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方法論記事

腫瘍組織からの自然放出エクソソームの収集

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DOI:

10.3791/67739

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2025年6月10日

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1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、腫瘍組織からエキソソームを自然に放出し、繰り返し収集することでエキソソームを抽出する新しい方法を示しており、腫瘍発生におけるエキソソームの機能を研究するための実験的基礎を提供します。

要約

エクソソームは、細胞から分泌される小胞として、さまざまな核酸、タンパク質、脂質を包囲して移動させ、異なる細胞間のコミュニケーションに関与しています。腫瘍微小環境中のエクソソームは、腫瘍細胞の生物学的特性に重要な役割を果たし、他の細胞の状態に強く影響を与える可能性があります。したがって、腫瘍の発生におけるエクソソームの特定の機能をさらに研究するためには、腫瘍組織からエキソソームを抽出して単離することが必要であることは間違いありません。腫瘍組織からのエキソソームの直接抽出は、 in vitro 細胞培養の必要性を減らし、腫瘍組織からのエキソソームは自然状態のものにより類似している可能性があります。したがって、腫瘍組織中のエクソソームの自然な状態を維持することが、抽出プロセスの鍵となります。酵素消化は、腫瘍組織からエキソソームを抽出するために、しばしば超遠心分離と組み合わされます。ここでは、腫瘍組織からエクソソームを抽出する新しい方法を提供します。無血清培地を用いて、小さな腫瘍組織片をシェーキングテーブル上でインキュベートし、腫瘍組織から自然に放出されるエクソソームを繰り返し採取・抽出し、抽出したエクソソームの構造、濃度、特性を同定することで、腫瘍発生におけるエクソソームの機能を研究する研究者に新たな方法を提供しました。

概要

エクソソームは、細胞によって分泌される細胞外小胞のサブタイプであり、通常、サイズは30 nmから200 nmの範囲です1,2。それらは細胞間コミュニケーションに関与し、核酸(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、マイクロリボ核酸(miRNA)、長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)、環状RNA(circRNA))、タンパク質、および脂質1,3,4,5を含むさまざまなシグナル伝達分子をレシピエント細胞に送達して、それらの生理学的機能6,7に影響を与える。エキソソームは、最初はヒツジの網状赤血球8で同定され、その後、血液、唾液、尿、脳脊髄液、腹水、羊水、母乳などのさまざまな体液から同定されている9,10,11,12,13,14,15,16 .さらに、エクソソームは、リンパ球、マクロファージ、肥満細胞、脂肪細胞、および腫瘍細胞17を含む多くの種類の細胞によって分泌され得る。その広範な分布により、エクソソームは、さまざまな病理学的プロセス、特に癌、および胚発生、組織の修復と再生、免疫調節などのさまざまな生理学的プロセスで重要な役割を果たします18,19,20。

近年、エクソソームは、腫瘍の発生、浸潤、転移、化学療法抵抗性、および抗腫瘍免疫または腫瘍促進免疫を促進することが示されています20,21,22。がん由来のエクソソームは、受容体または隣接するがん細胞の遺伝子発現を活性化して生物学的表現型を変化させることができ、がん細胞は腫瘍微小環境の間質細胞と相互作用して、がん細胞の増殖、浸潤、および血管新生を促進することができる23,24,25。腫瘍細胞によって放出されるエクソソームは、腫瘍細胞が有毒な薬物を排泄するのを助けることができ、間質細胞由来のエクソソームは、がん細胞の形成を促進することができる20。がん由来エクソソームは、がん細胞の転移の様々な段階に関与しており、これには隣接組織への浸潤、循環器系を介した移動、遠隔臓器への転移などが含まれる20。最後に、エクソソームは、それらが運ぶリガンド、タンパク質、およびmiRNAに応じて、癌における免疫活性化機能と免疫抑制機能の両方を実行します20。腫瘍組織由来エクソソームの重要な機能のために、それらは腫瘍の早期診断、正確な治療、および予後モニタリングに潜在的な応用価値を示しています21,22。

