便定量ポリメラーゼ連鎖反応解析による ヘリコバクター・ピロリ 菌感染と抗生物質耐性の検出

サマリー

このプロトコルは、定量的ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた非侵襲的な便サンプリングを採用して、 ヘリコバクターピロリ 感染とそのクラリスロマイシンおよびキノロンに対する耐性の便利で迅速な診断方法を提供します。

要約

ヘリコバクター・ピロリ菌(H. pylori)は世界中で広く蔓延しており、世界人口の約50%がピロリ菌に感染した経験があります。中国では、感染率は40%から70%の範囲です。ピロリ菌は、主に慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などの胃腸疾患に関連しています。現在、ピロリ菌感染症の臨床治療には、三重または四重療法が含まれます。しかし、抗生物質の広範な使用により、ピロリ菌の抗生物質耐性が発症しました。したがって、ピロリ菌とその抗生物質耐性の両方を検出することは、臨床治療を導くために重要です。

ピロリ菌の診断方法には、尿素呼気検査(UBT)、抗原検査、血清学的抗体検査、内視鏡検査、迅速ウレアーゼ検査(RUT)、および細菌培養が含まれます。最初の3つの方法は非侵襲的ですが、細菌の回復を許さないため、耐性試験には使用できません。後者の3つの方法は、侵襲的で高価であり、高度な技術的専門知識を必要とし、患者に害を及ぼす可能性があります。

したがって、 ピロリ菌 感染と抗生物質耐性を同時に検出するための非侵襲的で迅速な方法は、 ピロリ菌の効果的な根絶にとって臨床的に最も重要です。この論文は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)と TaqMan 蛍光プローブ技術を組み合わせて、 ピロリ菌 感染と抗生物質耐性を迅速に検出する特定のプロトコールを紹介することを目的としています。この方法は、従来の細菌培養や他の技術とは異なり、 ピロリ菌 の感染と耐性を診断するための便利で迅速、かつ非侵襲的な方法を提供します。qPCRは、クラリスロマイシンとキノロンに対する耐性にそれぞれ関連する23S rRNA遺伝子と gyrA 遺伝子の感染を特定し、変異を検出するために使用されます。従来の培養技術と比較して、このアプローチは、 ヘリコバクター・ピロリ 菌感染を検出し、その抗生物質耐性を決定するための非侵襲的で費用対効果が高く、時間効率の良い方法を提供します。

概要

ヘリコバクター・ピロリ は、グラム陰性のらせん状の細菌で、ヒトの胃上皮¹に持続的に感染する可能性があります。1994年、世界保健機関(WHO)はピ ロリ菌 を胃がんのグループ1発がん物質に分類し、最終的に感染者の~3%が発症しました²。最近発表されたシステマティックレビューでは、過去10年間に ピロリ菌 の抗生物質耐性率の増加の一般的な傾向が観察され、特にクラリスロマイ^{シン耐性が}世界的に驚くべきレベルに達していることが示されました3。中国では、最新の調査データによると、中国の都市部の人々の間で のピロリ菌 の総有病率は27.08%です。クラリスロマイシンおよびレボフロキサシンの耐性率は50.83%および47.17%⁴であり、米国(レボフロキサシン37.6%、クラリスロマイシン31.5%)⁵およびヨーロッパ(レボフロキサシン15.8%およびクラリスロマイシン21.4^%)6よりも高くなっています。そのため、早期かつ正確な診断と治療が重要です。しかし、 ピロリ菌 の抗生物質耐性の増加は治療効果を大幅に低下させ、その診断と治療に関する継続的な研究が緊急に必要であることを強調しています。

ピロリ菌の診断方法は、侵襲的技術と非侵襲的技術に分類されます⁷。侵襲的な方法には、病理組織学的検査、迅速ウレアーゼ試験(RUT)、および細菌培養⁸が含まれます。病理組織学的検査は、生検サンプルの処理と顕微鏡観察に依存しており、組織学的調製と病理学の専門知識によって精度が制限されます⁹。RUTは、尿素を加水分解してアンモニアを生成するウレアーゼの活性を通じてピロリ菌を検出し、試薬にアルカリ性シフトをもたらすため、細菌⁹の存在を示します。シンプルで費用対効果が高いです。「ゴールドスタンダード」とされる細菌培養は、ピロリ菌¹⁰の特有の生理学的特性により、成功率が50%を下回ることがよくあります。

