マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いたペルメチル化ムチン O型糖鎖のプロファイリング

サマリー

ここでは、ムチンからの O型糖鎖の遊離と、その後の脱塩、過メチル化、およびMALDI-TOF質量分析法を用いた分析の詳細なプロトコールを紹介します。

要約

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)は、ムチン糖鎖のプロファイリングのための強力なツールであり、高い感度とスループットを提供します。ここでは、MALDI-TOF MSを用いたムチン由来 のO結合型糖鎖の解析について、糖鎖の放出、脱塩、過メチル化、データ取得と解析を含む詳細なプロトコールを提供します。この研究は、イオン交換クロマトグラフィーに基づく脱塩が、多孔質黒鉛化炭素(PGC)を用いた固相抽出と比較して、より大きな糖鎖の回収率を向上させ、生成されたスペクトルの品質を向上させることを示しています。さらに、この研究は、シアル化構造の効率的な修飾のためには、現在採用されているよりも長いペルメチル化反応時間が必要である可能性があることを示唆しています。また、糖鎖の組成と構造を正確に同定するためには、フラグメンテーションデータと O型糖鎖生合成経路に関する事前知識の重要性と必要性を示し、MALDI-TOFがムチンO型糖鎖の分析にもたらす固有の利点と限界について説明します。

概要

ムチンは、粘液の構造成分の大部分を構成する大きな糖タンパク質です。それらは、杯細胞と呼ばれる特殊な上皮細胞によって産生され、粘膜表面で分泌される前に広範なO-グリコシル化を受けます。ムチンのグリコシル化はゴルジ装置で行われ、特殊なグリコシルトランスフェラーゼのファミリーであるポリペプチド-N-アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ(ppGalNAc-T)が、GalNAc残基をセリン(Ser)またはスレオニン(Thr)¹に結合することによりプロセスを開始します。次に、糖転移酵素の兵器庫にガラクトース(Gal)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、GalNAc、N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)、フコース(Fuc)残基を添加して糖鎖構造を拡張し、他の糖質修飾酵素が糖鎖の硫酸化などの反応を行うことができます¹。ムチンタンパク質骨格を飾る糖鎖は、主にSer残基とThr残基が豊富なタンパク質領域のクラスターに見られ、これらの残基の側鎖の水酸基はO-グリコシル化部位として機能します。この緻密なグリコシル化により、ムチンは「ボトルブラシ」のような外観になり、大量の水分を保持する能力、ゲル形成能力、高い粘弾性などの物理的特性に関与しています^2,3。これらの特性により、ムチンは潤滑を提供し、上皮を脱水症や身体的損傷から保護し、上皮とその微小環境との間に物理的な障壁を形成します^4,5。ムチン糖鎖は、共生細菌または病原性細菌^6,7,8の結合部位および炭素源としても機能します。粘液の組織と組成は、微生物を上皮表面から近づけず、遠ざけることにより、上皮を保護するのに役立ちます。ムチン糖鎖は、細胞間コミュニケーションと接着にも関与しています⁹。

ムチン糖鎖は粘膜の恒常性を維持する上で極めて重要な役割を果たしており、ムチン糖鎖修飾プロファイルの異常は、バリア機能障害、微生物叢組成の変化、腫瘍転移の増加、炎症性腸疾患(IBD)、およびその他の疾患と関連しています10,11,12。したがって、ムチンのグリコシル化の研究は、ヒトの健康における粘液およびムチンの役割を理解する上で重要であり、疾患の管理または治療への新しいアプローチにつながる可能性があります。

質量分析法に基づく手法は、ムチン糖鎖を研究するための最も一般的な選択肢の一つです。MALDI-TOF MSは、糖鎖や糖タンパク質などの大きな不揮発性生体分子の分析を可能にするソフトイオン化技術です¹³。このアプローチにより、高感度と広い質量範囲が得られるため、低濃度で多様な糖鎖混合物の検出と同定が可能になります。さらに、タンデム質量分析(MS/MS)実験から得られたフラグメンテーションパターンは、糖鎖組成と配列¹³に関する貴重な構造情報を提供することができます。

