組織サンプル中の皮膚細胞の表現型と増殖状態を評価するためのハイスループットイメージングおよび分析ワークフロー

Summary

反復漂白拡張多重性(IBEX)と市販のヌクレオチド標識アッセイ(Click-iT EdU)の組み合わせにより、固定凍結マウス組織切片における非常に動的なプロセスにおける分裂細胞型の検出と分類が可能になります。さらに、新しいオープンソース画像処理パイプラインにより、ハイスループットの画像取得と分析が提供されます。

Abstract

皮膚損傷は、さまざまな細胞型に関与する複雑な再生カスケードを開始します。その中でも、末梢グリア細胞は修復プロセスの成功を確実にする上で重要な役割を果たします。しかし、現在の技術の限界により、これらのプロセスに対する私たちの理解は依然として不完全です。したがって、反復漂白拡張多重性(IBEX)法を採用して、組織再生に関与する主要な細胞型および構造によって発現されるタンパク質に対する抗体を使用して、皮膚の細胞組成の変化を特徴付けました。重要なことに、細胞増殖マーカーに対する抗体は、皮膚内の分裂細胞の数を過小評価することが多いです。この制限を克服するために、Click-iT EdUケミストリーをIBEX法と組み合わせることで、増殖する細胞型の詳細な特性評価が可能になりました。全自動スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して、24ウェルプレートに切片化されたサンプルの反復イメージングのためのハイスループットワークフローが開発されました。Click-iT EdUで細胞状態を その場で 評価するIBEX法を拡張するだけでなく、画像補正、ステッチング、レジストレーションを実行するための新しいオープンソース画像処理パイプラインも導入され、豊富なプログラミング経験のない研究者でも使用できます。さらに、高度に多重化されたイメージングデータの処理と視覚化(FijiやQuPathなどの従来の画像解析ソフトウェアを使用)に関する詳細なドキュメントも提供されています。要約すると、このプロトコルは IBEX プロトコルの多用途性を強調し、確立された従来のイメージング プラットフォームへの適応を実証します。特に、IBEXとClick-iT EdU標識を組み合わせることで、無傷の組織内および空間分解能での非常に動的なプロセス中に活発に分裂している細胞型の検出と分類が可能になります。

Introduction

皮膚は人体の最大の器官であり、外部環境から体を守るための原始的な障壁です¹。その結果、バリア機能を損なう多くの外部課題にさらされています。したがって、皮膚は損傷後に組織の完全性と機能を回復するための複雑なメカニズムを開発しました。皮膚の創傷治癒は、炎症、増殖、成熟/リモデリングの 3 つの重複する段階で起こります。これらの3つの段階には、真皮線維芽細胞や免疫細胞など、いくつかの異なる細胞型が関与し、これらが一緒に作用して損傷した^{皮膚組織の}初期の生物学的特性を回復します^1,2,3。

皮膚は密に神経支配された器官であり、神経支配は^{修復プロセスを成功}させるために重要であることが知られています^4,5,6。軸索シグナル伝達^4,7,8とは別に、通常軸索を包み込む末梢グリアは、^{組織再生の}成功に関与しています^9,10,11。しかし、末梢グリア細胞などの過小評価されている細胞型の役割は、皮膚組織の再生などの動的プロセスにおいて十分に理解されていません。これらの細胞の機能をより適切に判断するには、細胞微小環境と、再生プロセス中に細胞が相互作用する可能性のある隣接する細胞タイプを分析することが重要です。さらに、細胞増殖は組織再生の重要な段階であるため、修復プロセス全体を通じて増殖する細胞型を正確に検出し、分類することが重要です。

IBEX¹²などの多重化、高内容、光学イメージング法は、細胞組成を特徴付け、細胞間相互作用を視覚化および定量化し、複雑な組織内の微小環境パターンを空間分解能で分析するために開発されました。他のマルチプレックス法には特殊な機器と独自の試薬が必要ですが、IBEXの特に利点は、標準的な研究環境でアクセス可能な市販の抗体、試薬、顕微鏡を使用して比較的低コストで確立できることです。IBEXパネルでよく使用される抗Ki-67抗体は、多くの組織で増殖細胞型を確実に標識しますが^13,14、Ki-67陽性(Ki-67+)細胞の数は、急性マウスの皮膚創傷の固定凍結組織切片において、他の方法論と比較して過小評価されていることが判明しました。そこで、Click-iT EdUケミストリーとIBEXを組み合わせたところ、EdU⁺細胞の数は、他の方法論で得られた増殖細胞の総数をより正確に表すことがわかりました。