非侵襲的な方法には、13C/14C尿素呼気検査(UBT)、血清学的診断、および便抗原検査(SAT)¹¹が含まれる。呼気検査はRUTと同様の原理で作動し、呼気中の同位体標識されたCO₂ を検出し、感染を確認する¹²。血清学的診断では、細菌の根絶後も持続する可能性のある抗体が検出されるため、治療効果の評価が困難になります¹³。便抗原検査は、糞便サンプル中の ピロリ菌特異的抗原を検出し、偽陽性率が低く、活動性感染症の診断精度が高い信頼性の高い非侵襲的方法を提供します¹⁴。

各診断方法には、それぞれの利点と制限があります¹⁵。細菌培養以外にも、抗生物質耐性の検出に苦労している方法があり、培養の成功率の低さが阻害されている¹⁶。近年、リアルタイム定量PCR(qPCR)などの分子診断法が微生物検出に広く適用されている¹⁷。qPCRは 、ピロリ菌 を正確に検出し、耐性遺伝子の突然変異を解析することができ、感染のより包括的なビューを提供します¹⁸。

蛍光プローブは、qPCRプロセス中にDNAの標的配列に特異的に結合するように設計されています。これらのプローブは通常、蛍光色素で標識されており、プローブが標的に結合するとシグナルを発し、増幅中にポリメラーゼによって切断されます。これにより、PCRプロセスのリアルタイム測定が可能になります。蛍光プローブは、プローブのユニークな設計により、標的DNA配列のみが検出され、非特異的結合の可能性を減らし、アッセイ特異性を向上させるため、高い特異性で知られています。これにより、蛍光プローブ技術は、糞便サンプル中の ヘリコバクターピロリ DNAなどの微量ターゲットの検出に特に有用です。SYBR GreenはPCRで一般的に使用されるDNA結合色素ですが、任意の二本鎖DNAに結合できるため、非特異的な増幅や偽陽性が発生する可能性があります。

臨床サンプルから ヘリコバクター・ピロリ 菌を培養しても、抗生物質耐性のデータを直接得られるわけではありません。対照的に、蛍光プローブベースのqPCRは、より迅速で便利であり、 ピロリ菌 と抗生物質耐性マーカーの同時検出に適応できます。この方法は、従来の培養方法よりも迅速な結果が得られるだけでなく、抗生物質耐性遺伝子の同時検出も可能にし、検出効率と利便性を大幅に向上させます。この方法は、従来の細菌培養や他の技術とは異なり、 ピロリ菌 の感染と耐性を診断するための便利で迅速、かつ非侵襲的な方法を提供します。

ピロリ菌の抗生物質耐性については、i)遺伝子型と表現型の一貫性、ii)多剤耐性という2つの重要な問題を考慮する必要があります。中国での大規模な多施設研究では、クラリスロマイシン/レボフロキサシンの二重耐性パターンは26.1%であることがわかりました。クラリスロマイシン耐性およびレボフロキサシン耐性Hピロリの表現型および遺伝子型は、満足のいく一致を示した(κ係数=それぞれ0.810および0.782)¹⁹。したがって、qPCR法を使用してピロリ菌の感染と薬剤耐性を検出することは可能です。糞便抗原検査(SAT)やqPCR法は、サンプリングの利便性からますます利用されるようになっています。H. pylori 検出法の感度、特異性、および精度は、qPCR > UBT > SAT > RUT>CagA IgG >培養²⁰ です。すべての非侵襲的方法は、一次スクリーニングに適しています。qPCRはさらに薬剤耐性遺伝子を検出できるため、qPCRと培養は治療の指導により適しています。

人工知能(AI)アルゴリズムと内視鏡画像²¹、デジタルマイクロ流体工学²²、RPA-CRISPR/Cas12a23を組み合わせたその他の革新的なアプローチは、理論的には良好な診断効率と有望な応用の見通しを示しています。しかし、qPCRは現在、最も洗練された分子生物学的手法であり、ピロリ菌感染症の診断と治療に優れたソリューションを提供できる可能性があります。

プロトコル

この研究は、中国広州市南医科大学広東省人民病院の倫理委員会によって確立された倫理ガイドラインに準拠しています (承認番号: KY2024-445-01)。本研究で使用した材料(試薬、化学薬品、装置、ソフトウェア)の詳細については、 材料表をご覧ください。