通常、MALDI-TOF MSによるムチン由来 のO結合型糖鎖の分析には、 O型糖鎖をまず還元 的β除去などの方法を用いてタンパク質骨格から化学的に放出し、次に脱塩して化学放出から塩を除去し、誘導体化してイオン化と検出を強化するという多段階のワークフローが含まれます。精製された誘導体化された糖鎖は、MALDIターゲットプレート上で適切なMALDIマトリックスと共結晶化され、無傷の糖鎖イオンの質量に関する情報を提供する質量スペクトルが取得されます。これに続いて、MS/MS実験で糖鎖を断片化し、糖鎖の構造に関する情報を得る¹⁴。ここでは、糖鎖の遊離、脱塩、および過メチル化のための詳細なプロトコールを提供し、それらをMALDI-TOF MSで分析します。

プロトコル

注: ワークフローの概略図については、 図 1 を参照してください。

図1:実験ワークフローの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 糖鎖の放出

1. β除去バッファーの調製
   注意: これは、毎回使用する前に新鮮に準備する必要があります。
   1. 水酸化ナトリウム(NaOH)のペレットを秤量し、50 mLチューブ内で適切な量のH₂Oに溶解して、0.1 M溶液を得ます。
   2. 5 mLチューブに、189 mgの水素化ホウ素ナトリウム(NaBH₄)を、上記でステップ1.1.1で調製したアルカリ溶液5 mLに溶解します。
      注意:NaOHは腐食性があり、NaBH₄ は腐食性、毒性、可燃性であり、健康に害を及ぼす可能性があります。どちらの化学物質も、適切な個人用保護具を使用してヒュームキャビネットの下で取り扱う必要があります。NaBH₄ は自己発火する可能性のある水素を分解して放出するため、H₂Oに直接溶解しないでください。
2. β除去反応のセットアップ
   1. 4 mLガラスバイアルに、最大100 μgの精製ムチンを250 μLのH₂Oに溶解します。
      注:一部のムチンは完全には溶解せず、代わりに非常に小さな粒子の懸濁液を形成する場合があります。
   2. β除去バッファー250μLを加え、PTFEライニングキャップでバイアルをしっかりと閉じます。反応を45^°Cで16時間インキュベートします。
3. 反応の停止
   1. 100 mLのガラス瓶に、5 mLの氷酢酸を95 mLのH₂O(5%(v / v)濃度)に加えます。.
      注意: これは室温で保存して再利用できます。 注意: 酢酸は可燃性で腐食性があるため、必要な個人用保護具と一緒にヒュームキャビネットで使用する必要があります。
   2. 氷上で、5%酢酸溶液1 mLを各反応(ステップ1.2.3)に滴下します。この時点で、過剰な_NaBH4からの水素の放出による発泡を探します。1mLの5%酢酸を添加しても発泡が止まらない場合は、この手順を繰り返します。
      注:5%酢酸を添加しても発泡性がない場合、 β除去反応が不完全または失敗する可能性があります。
4. サンプルの脱塩
   1. 100mLのガラス瓶に、5%(v / v)酢酸中の陽イオン交換樹脂、H ⁺ 形態、200〜400メッシュの高密度懸濁液を調製します。
   2. ガラスピペットに少量のグラスウールを差し込みます。樹脂懸濁液1.5mLをガラスピペットの上から加え、沈殿させて水気を切ります。これにより、脱塩カラムが作成されます。
   3. レジンを2mLの5%酢酸で洗浄します。フロースルーを破棄します。
   4. ムチンサンプルを脱塩カラムに加えます。フロースルーを5mLチューブに集めます。.
   5. サンプルバイアルを5%酢酸1 mLですすぎ、これを脱塩カラムにロードします。フロースルーを同じチューブに集めます。
   6. カラムを 1 mL の 5% 酢酸で 2 回洗浄します。フロースルーを同じチューブに集めます。
   7. 遠心蒸発器を使用して酢酸を除去し、サンプルを濃縮します(5 mbar、30 ^°C、2時間)。
   8. サンプルを-80 ^°Cで凍結し、凍結乾燥機で一晩乾燥させます。
      注:あるいは、遠心蒸発は乾燥し続けることができますが、サンプルの再溶解がより困難になります。