さらに、全自動スピニングディスク共焦点顕微鏡を採用することにより、24ウェルプレートに配置された組織切片の反復イメージングのためのハイスループットワークフローが確立されました。次に、複数のオープンソースの Python ツールを組み合わせて、不均一な照明を画像補正し、個々のタイルのステッチを実行し、最終的に画像登録を行う新しい画像処理パイプラインに組み合わせて、結果の画像を処理します。詳細には、BaSiCPyライブラリ¹⁵ を照明補正に、m2stitchライブラリを画像のステッチに、位相相互相関をサイクルレジストレーションに使用しました。登録した画像はOME-TIFFとして保存され、Fiji¹⁷ やQuPath¹⁸などの従来の画像解析ソフトウェアに読み込まれ、画像をさらに処理し、細胞型の分類や強度や距離の計算などの測定を行うことができます。まとめると、現在のプロトコルにより、末梢グリア細胞集団を取り巻く細胞微小環境に特に焦点を当てて、再生皮膚の主要な細胞型の詳細で非常に効率的な特性評価を実行することができました。

Protocol

すべての動物の繁殖、飼育、実験は、スイスのチューリッヒ州獣医局のガイドラインに従って行われました。

1. 全層皮膚創傷 (0日目)

1. 8〜10週齢のマウスに70%O₂ 中の5%イソフルランを誘導し、2.5%イソフルランを使用して維持します。
2. 背中の皮膚を剃り、徹底的にきれいにします。
3. 手術前に抗菌石鹸と70%EtOH溶液を使用して消毒してください。
4. ブプレノルフィン (30 μg∙mg^∙kg-1) の皮下注射を使用して術前鎮痛を適用します。
5. 各動物の腰の皮膚に直径5 mmの円形の全層切除創を4つ生成し、両側に2つずつ、動物の正中線から1 cm、互いに約2 cm離します¹⁹。
6. 飲料水(2%スクロースを含む9μg / mL)を介してブプレノルフィンを3日間治療して術後鎮痛を行います。
7. 包帯をせずに傷を治します。
8. 組織学的検査とフローサイトメトリー分析のために、定義された時点で創傷を収集します。
9. IBEXプロトコルでは、皮膚組織を解剖し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で4°Cで一晩固定します。市販の生検カプセルを使用して、固定中のサンプルのカールを防ぎます。4%PFA固定組織をPBS中の30%スクロース中で4°Cで一晩凍結保護します。 組織を30%スクロースとO.C.T化合物の1:1混合物にRTで2時間移し、最後にO.C.Tに包埋してからイソペンタンで急速凍結します。

2. サンプル調製(1日目)

1. 24ウェルプレートを200 μLのクロムミョウバンゼラチンでロッカーシェーカーで15分間コーティングします。次に、ゼラチンを完全に取り除き、コーティングしたウェルを40°Cのオーブンで60分間乾燥させます。バックアップとして必要な井戸を2倍にコーティングします。ウェルあたり2 mLのPBSを追加します。
   注: ティッシュを配置する前に、コーティングが完全に乾いていることを確認してください。ウェルは前日にコーティングし、RTで一晩乾燥させることもできます。コーティングされたウェルは、一度コーティングしたウェルを冷蔵庫や冷凍庫に保管せず、最良の結果を得るには、コーティングされた24ウェルプレートを1〜2日以内に使用してください。
2. クライオスタットでO.C.T包埋組織を15〜30 μmの厚さに切断し、2 mLのPBSを含むコーティングされたウェルにすばやく移します。
   注:組織は、金属製のへらまたは鉗子を使用して移すことができます。
3. 組織切片をウェルの中央に保つことを目的として、1 mLピペットを使用してPBSを慎重に除去します。これを効果的に行うには、ウェルの端からPBSをゆっくりと吸引し、必要に応じてピペットの位置を調整して組織がずれないようにします。
   注:組織の正確な配置は、プロトコルの成功に不可欠です。組織がコーティングされた表面に付着すると、位置を変えることはできません。
4. 組織切片を37°Cのオーブンで1時間乾燥させます。