1. 参加者の選考

1. 18歳から60歳までの参加者をお選びください。
2. 胃炎、消化性潰瘍、消化不良などの症状を呈する患者や無症状の個人など、 ヘリコバクターピロリ 感染スクリーニングを受ける可能性のある参加者を選択してください。
3. 抗生物質、ビスマス含有薬剤 (クエン酸ビスマスカリウムカプセル、コロイド状ビスマスペクチンカプセル、ビスマス-アルミニウム化合物錠剤など)、または抗菌漢方薬を使用した患者、またはプロトンポンプ阻害剤またはH2受容体拮抗薬を使用した患者 過去 2 週間以内にオメプラゾール、パントプラゾール、ラベプラゾール、シメチジン、ニザチジンなど)。また、月経期間中の女性も研究から除外します。

2.糞便サンプルの収集

注:セクション2を参加者への指示として提供します。

1. Sampリングキットの外装に損傷がなく、有効期限内であることを確認してください。キットから材料を取り出します。
2. 便器に白い糞便収集紙を置き、排便します(尿による汚染を避けるため)。
3. へらを使用して、ソラマメとほぼ同じサイズ(~5 g)の糞便の一部を収集し、サンプル容器に移します。
4. サンプリングスパチュラを糞便サンプルと一緒に収集チューブに入れ、液面がチューブに示されているサンプリングラインの近くまで上昇することを確認します。
5. チューブキャップをしっかりと締めます。チューブを数回反転させて、サンプルが防腐剤溶液と完全に混合されるようにします。
6. サンプルは、 ピロリ菌 の次の同定とqPCRによる抗生物質耐性プロファイルの評価のために臨床検査室に配送されるまで冷蔵下で保管します。

3. 核酸抽出

注意: 汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネット内ですべての手順を完了してください。

1. 試料保存チューブを反転させ、十分に混合します。糞便検体溶液1.0mLを微量遠心チューブに移します。
2. 遠心分離管を混合した後、80°Cの金属浴に10分間入れ、5分後に30秒間断続的に混合します。チューブが室温まで冷えたら、10,000 × g で5分間遠心分離し、上清を回収してさらに処理します。
3. 96ウェルプレートを複数回反転させて、磁気ビーズを再懸濁します。アルミホイルシールは、こぼれないように揺れないように注意しながら、慎重に取り外します。
4. 調製したサンプル(ステップ3.2)200 μLを、溶解バッファーを含む96ウェルプレートの各ウェルに加え、各ウェルが1つのサンプルに対応するようにします。96ウェルプレートを核酸抽出装置の指定サンプルコンパートメントに入れて、自動抽出を行います。
5. 残った検体と抽出した核酸サンプルは、長期保存および将来の使用のために-20°Cで保管してください。

4. ヘリコバクター・ピロリ 核酸のqPCR検出とクラリスロマイシンおよびキノロンに対する耐性変異

1. 試薬保管場所から試薬を取り出し、室温で解凍してください。
   注:このキットは、23S rRNA遺伝子(A2143G、A2143C、A2144G)およびgyrA遺伝子(261A、261G、260T、271A、271T、272G)の突然変異を含む、H.ピロリ核酸の定性検出に使用されました。プライマー、プローブ、Taq酵素、UNG酵素、およびdNTPはキットに含まれていました。H.ピロリ菌とヒトβ-アクチンの標的遺伝子は、ポジティブ品質管理に含まれていました。ヒトβ-アクチン遺伝子を内部品質管理として選択しました。
2. 試験するサンプルの数に基づいて、凍結乾燥試薬のN + 2コピーを使用します(Nは試験するサンプルの数、2は陰性および陽性のQCを表します)。
3. 凍結乾燥粉末がチューブの底に沈殿するように、短時間遠心分離します。凍結乾燥試薬の蓋を開け(粉末がこぼれないように注意)、試験するサンプルから抽出した核酸のウェルあたり25μL、および陽性および陰性コントロールを加えます。チューブをしっかりと閉じます。
4. PCR試薬を8〜10秒間ボルテックスし、次に気泡の形成を避けるために3〜5秒間短時間遠心分離します。
5. 96ウェルqPCRプレートをqPCRマシンに置きます。サイクリングプログラムを次のように設定します:まず、反応混合物(プライマー、プローブ、Taqポリメラーゼ、UNG酵素、dNTPなどを含む)を42°Cおよび95°Cで2分間インキュベートします(両方のステップを1サイクルで)。次に、95°Cで10秒、65°Cで45秒で10xサイクルします。最後に、95°Cで10秒、58°Cで45秒で35倍サイクルを行い、変性、アニーリング、伸長を行います。
6. 蛍光シグナル検出パラメータを次のように設定します: H.ピロリ 保存遺伝子のROX蛍光標識。 H. pylori clarithromycin 耐性遺伝子の FAM 蛍光標識; H.ピロリ キノロン耐性遺伝子のHEX蛍光標識;ヒト β-アクチン遺伝子のCY5蛍光標識をキットの内部コントロールとして使用しました。58°Cでデータを収集します。 反応が完了したら、データが将来の分析のために保存されていることを確認してください。
7. qPCR専用のソフトウェアを使用してデータを解析すると、装置が自動的にベースライン閾値を選択します。 ヘリコバクター・ピロリ 菌の感染または耐性の存在を含むすべての診断基準をCT値≤30に設定します。それらが特徴的なS字型の曲線を示すことを確認します。