   9. 100 mLのガラス瓶に、5 mLの酢酸を95 mLのメタノール(5%(v / v)濃度)に加えます。.
      注意:メタノールは可燃性で有毒です。必要な個人用保護具を備えたヒュームキャビネットで使用する必要があります。
   10. サンプルを0.5 mLのメタノール酢酸に溶解し、サンプルを窒素流下で乾燥させます。この手順を3〜5回繰り返します。乾燥したサンプルを4 ^°Cで保存します。
5. 糖鎖の過メチル化
   1. 8 mLのガラスバイアルに、50%NaOH溶液(0.2 mL)を0.4 mLのメタノールと混合し、十分にボルテックスします。白い沈殿物が形成され、すぐに再び溶解します。
   2. ガラスシリンジを使用して、無水ジメチルスルホキシド(DMSO)4 mLを加え、十分にボルテックスします。
   3. 溶液を2,000 × gで2分間遠心分離します。これにより、チューブの底にゲルが形成され、中央に液相が形成され、上部に塩が蓄積されます。
   4. ゲルを乱さずに、上清と塩を慎重にデカントします。
   5. 塩が形成されなくなるまで、手順1.5.2-1.5.4を5回繰り返します。塩がチューブの壁に付着した場合は、チューブを静かに渦巻かせて、底のゲルを乱さずに塩を懸濁液にするか、ガラス製のパスツールピペットを使用して塩を取り除きます。
   6. これ以上塩が生成されなくなったら、ゲルを4mLの無水DMSOに再懸濁します。この懸濁液がパーメチル化塩基です。
      注:この量のペルメチル化塩基は、~25サンプルに十分です。それに応じて数量を調整できます。
   7. 乾燥したサンプルに、100 μL の無水 DMSO と 150 μL の過メチル化塩基を加えます。ガラスピペットを使用して、環境からの水分吸収を避けるために、できるだけ早く80μLのヨードメタンを加えます。
      注意:ヨードメタンは有毒であり、健康と環境に害をもたらします。必要な個人用保護具を備えたヒュームキャビネットで使用する必要があります。
   8. パーメチル化反応を室温で30分間、激しく振とうしながらインキュベートします。
   9. 0.5 mLのH₂Oを加えて反応を終了します。サンプルは曇りに変わります。
      注:サンプルが濁らない場合は、過メチル化反応が不完全であった可能性があります。
   10. サンプルが透明になるまで窒素で洗い流します。
   11. サンプルを親水性-親油性-バランス(HLB)96ウェル抽出プレート(60 mg)またはHLBカートリッジにロードします。正圧を加えて、~1 mL/分の流速でサンプルを固相に押し込みます。HLBカートリッジを使用する場合は、ゴム製の乳頭または真空マニホールドを使用してサンプルに圧力をかけます。フロースルーを破棄します。
   12. 2 x 1 mLのH₂Oでウェルを洗浄し、正圧を加えてフロースルーを廃棄します。
   13. 1 mLのメタノールを使用してHLBプレートから糖鎖を溶出します。圧力は、メタノールがプレートから出始めるまでです。そうすると、重力流は必要な流量を与えるのに十分です。フロースルーを収集します。
   14. 溶出ステップをもう一度繰り返します。
   15. 遠心蒸発器を使用してサンプルを乾燥させます
   16. 4 mLのガラスバイアルに、1 mLのアセトニトリル、998 μLのH₂O、および2 μLのトリフルオロ酢酸を混合してTA50バッファーを調製します。
       注意:アセトニトリルは可燃性で、トリフルオロ酢酸は腐食性です。どちらも、適切な個人用保護具を使用して、ヒュームキャビネットで使用する必要があります。
   17. 微量遠心チューブで、10 mgのスーパーDHB[2,5-ジヒドロキシ安息香酸と2-ヒドロキシ-5-メトキシ安息香酸の9:1(w / w)混合物]をTA50 1 mLに溶解してマトリックス溶液を調製します。
   18. 乾燥したサンプルを10 μLのTA50に溶解します。
   19. 1 μLのサンプルと1 μLのマトリックス溶液を混合し、スチール製MALDIターゲットプレートにスポットして乾燥させます。