3. 組織ブロッキング、EdU Click-iT 反応、および抗体免疫標識、IBEX サイクル 1 (1 日目)

1. 1 mLのPBSで5分間再水和します。
2. 500 μLの0.5%トリトンをPBS中のRTで30分間透過処理します。
3. PBSで組織を2回短時間洗浄します。
4. 製造元の指示に従って、RTで30分間Click-iT反応を実行します。
   注:サンプルを光から保護してください。
5. PBSで組織を2回短時間洗浄します。
6. ブロッキングバッファーを使用して、室温(RT)で1時間組織をブロックします。
   注:ここでは、PBS中の10%ロバ血清をこの実験に使用しましたが、これは必要に応じて調整できます。標準的な免疫標識プロトコルと互換性のあるブロッキングバッファーが適しています。
7. 一次抗体(ブロッキングバッファーで希釈、 材料表を参照)を4°Cで一晩1サイクル適用します。
   注:ブロッキングおよび免疫標識は、Radtkeら¹²に記載されているように、非加熱マイクロ波を使用して~1時間実行することもできます。ただし、皮膚の創傷の場合、一次抗体を一晩インキュベートすると、最高の信号対雑音比が得られます。免疫標識組織切片は、イメージング前に数日間PBSに保存できます。最適な信号品質を得るには、翌日にイメージングを行うことをお勧めします。

4. 二次抗体免疫標識と核対比染色(2日目)

1. ウェルを3 x 1 mLのPBSで洗浄します。
2. 組織切片を、抗ウサギ二次抗体染色(1:300)とともにブロッキング溶液中で、核対比染色剤Hoechst 1:1,000とともに、暗所でRTで1時間インキュベートします。
3. RTで1 mLのPBSで3 x 5分洗浄します。
4. 各ウェルに~500 μLのPBSを残し、プレートを顕微鏡に持っていきます。
   注:これは一時停止ポイントになる可能性があります:サンプルは4°Cで数日間安定していますが、免疫標識から24時間以内に画像化した場合、S/N比が最適です。

5. 最初の IBEX サイクルの顕微鏡セットアップとイメージング (2 日目)