結果

糞便中のヘリコバクター・ピロリ感染と抗生物質耐性の検出のためのqPCRの応用
私たちは、 ヘリコバクター・ピロリ菌の保存遺伝子、23S rRNA遺伝子、 gyrA 遺伝子の点変異に基づいてプライマーとプローブを設計しました。これらのプライマーとプローブは、異なる蛍光色素で標識され、その後、qPCR検出に使用されました。qPCR 実験の品質管理結果は推奨範囲内にあり、信頼性の高い検出結果を示しました(図 1)。この研究では、実験プロトコルの信頼性を特徴付けるために、5つの代表的なサンプル(S1-S5)を選択しました(図2 および 表1)。S1は ピロリ菌 に感染していないサンプルですが、S2-S5は薬剤耐性プロファイルが異なるサンプルです。

ディスカッション

近年、分子検出法は微生物学の分野で広く適用されており、いくつかの感染症の臨床管理を大きく変えています。これらの方法は遺伝子レベルで機能するため、細菌の存在を確認するだけでなく、遺伝子タイピングや抗生物質耐性試験も可能になります。リアルタイム蛍光定量PCR(qPCR)は、処理時間が短く、感度と精度が高く、クロスコンタミネーションのリスクが低いため、ますます好まれています。 ヘリコバクター・ピロリ 感染症の診断のために臨床検査室で広く使用されています。

糞便サンプル採取保存溶液と遺伝子検出法を組み合わせることで、 ピロリ菌 の迅速かつ効率的なスクリーニングが可能になり、クラリスロマイシン23S rRNA遺伝子とキノロン gyrA 遺伝子の変異の解析によるさらなる抗生物質耐性試験が可能になります。この方法では、 ピロリ菌 の感受性と薬剤に対する耐性を評価できます。従来の糞便抗原検出法では、抗原濃度が低いことや検体中の抗原分解により精度や安定性が低下す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA	バイオセーフティキャビネット
使い捨て糞便採取・貯蔵チューブ	モル		糞便検体採取
E-Centrifuge	WEALTEC		チューブ壁から残留液を遠心分離
ヘリコバクター・ピロリ核酸、クラリスロマイシン、キノロン耐性変異検出キット	モル		ヘリコバクター・ピロリ感染および抗生物質耐性の検出;凍結乾燥ピロリ菌試薬(プライマー、プローブ、Taqポリメラーゼ、UNG酵素、dNTPsなどを含む)、ピロリ菌の陽性対照(ヘリコバクター・ピロリとヒト&β-アクチン標的遺伝子を含む)、およびピロリ菌の陰性対照(ヒト&β;-アクチン標的遺伝子を含む)
ル96M自動核酸抽出器	モル		抽出用
核酸抽出キット	Mole		核酸を抽出します。溶解バッファー(グアニジン塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、Tween-20、塩化ナトリウム)、洗浄バッファー1(塩化ナトリウム)、ウォッシュバッファー2(トリスヒドロキシメチルアミノメタン、Tween-20)、ウォッシュバッファー3(磁気ビーズ、Tween-20)、ウォッシュバッファー4(ヌクレアーゼフリー水)、溶出バッファー(トリスヒドロキシメチルアミノメタン)、および磁気ラック
SLAN 全自動医療用PCR分析システム	HONGSHI		データ解析
SLAN-96S リアルタイム PCR 装置	HONGSHI		蛍光定量 PCR 増幅
超低温冷凍庫 (DW-YL450)	MELING	SEDA	20172220091-20 >試薬保存用C
Vortex-5	Kylin-bell		薬混合用

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