2. サンプルのMALDI TOF分析

1. 親イオンデータを取得するための設定
   1. レーザーから50%の強度で1,000発発射する。
      注意: これらは、グローバルな機器設定によって異なる場合があり、必要に応じて調整できます。
   2. [レーザーキャリア]タブで、ランダムウォーク設定を[サンプル完了]に設定します。
   3. [検出]タブで、質量範囲を500〜3,000に設定します。2,500-3,000 m/z で強いピークが観察される場合は、この範囲を広げます。検出器のゲインを 20x に設定します。
      注意: ゲインは、機器の全体的な設定に基づいて異なる場合があり、必要に応じて調整できます。
   4. [Spectrometer]タブで、[Polarity]を[Positive]に、[Matrix Suppression]を[Deflection, 300 Da]に設定します。
   5. [スタート] | データ取得が完了したら、名前を付けて保存して、データを適切なディレクトリに保存します。
2. フラグメンテーションスペクトルを取得するための親スペクトルの開放
   1. スペクトルを右クリックした後、[ Find Mass list]を選択します。
   2. 生成されたリストから、 フラグメンテーションに関連するイオン を選択し、選択したピークを右クリックした後、 Add to MS/MS list をクリックします。
   3. 質量リストを再度右クリックし、[MS / MSリスト]を選択します。
   4. 「 flexControlに送信」をクリックします。
   5. flexControlで、LIFTメソッドをロードし、LIFTタブに移動します。
   6. ロードした各ピークを1つずつ選択し、 Parent modeとFragmentsモードを切り替えて親イオンとフラグメントイオンの両方を取得します。必要に応じて 、レーザーの強度 と ショット数 を調整します。 「Save 」をクリックして、各親イオンのフラグメンテーション後のデータを保存します。
   7. スペクトルを '.ascII' 形式でエクスポートします。
      注:これは後でGlycoworkbenchにインポートして、さらに分析することができます。
3. glycoworkbench を使用したデータ解析
   1. Glycoworkbench で、エクスポートしたマススペクトルの .ascII ファイルを読み込み、ウィンドウの下部にある関連ボタンを使用して ベースライン補正 と ノイズフィルタリング を実行してから、 ピーク重心を計算します。ポップアップウィンドウで、適切な 質量範囲、最小シグナル/ノイズ比、 および最小MSピーク強度を選択します。
   2. ピーク重心が計算されたら、Glyco-Peakfinderツールを使用して、ピークリストに一致する構造組成を見つけます。誘導体化として perMe、還元端として redEnd、および予想される残基の最小数と最大数を選択します。
      1. ムチンの場合は、ヘキソース、N-アセチル-ヘキソサミン、デオキシ-ヘキソース、およびN-アセチル-ノイラミン酸を選択します。硫酸化糖鎖の場合は、質量が 87.9 のその他の残留物オプションを使用します。MALDI-TOFデータの場合、Max # NaイオンとMax #電荷を1に設定し、精度を0.5 Daに設定します。
         注:質量分析計の校正によっては、精度をさらに向上させる必要がある場合があります。
   3. すべての正しい注釈を選択するには、 コントロール キーを押しながら各注釈をクリックします。次に、アノテーションを右クリックし、 アノテーション付きピークリストに追加をクリックします。
   4. 複数の注釈付きスペクトルを比較するレポートを生成するには、 ツール タブの 「レポート」で、「 異なるプロファイルを比較するレポートを作成する」を選択します。レポートをPDFとして印刷して保存します。
   5. 糖鎖ピークを特定したら、各個々の構造の相対的な存在量を、すべての糖鎖ピークの曲線下総面積に対する割合として計算します。
   6. フラグメンテーションスペクトルを解析するには、ステップ 2.3.1 のようにスペクトルを Glycoworkbench にロードし、ピークリストを生成します。
   7. アノテーションされた糖鎖組成に対応する推定糖鎖構造を描画します。描画された各構造体のフラグメントを生成するには、フラグメント ツールで関連する計算フラグメント オプションを選択します。次に、すべてのフラグメントを選択して右クリックし、[Copy fragments into canvas] をクリックします。
   8. フラグメンテーションの分析をさらにサポートするには、スペクトルビューアで目的のピークをクリックして選択します。次に、右クリックして [Find all structures matching the peaks]を選択し、選択したピークの m/z を推定糖鎖構造のオンラインデータベースと照らし合わせて調べます。
   9. 関心のある推定構造を選択し、右クリックして適切なオプションを選択した後、ソフトウェアのキャンバスウィンドウにコピーします。
   10. 各糖鎖構造から生成可能なフラグメントを計算するには、キャンバスで目的の構造を選択し、[ Tools ] タブで現在の構造の [Fragments ] と [Compute fragments] を選択します。
   11. 複数の糖鎖構造のフラグメントが計算されている場合は、Fragments table ビューの summary タブで比較テーブルを表示します。
   12. 各候補糖鎖構造のピークリストに一致するフラグメントを選択し、右クリックのドロップダウンメニューからCopy fragments to canvas(フラグメントをキャンバスにコピー )を選択します。
   13. Tools( ツール )タブの profiler(プロファイラー)で、 annotate peaks with all structures(すべての構造でピークに注釈を付ける )を選択し、 Tools |レポーティング |注釈のレポートを作成します。レポートをPDFとして印刷して保存します。