1. 顕微鏡にログインしてソフトウェアをロードし、ユーザープロファイルにサインインします。
2. 取得設定を入力します( スクリーニング |Acquisition Setup)を使用して、プロトコル構成と画像取得を行います。
3. イ ジェクト ボタンを使用して、プレートを顕微鏡にロードします。
4. プレートを顕微鏡に入れる直前に、24ウェルプレートの底を70%エタノールで洗浄します。[プレート のロード] ボタンをクリックして、プレートを顕微鏡にロードします。
5. 対 物レンズとカメラで目的の倍率と取得モードを選択します。 取得 モードとして、 共焦点51μmスリット モードを選択します。
   注:ここでは、開口数が0.95の20倍水浸対物レンズと、250μmの間隔で間隔をあけた50μmのピンホールを備えた回転ディスクを実験に使用しました。
6. [ プレート] タブで、使用するプレート モデルを選択します。
7. [プレート]/[訪問するサイト]タブに移動します。[サイト オプション] で、[固定数のサイト] をクリックします。井戸全体がほぼ覆われるように、列と行の数を選択します。[サイトが 10% 重複する] をクリックします。
   注意: このボタンは、個々のタイルを確実にステッチするためにアクティブにする必要があります。
8. 井戸マップ上の対応する井戸を 右クリック して、最初に満たされた井戸のみを選択して、取得します。選択したウェルは緑色で、選択解除されたウェルは灰色です。
9. プレートマップの最初の充填ウェルとサイトマップの中心近くの部位を 左クリック して、ステージを組織がある位置に移動します。現在の位置を示す井戸とサイトの暗い色を探してください。
10. [獲得] タブに移動します。[レーザーベースのフォーカシングを有効にする]と[Zシリーズを取得]オプションを選択します。
11. [取得/オートフォーカス]タブに移動します。ウェルからウェルへのオートフォーカスで、プレートとウェルの底にフォーカスオプションを選択し、サイトのオートフォーカスで、すべてのサイトオプションを選択します。
12. [ 波長] タブに移動し、現在のサイクルでイメージングする色素の数を選択します。[ 波長] タブの下に開く新しいタブの数を探します。
13. 最初の波長タブに移動します。 [照明]で、 目的の蛍光色素に最適なフィルター設定を選択します(たとえば、Hoechstを使用した場合は DAPI を選択します)。
14. Z位置決めにZオフセット付きレーザーを選択し、オフセットの計算ボタンをクリックして正しいイメージング高さを設定します。一連の画像がさまざまな Z 位置で取得されます。サンプルに最も焦点が合っているものを選択してください。
    メモ: ステージの位置がティッシュのある場所に設定されていることを確認してください。この位置に組織が見えない場合は、別の部位 を選択して 再試行してください(手順4.9を参照)。
15. フォーカスボタンを押して、組織のピント画像が表示されるのを待ちます。
16. [イルミネーション パワー] で [50%] を選択します。ターゲット最大強度に2000と入力し、自動露出を押して露光時間を自動的に調整します。
    注:取得を高速化するために、レーザー出力を上げると、露光時間が短縮されます。ただし、これにより、より多くの光退色が発生し、個々のタイルが重なる画像アーティファクトが発生する可能性があります。
17. ZシリーズでZシリーズと2D投影画像を選択し、シェーディング補正でFLシェーディングのみを選択します。
18. 他の波長については手順5.13〜5.17を繰り返しますが、 Zオフセットのレーザー の代わりに、 W1からZオフセット を選択し、 0を選択します。
19. [Z シリーズ] タブに移動します。目的のステップサイズを入力します(20倍の対物レンズの場合は、0.5 μmのステップサイズを使用します)。
    注:推奨値の2〜3倍のステップサイズを使用することで、取得速度を上げることができます。
20. [ フォーカス] ボタンをクリックし、 現在の位置 というラベルの付いた矢印が表示されるまで待ちます。
21. 「 ライブ開始 」をクリックし、ライブ画像を含む新しいウィンドウが表示されるのを待ちます。組織の底に到達するまで 現在の位置 の矢印をドラッグし、[ B を設定 ] ボタンをクリックします。組織の上部に到達するまで 現在の位置 の矢印をドラッグし、[ T を設定 ] ボタンをクリックします。 F2: 停止をクリックします。
    注:アクティブ波長でライブイメージングに使用する波長を選択できます。
22. 取得するサイトを選択します。まず、ステージを左クリックして最初のウェルにあることを確認し、もう一度 [ライブ開始] を押します。サイトマップ内のさまざまなサイトを左クリックして、井戸内のさまざまな位置に移動します。組織の境界を見つけ、右クリックで取得する組織を含むすべての部位に印を付けます。選択したサイトは緑色で、選択解除されたサイトは灰色になります。
    注:今のところ、これは最初のウェルに対してのみ実行し、最初のウェルのみが取り込み用に選択されていることを確認してください。
23. [ 実行] タブに移動します。 プレート名には、"Cycle{i}_Well{w}_{description}"という名前を付けます。{i}、{w}、{description} を対応する値/説明に置き換えます。
24. [ プロトコルの保存] をクリックして保存し、名前に「Cycle{i}_Well{w}」を含めます。
25. 他のすべての井戸の取得領域を設定します。このために、手順5.22〜5.24を繰り返します。
    注:取得するウェルごとに、個々のプロトコルファイルを保存する必要があります。新しいROIを描画する前に、正しい井戸がアクティブになっていることを確認してください。その結果、取得するウェルごとに1つの保存されたプロトコルになります。これは、組織の形状がウェルごとに異なるため、必要です。ROIとzスタックがウェル間で同一である場合、ステップ5.22〜5.24を繰り返すとスキップでき、ステップ5.26〜5.29もスキップできます。その場合は、画像化するすべてのウェルを選択し(ステップ5.22を参照)、実行タブに移動して、プレートの取得を押します。
26. [ コントロール] |ジャーナル |録音を開始し てすぐに コントロール |ジャーナル |録音を停止します。 作成したジャーナルを保存し、 Control |ジャーナル |ジャーナルを編集します。
27. 左側のパネルで、[ プレート取得 - ファイルからプロトコルをロード ]と[ プレート取得 ]を見つけてダブルクリックし、これらのステップをジャーナルに追加します。右側のパネルで探してください。追加した プレート取得 - ファイルからプロトコルをロード することをダブルクリックし、最初のウェルに保存されたプロトコルを選択します(ステップ5.24を参照)。
28. 取得するウェルごとにステップ5.27を繰り返し、常にそれぞれのプロトコルをロードします。
29. [保存]をクリックし、最後に[ジャーナルの実行]をクリックして取得を開始します(15 μmのzスタックで180個のタイルを取得するには約3時間かかります)。