腫瘍組織由来エクソソームの重要性を考えると、多くの研究者がその特性と機能をさらに研究するためにそれらを抽出しようと試みてきました。腫瘍組織からエキソソームを直接抽出すると、in vitro細胞培養の必要性が減るだけでなく、エクソソームの自然な状態により近くなります。したがって、腫瘍組織中のエクソソームの自然な状態を維持することが、抽出プロセスの鍵となります。エキソソームの物理的特性は、一般的な抽出方法の基礎であり、抽出プロセス中の刺激によって引き起こされるエキソソーム成分の変化が考慮されることはめったにありません。実際、エキソソームの品質は、異なるエキソソーム抽出手順26,27によって強く影響を受ける。現在、腫瘍組織は酵素によって消化され、密度勾配遠心分離、超遠心分離、限外ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、ポリマー沈殿、免疫親和性クロマトグラフィー、およびマイクロ流体法などの方法に供されてから、分離2,21,28,29 .ここでは、腫瘍組織からエクソソームを抽出する方法を提供します。無血清培地を用いて小さな腫瘍組織ブロックをシェーカーで培養し、腫瘍組織から自然に放出されるエクソソームを採取して抽出し、抽出したエクソソームの濃度と特性を同定し、腫瘍発生におけるエクソソームの機能を研究するための基礎材料と実験的証拠を提供しました。

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プロトコル

すべての腫瘍組織エクソソーム関連の実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。この研究は、四川大学西中国病院の倫理委員会のガイドラインによって承認および実施されました (20220301101)。SGC-7901細胞の接種から4週間後、1匹のヌードマウス(BALB/c、雄、8週齢、26g)を子宮頸部脱臼により安楽死させた。

1. 腫瘍組織の取得

  1. 75%アルコールに5分間浸します。
  2. 滅菌手術台に移動し、滅菌手術用ハサミを使用して子宮外腫瘍の外皮を開きます。
  3. 異所性腫瘍組織をはがし、次に切開して秤量し、同じ重量の2つの部分を得る。
    注:腫瘍組織の1片は、このプロトコルの下でエキソソーム抽出に使用され、等しい重量の腫瘍組織の別の片は、酵素消化30によるエキソソーム抽出に使用される。

2. 腫瘍組織のプレコンディショニング

注意: これらの手順は、氷上および無菌環境で実行します。

  1. 予冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(0.01 M)10 mLをピペットで注入し、腫瘍組織を洗浄して表面の血液と脂肪を除去します。
  2. 腫瘍組織 (~400 mm 3) を 20 mL の PBS と 2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を入れた 10 cm の滅菌シャーレに、眼科用ハサミを使用して腫瘍組織 (~400 mm3) を 1 〜 2 mm に切断します。上記の混合物を50mLのコニカルチューブに移します。

3. エクソソームの放出

  1. ステップ1.2のチューブを200 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  2. 上清を捨て、ペレットを20 mLのMinimum Essential Medium α(α-MEM)培地で再懸濁します。37°C、100rpm、恒温シェーカーで1時間インキュベートします。
  3. 200 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  4. 上清を捨て、ペレットを10mLのα-MEM培地で再懸濁します。37°C、100rpmで6時間、恒温シェーカーでインキュベートします。
    注意: すべてのステップで優しくしてください。短時間のインキュベーションとα-MEM培地での1回の洗浄で、細胞内小胞や細胞小器官など、切断によって漏れる細胞内成分を十分に除去できます。
  5. 200 × g で5分間、4°Cで遠心分離し、上清を新しいチューブに回収します。
  6. 腫瘍組織を10 mLのα-MEM培地で再懸濁します。.
  7. ステップ2.4からインキュベーションを繰り返し、続いてステップ2.5を繰り返します。
  8. ステップ2.5と2.7で収集した培地の上清を混合します。
    注意: すべてのステップで優しくしてください。2回の6時間インキュベーションにより、腫瘍組織片からのエキソソームの自然な放出が誘導されました。

