-51
ECM 830 矩形波エレクトロポレーションシステムハーバード装置 BTX45-2052
エタノールSigma Aldrich32205-1L-M
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
ファストグリーン FCFシグマ アルドリッチF7252
ウシ胎児血清 (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラーSutter Instrument Co.P-97マイクロキャピラリーの引っ張り用
Geneious PrimeGraphPad Software LLC d.b.a GeneiousSoftware version 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016;Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; 下線付きヌクレオチド = PAM
GlutaMAXGibco 35050038前脳媒体 1, 2, 3, 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898<
em>gPCGF4 KO1この論文5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (図 3I+J の KO 画像に対応)
gPCGF4 KO2この論文5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (KO図3I+J)
HEPES、社内Mストック
馬血清、熱不活性化Gibco26050088
ヒトGDNF組換えタンパク質サーモフィッシャー450-10前脳培地4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
ヒト/マウス/ラットBDNF組換えタンパク質サーモフィッシャー450-02前脳培地4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
塩酸(HCl)シグマ・アルドリッチ258148TrisHCl
ImmEdge(ワックス)ペン研究所H-4000
インスリン溶液 ヒトシグマ・アルドリッチ I9278フォアブレイン・ミディアム 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
イソプロパノールフィッシャーサイエンティフィックBP2618-1
ノックアウト血清補充Gibco 10828-010前脳中程度 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
レーザー走査型コンフォーカル980顕微鏡ツァイス
低融点アガロース、ビブラトーム切片化中にhCOを埋め込むためのサーモフィッシャー16520100
マトリゲル成長因子還元型(GFR)基底膜マトリックス、LDEVフリーコーニング354230オルガノイド培養用
マトリゲルhESC認定マトリックス、LDEVフリーコーニング354277hiPSC培養用
MgCl2、1 MサーモフィッシャーAM9530G
マイクロインジェクター PicoPump + フットスイッチワールドプレシジョン機器SYS-PV820
マイクロローダー ピペットチップ 0.5 〜 20 µLEppendorf5242956003ガラス毛細血管のローディング用
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850幹細胞培地
N-2 サプリメントGibco17502048Forebrain 培地 2, 3 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
>NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix ニューイングランドバイオラボM0541S
ノイバウアー計数チャンバーブランド718605
神経基礎培地Gibco21103049フォアブレイン培地4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
非必須アミノ酸Gibco 11140050前脳培地 1、2、3、4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
>ヌクレアーゼフリー デュプレックスバッファー統合DNA技術1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583凍結組織標本用埋込培地
P3 初代細胞 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
パラホルムアルデヒドフィッシャーケミカルP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Peel-A-Way Embedding Mold TruncatedT12Polysciences Inc.18986-1ビブラトーム用hCOの埋め込みおよび
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)Gibco15140122Forebrain medium 1、2、3、および 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15および核形成後の幹細胞培地用
ペトリ皿 60 mm x 15 mm、ベントなし、滅菌CorningBP50-02
ペトリ皿 プラチナ電極チャンバー、5 mm ギャップハーバード装置 BTX45-0504
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)自家製
プロテイナーゼ Kシグマ アルドリッチP2308Titrachiumアルバムから; 10 mg/mL ストック
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28706
RHO/ROCK pathway inhibitor (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Forebrain medium 2 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
クエン酸ナトリウム二水和物ΣアルドリッチW302600-1KG-K
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)シグマアルドリッチL3771
ショ糖 シグマ アルドリッチS7903
スーパーフロスト プラス 接着スライドフィッシャー サイエンティフィック10149870
SZX10 と KL 300 LEDオリンパスSZX10または代替ステレオスコープ
サーモ シェイカーグラントバイオ PSC24N
トリトン-Xシグマ アルドリッチT9284別名 オクトキシノール 9
トリズマ ベースシグマ アルドリッチT1503TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Dissociation enzmye to make single-cell suspensions
Tween 20Sigma AldrichP1379a.k.a. Polysorbate 20
Tyrode's saltSigma AldrichT2145-10x1l
振動ミクロトーム(ビブラトーム)ライカVT1200 S
ワイドボア 1000 & マイクロ;L ユニバーサルフィットフィルターチップコーニングTF-1005-WB-R-S
&β;-メルカプトエタノールギブコ 21985-023前脳中 1、3、4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
形 の特定の 健常ドナー DAPI Roche 10236276001の 1 mg/mL ストック、IF ジブチリル cAMP はで作られました1 を作るには ベクター超高純度のクライオ切片用 

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