6.蛍光色素漂白(2日目)

1. ジャーナル終了の約30分前に、漂白試薬を準備します。10 mgの水素化ホウ素リチウムを10 mLのddH₂Oに溶解し、0.22 μmフィルターに通します。泡が形成されるのを10分間放置します。効率的な漂白を確実にするために、調製後4時間以内に漂白試薬を使用してください。
   注意: 水素化ホウ素リチウムは空気と反応し、可燃性の水素ガスを生成する可能性があるため、化学フードの下で作業してください。
2. 蛍光色素を1 mLの1 mg/mLの水素化ホウ素リチウムで15分間漂白し、標準的な周囲照明にさらします。漂白手順中に組織に小さな泡がないか探してください。
   注意: ケミカルフードの下で作業する場合は、漂白手順中に照明が自動的にオフにならないようにしてください。
3. さらに1 mLの1 mg / mLの水素化ホウ素リチウム(同じ溶液から調製)で15分間漂白を繰り返します。
4. ウェルを1 mLのPBSで3 x 5分間洗浄します。
   注:漂白試薬の除去が不完全にすると、次の抗体パネルが損傷する可能性があるため、洗浄時間を短縮しないでください。

7. IBEXサイクル(2日目)

1. 次の免疫標識サイクル(ステップ3.7)に一次抗体を適用し、4°Cで一晩インキュベートします。手順 4.4 から 5.4 を繰り返します。
   注:非共役ウサギ抗体は最初のIBEXサイクルでのみ使用されるため、ステップ4.2〜4.3は繰り返されません。ただし、ニワトリやモルモットなどのあまり一般的ではない種で産異性のある非共役抗体は、二次抗体が共役した一次抗体と交差反応しないため、後のサイクルでも使用できます。各サイクルで使用される抗体の正確な詳細は、材料表に記載されています。
2. 顕微鏡で、ローカルPCにCycle{i}_Well{w}として保存 されたロードプロトコル をクリックして、対応するウェルの前のIBEXサイクルのプロトコル設定をロードします(ステップ5.24)。プロトコル設定には、ROI(取得するタイルの選択)、倍率、オートフォーカス設定、および前のIBEXサイクル(ステップ5.5〜5.25)から保存された追加の取得設定が含まれます。
3. 波長タブを選択し、新しい抗体パネルの露出と照明度を調整します(ステップ5.12-5.18)。すべてのサイクルで1つのマーカー(通常はDAPIまたはHoechst)を画像化して、後でサイクルを整列させてください。
   注:Radtkeら¹⁸で報告されているように、GFPやtdTomatoなどの一般的に使用される蛍光タンパク質は、水素化ホウ素リチウム漂白に感受性がありません。tdTomatoなどの内因性蛍光タンパク質を含む組織を扱う場合、画像レジストレーションに必要ない場合は、サイクル1以降の取得から対応する波長を省略できます。[ 全体波長 ]タブで、取得チャネルの数を減らすことで波長を削除できます。さらに、組織の自家蛍光の一一な増加は、イメージングサイクルにわたって観察されませんでした。ただし、これは組織の種類によって異なる可能性があります¹⁸。
4. z-Stack設定がまだ妥当かどうかを確認し、それに応じて調整します(手順5.19〜5.21)。
   メモ: Z スタックのステップ サイズがすべてのサイクルで同じであることを確認してください。
5. [実行]タブでプレート名を更新し、プロトコルを再保存します。
6. 取得するすべてのウェルに対して、手順7.2〜7.5を繰り返します。
   注:最初のウェルで使用したすべての波長の 露光 設定を書き留め、後続のすべてのウェルで同じ設定を使用することをお勧めします。
7. ジャーナルを編集し、新しいプロトコル・ファイルを選択して、このサイクルのジャーナルを保管します。
8. ジャーナルを実行します。
9. ステップ6.1〜6.4を繰り返して、蛍光色素を漂白します。
10. 所望の量の免疫標識が達成されるまで、ステップ7.1〜7.9を繰り返します。