4. 超遠心分離

  1. 0.45 μmの微多孔質フィルターで上清をろ過します。
  2. 上清を12,000 × g で4°Cで30分間遠心分離し、大きな小胞を除去します。
  3. 上清を新しいチューブに移し、120,000 × g で4°Cで90分間遠心分離し、エキソソームを収集します。
  4. エキソソーム沈殿物をPBS(0.01 M)で洗浄し、再度140,000 × g で4°C、60分間遠心分離します。
  5. 沈殿したエキソソームをPBS(0.01 M)に懸濁して、すぐに使用または-80°Cで保存します。
    注意: すべてのステップで優しくしてください。各ステップを可能な限り最小の遠心力と最短の遠心時間で実行します。

5. エクソソーム同定結果の発表

  1. 透過型電子顕微鏡(TEM)30により、腫瘍組織からのエクソソームの形態を同定する。
  2. ナノ粒子追跡分析(NTA)30により、腫瘍組織からのエクソソームのサイズと濃度を決定する。
  3. エキソソームタンパク質マーカーCD9およびCD63をウェスタンブロット(WB)30で同定する。
    注:エキソソームマーカー31の基準としてCD63、CD9の使用を含む、エキソソーム研究のための最近のガイドライン。

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結果

TEMは、この方法によって腫瘍組織に由来するエクソソームが典型的なカップ状構造(図1A)を持ち、この方法で抽出されたエクソソームの形状と酵素消化によって抽出されたエクソソームとの間に有意差がないことを明らかにしました(図1B)。NTAの結果、平均エキソソーム直径は172.8 nmであり、これは30〜200 nmの範囲にあり、エクソソームのサイズと一致していることが明らかになりました。粒子濃度は 5.9 × 106/mL でした(図 1C)。酵素消化によって抽出されたエクソソームの平均直径は175.5nmであった。粒子濃度は 1.7 × 106/mL でした(図 1D)。WBの結果は、腫瘍組織に由来するエキソソームの表面にマーカータンパク質CD9およびCD63が発現していることを明らかにし、これはエクソソームのタンパク質特性と一致していました(

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ディスカッション

この方法では、ヌードマウスの異所性胃がん組織から腫瘍組織に由来するエクソソームを抽出し、エクソソームの放出、滲出、分離、精製をキーステップとしました。エキソソーム2,21,28,29の物理的特性および組成に応じて、様々なエキソソーム分離方法が設計および検証されており、それぞれに長所と短所があるが、その目的は、異なるエキソソーム抽出手順がエキソソーム特性26,27に与える影響を最小限に抑えることである。Theryらは、最初にエクソソーム分離のための古典的な超遠心分離法を提案し32、それ以来、示差超遠心分離もまた、80%以上の使用率で、エキソソーム分離のため...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、四川省科学技術支援プログラム(2024NSFSC0592、2023YFS0064)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
α-MEMHyCloneSH30265.01B
抗CD63抗体Biossbsm-43117M
抗CD9抗体Biossbs-2489R
遠心分離管Thermo339650
恒温シェーカーThermoMAXQ4450
使い捨て滅菌ピペット-10mLJET
EDTAバイオシャープBS107
電動ピペットサーモ9501
水平制御温度遠心分離機サーモソルバル ST1R プラス
ナノ粒子追跡分析装置マルビンナノサイト プロ
眼科用ハサミジンチョン Y3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
リンタングステン酸  シグマ455970-10G
外科用ハサミ
二次抗体BiossBs-0295Gヤギ抗ウサギIgG H&L/FITC
透過型電子顕微鏡ニコンプランアポWF
超遠心管ベックマン355618
GSP01001JinzhongJ21010

参考文献

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