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方法論記事

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

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DOI:

10.3791/67607

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2024年12月20日

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1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウスにおける乳がん患者由来異種移植片の同所性移植のための効率的な非外科的方法を説明しています。この技術には、酵素による腫瘍解離とそれに続く乳腺脂肪パッドへの直接注射が含まれ、ハイスループットの移植が可能になります。包括的な検証により、モデルの忠実度が確保され、さまざまな乳がんサブタイプにわたる厳密な研究が容易になります。

要約

患者由来異種移植片(PDX)は、腫瘍に関与する細胞の種類と腫瘍微小環境を再現するための臨床的に関連性のある方法を提供し、これは乳がん(BC)の知識を進歩させるために不可欠です。さらに、PDXモデルでは、in vitroモデルでは不可能なBC全身効果の研究が可能です。BC異種移植片を移植する従来の方法には、通常、麻酔と滅菌外科的処置が含まれますが、これらは時間がかかり、侵襲的であり、BC研究におけるPDXモデルのスケーラビリティを制限します。このプロトコルは、マウスにBC PDXを同所性移植するためのシンプルでスケーラブルな方法を記述しています。免疫不全マウス NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)をPDX生着に用いた。IRBに同意した患者から得られたヒトBCサンプルを機械的および酵素的に解離した後、基底膜抽出物(BME)とRPMI 1640の溶液に再懸濁しました。動物は首筋で拘束され、脱毛クリームを塗布して第4鼠径乳首の脂肪パッドから脱毛し、続いて注射を行いました。100μLの懸濁液中の約200万個の細胞を、26Gの針を用いて乳腺脂肪パッドに両側同所的に注入しました。特に、麻酔薬は不要で、細胞の準備から注射までの合計処置時間は5分未満でした。数か月の成長期間の後、腫瘍を切除し、認証のために処理しました。検証には、従来のBC受容体(すなわち、ER、PR、HER2)に対する特異的抗体を用いた免疫組織化学を用いた受容体状態評価が含まれていました。腫瘍の形態は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色で確認され、病理医によって解釈されました。患者サンプルとの遺伝的類似性は、バルクRNAシーケンシングおよびショートタンデムリピート(STR)解析によって検証されました。PDXの生着と検証に対するこのアプローチは、モデルの厳密な開発とハイスループットの腫瘍移植をサポートし、さまざまなBCサブタイプにわたる優れた研究を可能にします。

概要

乳がん(BC)は、毎年世界中で200万人以上の女性で診断されています1。BCの基本的な生物学的理解を深め、新規治療薬を承認された治療法にうまく変換するためには、患者の腫瘍の特徴を保持する前臨床動物モデルが必要です。患者由来異種移植片(PDX)は、組織病理学、受容体発現、遺伝的異常など、同所的に移植された場合、腫瘍の不均一性を高い忠実度で再現することが実証されています2,3,4。重要なことに、それらはまた、血管系、免疫細胞、癌関連線維芽細胞など、腫瘍の微小環境に寄与する間質細胞も保持しています。とはいえ、継代5により、それらは徐々にマウスの宿主間質細胞に置き換えられます。また、PDXは、疲労6,7など、腫瘍の成長に起因する全身性合併症の研究も可能にしますが、これは現在in vitroモデルでは不可能です。

ただし、BC PDXの生着を成功させるには、免疫不全マウス系統が必要であり、最も一般的に使用される系統はNSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)です。NSGマウスは適応免疫を欠いており、非常に欠陥のある自然免疫を示します8。BC PDXの生着は、SCID/Beige(CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl)などの他の免疫不全株でも達成されており、同様の生着率で行われています4。

BC PDXを移植する従来の方法は、乳房脂肪パッド9に腫瘍断片を外科的に移植することを含み、このアプローチは好ましい速度で成功した生着につながります。しかし、滅菌外科的処置や麻酔薬の使用が必要なため、時間がかかり、特定の時間枠内に移植できるマウスの数が制限されます。PDXが腫瘍における薬物反応の予測効果とプレシジョンメディシン10での利用に期待できることを考えると、マウス間でPDXを均一に移植するためのシンプルで再現性のあるワークフローを持つことは不可欠です。この記事では、ヒト乳房腫瘍の単一細胞懸濁液への解離と、その後の免疫不全マウスの乳腺脂肪パッドへの同所性注射を示しています。