8. 画像処理 (2 日目)

1. IBEXサイクルの画像取得が完了したら、画像データをエクスポートします。
   1. スクリーニングを選択 |プレートデータユーティリティ |画像をエクスポートします。
   2. Select Plate(s) をクリックし、各サイクルとウェルで取得したすべてのプレートを選択します。
   3. すべてのZ平面を選択し、出力ディレクトリを選択して、OKを押してデータをエクスポートします。
      注:データは、タイルと平面ごとに個別のtiffファイルとしてエクスポートされます。すべてのタイルとサイクルを結合するために、次の処理手順が実行されました。
2. エクスポートされたデータを次のスキームに従ってフォルダーに配置します。各サイクルが1つのフォルダーであり、各ウェルに1つのフォルダーが再び含まれていることを確認します。名前は "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*" で、{i} と {well} は対応するサイクルとウェル、* は任意の文字です。たとえば、「\cycle1\A01\some_name_Plate_8654」
   メモ: 後続の処理手順では、正しい名前付けとフォルダ構造が必要です。
3. 必要なPythonパッケージをインストールする:Python環境の管理にはMiniforgeを使用します。インストール手順については、https://github.com/conda-forge/miniforge を参照してください。
   注: 処理手順のコードは、Jupyter Notebook の形式で提供されます。これらは、https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove または補足ファイル (補足ファイル 1、補足ファイル 2、補足ファイル 3、補足ファイル 4、 および 補足ファイル 5) として見つけることができます。
4. Githubからコードをダウンロードする場合は、 コード |ZIP をダウンロード し、README.md ファイルのインストール手順に従います。
5. Jupyter-Lab を起動します (補足ファイル 2):
   1. ターミナルに conda activate zmb-ibex-jove と入力して、インストールされたconda環境をアクティブ化します。
   2. ターミナルで、 たとえばcd C:\path\to\zmb-ibex-joveと入力して、ダウンロードしたディレクトリに移動します。
   3. ターミナルに 「jupyter-lab」 と入力して、Jupyter-Labを起動します。ブラウザウィンドウが開き、jupyter-labが表示されます。
6. 照明補正を計算します。
   1. 左側のタブで、「 examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb」ノートブックに移動し、 ダブルクリック して開きます。このノートブックは、BaSiCPyライブラリ(補足ファイル3)を使用して、照明補正画像を計算します。
   2. 「base_dir」と「save_dir」を正しいパス、データの配置場所、照明補正画像の保存場所に変更します。
   3. ノートブック内でコードを実行するには、各セル を選択し 、 Shift + Enter キーを押して実行します。ノートブックを上から下に実行します。
7. 個々のサイクルごとにステッチを実行します(補足ファイル4)。
   1. 左側のタブ で、次の ノートブックに移動して開 きます : "02_stitching_MD.ipynb"。このノートブックでは、サイクルごとに個々のタイルがロードされ、照明が補正され、つなぎ合わせられ、ウェルとサイクルごとに 1 つの画像ファイルが作成されます。ステッチには m2stitch ライブラリ (https://github.com/yfukai/m2stitch) を使用します。
   2. 最初のセルの入力を正しいファイルパスに変更します。ノートブックを上から下に再度 実行 します。
8. サイクル間の画像登録を実行します(補足ファイル5):
   1. 左側のタブで、次の ノートブックに移動して開 きます : "03_registration_pcc.ipynb"。このノートブックでは、オープンアクセスのscikit-imageライブラリ(https://scikit-image.org/)の位相相互相関アルゴリズムで計算される並進変換のみを使用して、個々のサイクルが互いに整列されています。
   2. 最初のセルの入力を正しいファイルパスに変更します。使用する基準サイクルと基準チャネル (通常は DAPI) を選択します。ノートブックを上から下に再度 実行 します。
      注: 「オプション 1: すべてのチャンネルをまとめてロードして保存する」と「オプション 2: チャンネルを個々のファイルとしてロードして保存する」の章の 1 つだけを実行する必要があります。最初の章では、すべてのサイクルのすべてのチャンネルを含む1つの大きなファイルを作成します。2 番目の章では、チャネルごとに個別のファイルを作成します。2 番目のオプションでは、処理に必要なメモリが少なくなります。