結果

以下の結果では、ブタ胃ムチン(PGM)を使用して、脱塩および過メチル化ステップを最適化しました。一般的に使用される 2 つの脱塩アプローチを比較するために、糖鎖の遊離後、カチオン交換(上記のプロトコルに記載)とメタノールによるホウ酸の共蒸発、または多孔質黒鉛化カーボン(PGC)カートリッジによる固相抽出のいずれかによってサンプルを脱塩しました。これには、80% アセトニトリルと 100% H₂O によるカートリッジのプレコンディショニング、0.1% (v/v) トリフルオロ酢酸 (TFA) による洗浄ステップ、2 mL の 25% アセトニトリル 0.1% TFA、2 mL の 50% アセトニトリル 0.1% TFA、および 2 mL の 80% アセトニトリル 0.1% TFA によるグリカンの溶出が必要です。

得られたパーメチル化後のスペクトルを、m/z 500 から m/z 2,500 の範囲で分析しました。イオン交換とホウ酸塩除去によって脱塩したサンプルでは合計 33 の糖鎖構造が同定されましたが、PGC 抽出で脱塩したサンプルでは 32 の構造が同定されました(図 2A)。PGC 脱塩サンプルでは、1 つの糖鎖構造が同定されませんでした( 図 2A にアスタリスクが付いています)。この比較分析により、PGC 抽出後の大きな糖鎖の回収率は、イオン交換と比較して効率が劣ることが示されました。これは、PGC 抽出後の全糖鎖の 21% を占める大きな糖鎖の相対的な存在量によっても証明されていますが、イオン交換では 31% です。さらに、イオン交換とホウ酸塩の除去による脱塩により、PGCによる固相抽出による脱塩後に生成されるスペクトルと比較して、S/N比が増加しました(図2B)。

パーメチル化反応時間を最適化するために、同じパーメチル化反応のアリコートを、異なる時点(すなわち、5分、30分、または90分)でH₂Oを添加することにより急冷しました。その結果、サンプルを 30 分または 90 分間パーメチル化したサンプルで、m/z 500 から m/z 2,500 の範囲に 33 の糖鎖ピークが同定され、得られたスペクトルは同様であることが示されました。対照的に、パーメチル化を 5 分間行った場合、31 個の糖鎖ピークしか同定できませんでした(図 3)。興味深いことに、この短い反応時間で同定されなかった2つの構造( 図3ではアスタリスクでマークされています)は2つのシアル化構造であり、試験した条件下ではシアル酸の修飾が5分では効率的ではないことを示唆しています。

各 PGM 糖鎖ピークのフラグメンテーションを使用して、糖鎖組成を確認し、糖鎖構造を決定しました。ここでは、2つの例を示します(図4)。 図 4A は、983 m/z のピークのフラグメンテーションスペクトルを示しています。糖鎖組成はHexNAc₂Hex₂として割り当てられます。この糖鎖組成には、Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc(糖鎖1)とGal-GlcNAc-Gal-GalNAc(糖鎖2)の2つの構造が考えられます。この化合物のフラグメンテーションにより、糖鎖のさまざまなフラグメントに割り当てることができるピークを持つマススペクトルが生成されました。m/z 529 のピークと m/z 708 のピークは、それぞれ構造 1 と 2 に特徴的であり、PGM 糖鎖ミックスには糖鎖 1 と 2 の両方が存在すると結論付けることができます。

図 4B は、m/z 2,026 のピークのフラグメンテーションスペクトルを示しています。Glycoworkbench は、このピークの 2 つの潜在的な糖鎖組成、Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ と Hex₃HexNAc₄dHex₂ を計算しました。シアル化組成物の精度は低く(それぞれ~160ppmおよび178ppm)、最初のものが正しい選択であるに違いないことを示唆しています。ただし、フラグメンテーションプロファイルは Fuc の存在を示しており、Neu5Ac の存在を示していません。したがって、2番目の構成が正しい構成です。ここでは、4つの推定糖鎖構造が示され、スペクトルには各推定糖鎖構造から計算されたフラグメントが注釈されています。アノテーションされたスペクトルでは、グリカン 4 と 6 のみに特徴的なピークが存在し、グリカン 3 と 5 に特徴的なピークは同定されていないことがわかります。これらのデータから、グリカン 4 とグリカン 6 が存在すると結論付けることができます。