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プロトコル

このプロトコルは、ウェストバージニア大学(WVU)の施設内動物管理および使用委員会によって確立されたガイドラインに準拠しています。腫瘍細胞の注射には、8週齢以上、体重約25gの雌 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスを用いた。乳がん腫瘍組織は、ウェストバージニア大学がん研究所(ウェストバージニア州モーガンタウン)で調達され、承認されたWVU治験審査委員会のプロトコルとWVUがん研究所のプロトコル審査および監視委員会の下でNCI協同ヒト組織ネットワークによって調達されました。インフォームド 書面による同意は、患者から得られました。すべての手順は、適切な個人用保護具(PPE)プロトコルに従って、クラスII生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で実施されました。この研究で使用された動物、試薬、および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. 腫瘍組織のハイスループット酵素解離

  1. ヒト腫瘍解離キットの酵素H、R、Aを滅菌Cチューブで解凍し、組み合わせます。200 μL の酵素 H、100 μL の酵素 R、25 μL の酵素 A を加え、4.7 mL の滅菌 RPMI 1640 培地を C チューブに加えて、最終容量を ~5 mL にします。
    注:ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)は、RPMI 1640の代わりに使用できます。
  2. 腫瘍断片は、既存のプロトコル9に記載されているように切断および凍結することができる。解凍した腫瘍片とそれに伴う凍結培地を、滅菌済みの100 mm培養皿の半分に移します。滅菌鉗子を使用して、腫瘍の断片を滅菌済みの5mLマイクロチューブに移します。
    注:滅菌皮下注射針は、鉗子の代わりに使用できます。5mLのマイクロチューブの代わりに35mmのディッシュを使用できます。
  3. 腫瘍の断片を1〜3 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1x)で洗浄します。鉗子を使用して溶液中のフラグメントを操作し、残留凍結媒体を完全に除去します。
  4. 洗浄したフラグメントを鉗子を使用して2mLのマイクロチューブに移します。1 mLのトリプル抗生物質(TAB)溶液を腫瘍断片に適用し、室温で10分間インキュベートします。
    注:この手順は、必要に応じてスキップできます。10x TABストックは、1%ゲンタマイシン、1%クリンダマイシン、および0.5%ポリミキシンB硫酸塩を滅菌済み1x PBSに溶解することで作製できます。滅菌済みの1x PBS溶液で1x TAB溶液に希釈します。
  5. 滅菌鉗子を使用して、消毒した断片を新しい5 mLマイクロチューブに移します。1〜3mLの滅菌PBSで2回目の洗浄を行います。ステップ1.2から洗浄した断片を100mm培養皿の乾燥した半分に移します。
  6. 滅菌済みのNo.10メス刃2枚を使用して、腫瘍組織を徹底的にミンチにします。細かく刻んだ腫瘍片を1枚のブレードに移し、調製した酵素溶液を含むCチューブに沈着させます。最後のカチッという音がするまで、チューブの蓋をしっかりと固定します。
  7. Cチューブを数回反転させて、酵素溶液内の腫瘍断片が均一に分布するようにします。
  8. Cチューブを機械式解離器に入れます。チューブを反転させ、すべての内容物が媒体に沈んでいることを確認します。チューブは機械内で逆さの位置になります。
    1. へこんだ部分がオペレーターを向くようにチューブをスロットに固定します。該当する場合は、ヒーターをチューブの周りに置きます。
  9. タッチスクリーンインターフェースから 37C_h_TDK_3 プログラムを選択します。このプログラムは、37°Cで60分間動作します。 より柔らかい腫瘍の場合は、 37C_h_TDK_1 または2を使用できます。
    注:最大の効率を得るために、この解離期間中にマウスを注射部位に脱毛クリームを塗布することにより、マウスを注射用に準備することをお勧めします。.
  10. 解離プログラムが完了したら、チューブの内容物を検査します。目に見える腫瘍の断片が残ってはいけません。
    注:フラグメントが存在する場合は、追加の解離時間が必要になる場合があります。このような場合は、プログラムをさらに20〜30分間実行します。
  11. 適切な解離が達成されたら、Cチューブを200 x g で4°Cで5〜8分間遠心分離し、解離した細胞をペレット化します。真空吸引またはピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。
  12. 細胞ペレットを5〜10 mLの新鮮なRPMI培地に再懸濁します。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、操作を容易にします。細胞懸濁液を200 x g で4°Cで5〜8分間遠心分離します。 上清を慎重に吸引します。
    注:セルペレットが小さい場合は、この手順を省略できます。このような場合、細胞は所望の量の培地に直接再懸濁され、次いで基底膜抽出物(マトリゲル)と混合されて細胞損失が最小限に抑えられる。
  13. 細胞ペレットを、所望の最終注入量の半分に相当するRPMI 1640の容量に再懸濁する。RPMI 1640 と Matrigel は 1:1 v/v 比で組み合わされ、注入部位あたりの最終注入量は 100 μL になります。
    注:4匹のマウスでの両側注射の場合、必要な総容量は800μLです。したがって、細胞を少なくとも400μLのRPMI 1640に再懸濁します。潜在的なボリューム損失を考慮するために、最終ボリュームにさらに20%を追加し、1:1 v / v比を維持することをお勧めします。あるいは、RPMI 1640の代わりにDMEMまたは1x PBSを使用することもできます。
  14. 血球計算盤または自動化された方法を使用して、再懸濁した細胞をカウントします。必要に応じて希釈して、注射に必要な濃度を達成します。注入部位あたり約100万〜200万個の細胞の開始点が提案されています。
  15. 2 mLの丸底マイクロ遠心チューブに、RPMI中の希釈細胞懸濁液を同量のマトリゲルと組み合わせます。ピペッティングを繰り返して懸濁液を穏やかに混合し、均一性を確保します。
    注:前のステップに続いて、希釈した細胞懸濁液400 μLを400 μLのMatrigelに加えます。使用する注射針の数を考慮し、関連する体積損失を考慮に入れます。マトリゲルは常に氷の上に置いてください。細胞が再懸濁されるまで解凍しないでください、それはすぐに固まるので。2 mLチューブ内での迅速な解凍と組み合わせのために、少量のアリコート(120 μLなど)を維持することを推奨します。
  16. 注入の準備ができるまで、細胞懸濁液を氷上に保持します。