9. 画像解析(2日目)

1. Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads) をダウンロードして開きます。
   注:結果の画像は、3D画像として分析できるマルチプレーンおよびマルチチャネル画像になります。ここでは、2Dデータのみの解析ワークフローの例を示しており、最初に最大強度投影法が計算されます。
2. フィジーでファイルをフィジーウィンドウにドラッグして開きます。
3. [ 画像] |スタック |Z プロジェクト...をクリックし、[ 最大強度]を選択して、[ OK]を押します。 ファイル |名前を付けて保存 |OME-TIFF」と書かれています。
4. 細胞を分析するには、オープンソースソフトウェアQuPathを使用します。https://qupath.github.io/ からダウンロードしてインストールします。
5. QuPathを開き、空のフォルダをウィンドウにドラッグして新しいプロジェクトを作成します。
6. すべてのファイルを QuPath ウィンドウにドラッグし、標準設定で [インポート] を押して、すべてのファイルをプロジェクトにインポートします。
7. 左側のパネルで画像をダブルクリックして開きます。プロンプトが表示されたら、蛍光として指定します。
8. Shift+C を押して [明るさ/コントラスト] ウィンドウを開きます。
   注:ここでは、表示するチャンネルを選択し、明るさとコントラストを調整できます。名前をダブルクリックして、チャンネル名と色を変更することもできます。
9. ツール |ポリゴンツールをクリックし、組織領域に注釈を付けます。[注釈] タブで新しい注釈を探します。注釈を選択し、クラス(例:Other)を選択して、[クラスの設定]を押して、特定のクラスに設定します。
10. 細胞の検出:分析に移動 |細胞検出 |細胞検出。
    1. 核チャネルを選択します。
    2. ほとんどの設定はそのままにしておきますが、マウスを核の上に置き、右下隅に表示される強度に注意して、 しきい値を 調整します。背景領域にカーソルを合わせ、強度をもう一度記録します。しきい値として、背景と前景の中間の値を選択します。
    3. [実行] をクリックします。
11. 細胞と測定値の検査:
12. セルをダブルクリックするか、[階層]タブでセルを選択して、左下のパネルでその測定値を調べます。細胞、核、および細胞質に対して異なる形状と強度の測定を追加する必要があります。
13. セルを分類します。
    1. 検出された細胞をチャネル内の強度に従って分類するには、 分類 |オブジェクトの分類 |単一の測定分類器を作成します。
    2. [ チャネルフィルター] で目的のチャネルを選択し、[ 測定] で適切な測定値を選択します(例: セル:チャネル平均)。
    3. しきい値を調整するには、正のセルと負のセルに再度カーソルを合わせ、2 つのセルの間の値を選択します。
    4. たとえば、しきい値を超える場合は「正」を選択し、「しきい値を下回る」の場合は「負」を選択します。ライブプレビューをチェックして結果を確認します。
    5. [ 適用] を押してセルを分類します。
14. 注釈付きのオブジェクト(神経束など)までの距離を測定します。
    1. ツール |ブラシツール。
    2. 関心のある領域(神経束など)を描画します。
    3. [注釈] タブに移動します。すべての新しい注釈を選択し、対応するクラスを選択して、[クラスを設定]を押します。
       注:クラスウィンドウを 右クリック して [追加/削除] |クラスを追加します。
    4. 空間解析の 解析 |アノテーション 2D までの符号付き距離を選択し 、プロンプトが表示されたら [はい ] を押します。
    5. 各セルに新しい測定値を追加し、特定のクラスの最も近い注釈までの距離を示します。
15. 測定値のエクスポート:
    1. 測定に移動 |検出測定値を表示 し、すべての検出のすべての測定値のリストが表示されるのを待ちます。
    2. [ 保存] ボタンを使用してテーブルを.txtとしてエクスポートします。
    3. 選択したデータ処理ソフトウェアにデータをインポートして、さらに分析します。

Results

この方法では、固定凍結マウスの皮膚切片でEdU Click-iTケミストリーとIBEXを組み合わせることにより、増殖細胞型を適切に検出できます。増殖細胞型の検出は、さまざまな方法論、特にKi-67抗体による増殖細胞型の標識と、EdU Click-iTケミストリーアプローチを使用した細胞増殖の検出を使用して比較されました(図1)。Ki-67抗体標識は、固定凍結マウス皮膚切片の増殖細胞の数を過小評価しているのに対し(図1B、D)、EdUの取り込みは増殖細胞の数を適切に反映していることが観察されました(図1A、C)。EdUの取り込みによって得られた結果は、フローサイトメトリーの結果(図1G)およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片上のKi-67免疫標識(

Discussion

細胞増殖は皮膚修復の 4 つの主要な段階の 1 つであり、炎症期と増殖期の間の移行は、修復プロセスを成功させるために重要です²⁰。炎症が長引くと、世界的な健康問題である慢性創傷につながる可能性があるため、適切に調節された免疫応答が不可欠です^1,21。増殖は重要な生物学的プロセスであり、組織の修復だけでなく、生物の発生や発がんを含む疾患の評価にも重要です。細胞増殖を測定するには、細胞をカウントすることによって間接的に、またはKi-67やDNA組み込み試薬などのマーカーによる免疫標識によって直接測定するために、さまざまな方法論が存在します。診断ツールとして広く使用されている Ki-67 免疫標識は、がん患者の診断と予後に適用される Ki-67 標識指数の開発につながりました 22,23,24。<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗体と試薬、nbsp;	源	識別子	コメント
<強い>抗体<強い>
CD31 Alexa Fluor 647(サイクル2)	バイオレジェンド	猫#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488(サイクル2)	バイオレジェンド	猫#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC(サイクル1)	バイオレジェンド	猫#151212	1:50
AB_2814055
Ki-67チキン(ck)	LSBio	Cat#LS-C772946	1:800
Ki-67 ラット(RT)	バイオレジェンド	猫#652402	1:100
AB_11204254
ニューロフィラメントH&M(NF-H/NF-M)アレクサ・フルー647(サイクル3)	バイオレジェンド	猫番号#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR(サイクル1)	細胞シグナル伝達技術	Cat#8238                      AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488(サイクル3)	バイオレジェンド	猫#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 ロバアンチウサギ	ジャクソン免疫研究	猫番号#711-605-152
Reagentsnbsp;
セルヴィス24井ガラス底板	セルヴィス	P24-1.5H-N
クロムアルムゼラチン	ニューカマー・サプライ	カタログ#1033A
Click-iT EdUキット	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	C10637
ホエヒスト 33342	シグマ・オルドリッチ	カタログ#14533;CAS# 23491-52-3
LiBH4、リチウムホロヒドリド、95%	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫#10438443
ティッシュテック O.C.T コンパウンド サクラ	バイオシステムズ・スイス	猫番号#7109-4583
PBS	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	カタログ#10010-015
Superfrost Plus接着顕微鏡スライド	エプレディア	猫#J1800AMNZ
トライトン X-100	シグマ・オルドリッチ	猫#T8787
<ストロング>装備
ヘアブラシ	ファウストAG	猫#9172051と9172050
ミクロトームブレードとnbsp;	バイオシステムズ・スイス	猫#207500011
顕微鏡	分子デバイス、ImageXpressコンフォーカル HT.ai
オーブン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	猫#HBMCR4220
ロッカーシェーカー	エドマンド・ブームル;ヘラー有限会社	猫#32310015