2. 解離性PDXの同所性鼠径乳腺脂肪パッド注入

  1. キャリブレーションされた天びんを使用して、各マウスの質量を決定します。脱毛クリームの薄層をターゲット注射部位に塗布します。滅菌綿棒を使用して、時計回りと反時計回りに交互にクリームをマッサージして、毛皮の迅速な除去を促進します。
    1. 滅菌生理食塩水に浸したガーゼスポンジを使用して、余分な毛皮と脱毛クリームを取り除きます。注射部位での完全な脱毛を確実にします。
      注:皮膚の炎症を防ぐために、脱毛クリームへの曝露は60秒を超えないでください。.脱毛クリームを塗布する前にマウスを剃ることができ、曝露時間をさらに最小限に抑えることができます。このステップは、腫瘍の解離中に実行して、時間効率を最適化し、氷上での細胞懸濁液の保存期間を最小限に抑えることができます。
  2. 各マウスの徹底的な目視検査を実施して、注射の適合性を評価します。痛み、苦痛、病気、またはその他の禁忌の兆候がないか評価します。
  3. 針を取り付けていない1mLシリンジを使用して、細胞懸濁液を上下に穏やかに吸引し、均一性を確保します。26 Gの針を1 mLシリンジに取り付け、目的の注入量を引き出します。.シリンジから気泡を取り除くには、軽くたたくかはじきます。
    注:片手での注射を容易にするために、シリンジあたり600μLを超えないようにすることをお勧めします。
  4. 準備したシリンジを氷容器の上に水平に置き、針をオペレーターから遠ざけます。氷の容器と針を、オペレーターの利き手または好みの注射手と同じ側に置きます。マウスをハウジングから取り外し、アルコールクレンジングパッドを使用して注射領域を消毒します。
  5. うなじと背中の背側の皮膚をしっかりとつかむことでマウスをしっかりと拘束します。乳房の脂肪パッドをはっきりと露出させるのに十分な固定を確保します。鼠径部の乳房脂肪パッドは、乳首から腰の上部まで広がっています。それは、皮膚の下の記載された領域に柔らかいピンクがかった組織として観察することができます。
    注:アシスタントオペレーターは、フラットサイド鉗子を使用して、脂肪パッドを含む皮膚をつまんで持ち上げることができます。この手法は、注入を行うオペレーターが脂肪パッドをうまくターゲットにすることを確実にするのに役立ちます。
  6. マウスを仰臥位に置きます。針を45度の角度で挿入(斜めに)し、脂肪パッドに対して約0.5〜1cmの尾側にある腰を指し、針の長さを調整します。
    1. 針をファットパッドに進めます。制御された方法で、必要な量の細胞懸濁液を注入します。効率的な注入速度は、長時間の拘束による動物の動揺を最小限に抑えるのに役立ちます。
      注:動物の苦痛を最小限に抑えるために、継続的な手動拘束の最大時間は30秒を超えてはなりません。拘束時間が30秒を超える場合は、2回目の試行の前に動物をケージに解放して回復させる必要があります。
  7. 注射後、針を180度回転させます(斜角を下にします)。ゆっくりと引き抜く前に針の位置を短時間維持して、注射部位からの細胞の損失を最小限に抑えます。出血が発生した場合は、必要に応じて標準ガーゼまたは止血ガーゼを塗布してください。
  8. 両側の注射が必要な場合は、反対側の脂肪パッドについて手順2.6と2.7を繰り返します。複数の動物の場合は、必要に応じて手順2.2〜2.7を繰り返します。

3. フォローアップ手続き

  1. すべての鋭利物は、指定された鋭利物容器に廃棄してください。他のすべての内容物は適切な廃棄物容器に捨ててください。
  2. 注射中に出血が発生した場合は、マウスを少なくとも1時間監視して止血を確認します。.
  3. 毎週体重を監視します。成長が明白になったら、腫瘍の体積を評価します。

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結果

この研究では、マウスにおける患者由来の乳がん異種移植片の同所性移植のための効率的で非外科的アプローチを概説しています。乳房腫瘍組織をヒト特異的酵素と機械的攪拌を用いて解離し、Matrigel:RPMI 1640の1:1 v/v比で再懸濁し、NSGマウスの鼠径部乳脂肪パッドに同所的に注射しました(図1および図2)。PDXモデルの忠実度を確保するために、元の患者腫瘍サンプルと継代した腫瘍との一致は、確立された組織病理学的およびゲノム技術によって検証されました。受容体発現は、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2)などの標準的な乳がん受容体の免疫組織化学(IHC)染色を用いてプロファイリングしました(図3)。細胞形態は、切片化された腫瘍切片のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色および染色された切片の専...

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ディスカッション

この記事では、免疫不全マウスの鼠径乳腺脂肪パッドにBC PDXを同所性に移植するための効率的でハイスループットな方法を紹介します。この最適化されたワークフローにより、1人の研究者が1日あたり数十匹のマウスにPDXを移植することができ、大規模で十分な検出力を持つ研究をサポートします。また、複数のユニークなPDXを同時に解離し、移植する能力も、精密な腫瘍学アプローチを可能にします。時間効率だけでなく、腫瘍の解離により、マウス間で均一に分布する細胞タイプの均質な懸濁液が生じます。私たちの経験では、この均質性が一貫した生着と腫瘍増殖率に貢献しています。

このプロトコルは一般的に効果的ですが、特定のシナリオでは変更が必要になる場合があります。たとえば、機械式解離器の標準的な 1 時間のランタイムでは、腫瘍組織の完全な解離には不十分であることが証明されることがあります。Cチューブをしっかりと握りながら、数回下に弾くと、底に浮遊組織が溜まります。目に見える組織片が残っている場合は、解離を続け、15分間隔で再検査します。一部の組織...

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開示事項

著者は、開示すべき利益相反がないことを宣言します。

謝辞

PDXの開発に腫瘍サンプルを提供してくださった患者さんの寛大な貢献に感謝します。エミディオ・ピスティリは、ハンナ・ウィルソン医学博士のこれまでの多大な貢献に感謝します。この研究は、次の組織によって支援されました:国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)の賞番号R01AR079445(Pistilli)。WVUゲノミクスコアファシリティ(U54GM104942)。WVU動物モデルおよびイメージング施設(P20GM121322、U54GM104942、P20GM144230、P30GM103488);国立総合医科学研究所(NIN)賞番号P20GM121322(ロックマン)。 図 1 は BioRender.com を使用して作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL ツベルクリンシリンジBD305945 滅菌
1x リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4Gibco10010023滅菌
2.0 mL 丸底マイクロ遠心チューブEppendorf0030123620滅菌
26 G 針、½ in.BD305111滅菌済み
5.0 mL マイクロチューブEppendorf0030119401滅菌済み
8+ 週齢 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) マウスジャクソン研究所#005557
アルコール調製パッドフィッシャーサイエンティフィック22-363-750滅菌
基底膜抽出物 (マトリゲル)Cultrex3632-005-02
綿先端アプリケーター、6 インチ。フィッシャーサイエンティフィック22-029-553
滅菌湾曲鉗子、中型非鋸歯状チップ、152 mm電子顕微鏡科学50-365-845
脱毛クリームNair
ジェントルMACS CチューブMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACSオクトディスソーシエーターヒーター付きMiltenyi Biotec130-096-427
No. 10 メスの刃フィッシャー サイエンティフィック12-000-162滅菌不織布
ガーゼ スポンジ、4x4 インチフィッシャー サイエンティフィック22-028-558滅菌
RPMI 1640 1x + L-グルタミンギブコ11875093滅菌腫瘍
解離キット、ヒトMiltenyi Biotec130-095-929
滅菌

参考文献

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