図2:脱塩と固相抽出による糖鎖ピークの比較 (A)陽イオン交換クロマトグラフィーとホウ酸塩除去、またはPGC固相抽出による脱塩後のPGM糖鎖プロファイルの比較。(B)同定された各糖鎖ピークのS/N比における2つの脱塩アプローチの比較。アスタリスクは、陽イオン交換とホウ酸塩の除去によって脱塩されたサンプルでのみ同定された糖鎖を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:5分、30分、または90分間の過メチル化後のPGM糖鎖プロファイルの比較。 アスタリスクは、パーメチル化の30分または90分後にのみ同定されたシアル化糖鎖を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:PGM糖鎖からのフラグメンテーションスペクトルの例(A)m/z 983における糖鎖ピークのフラグメンテーション。(B)m/z 2026 における糖鎖ピークのフラグメンテーション。ボックスは潜在的な糖鎖構造を示しています。フラグメントの上の数字は、それらがどの糖鎖構造から導き出されたかを示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

糖鎖の研究には、レクチンを使用して特定のエピトープを同定する方法から、より高度な液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法(LC-MS)や核磁気共鳴法(NMR)を使用して糖鎖構造の詳細な特性評価を行う方法まで、さまざまな方法論が用いられています。他のアプローチと比較した場合のMALDI-TOF MSの主な利点は、メソッドの感度とハイスループットの性質です¹³。しかし、同重体化合物を分離する能力がないため、同じ m/z 値を持つ異なる糖鎖構造では、MS/MS 下でフラグメントの混合物が生成され、デコンボリューションが困難になります¹³。ムチン糖鎖の正確な構造を決定する必要がある場合は、LC-MSを選択する必要があります。

ここでは、糖鎖の放出、脱塩、過メチル化からデータ取得、分析までのプロセスにおけるすべての重要なステップを含む、MALDI-TOF MSによるムチン糖鎖の分析のためのプロトコールを紹介します。これらの各ステップは、異なるアプローチを使用して実行でき、それらすべてに関連する利点と制限が付属していることを認識することが重要です。

このプロトコールでは、還元 的β脱離法を用いて糖鎖を遊離させました。反応は基本条件下で行われます。ムチンサンプルがすでに懸濁液状態にあり、以前に精製されていない場合は、pH指示紙を使用してpHを確認する必要があります。酸性の場合は、pHを~8〜9に上げる必要があります。このアプローチの限界は、グリカンの遊離に必要な基本条件が、鹸化として知られる反応でシアル酸によく見られる O-アセチル基の加水分解、したがって損失につながることです。

糖鎖^{15、16、17、18}の遊離に関する他の方法が文献に記載されており、その中には不安定な O-アセチル基を保存できるものもありますが、還元 的β脱離は依然としてこの分野のゴールドスタンダードです。このアプローチには、高濃度の塩が必要です。塩やその他のイオン抑制汚染物質は、糖鎖のイオン化効率と定量に影響を与える可能性があるため、MALDI-TOF分析¹⁹の前に除去する必要があります。ここでは、陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続くメタノール蒸発によるホウ酸塩の除去が、ムチンから遊離した糖鎖を脱塩するための最も効率的なアプローチであることが示されました。この場合、糖鎖は樹脂と相互作用せず、樹脂内を流れ、ナトリウムイオンは樹脂に閉じ込められます。しかし、イオン交換カラムの調製には手間がかかり、多数のサンプルを用いた大規模な実験では、このアプローチは非効率的です。このような場合、この樹脂は96ウェルプレート形式でも入手可能であるため、PGC脱塩が好ましい場合があります。しかし、上述したように、PGC抽出による脱塩は、特に大きな糖鎖では非効率的な溶出につながる可能性があるため、結果を解釈する際にはこの点を考慮する必要があります。

未変性糖鎖はMALDI-TOFでも分析できますが、未変性糖鎖はイオン化効率が低いため、この反応により検出感度が大幅に向上するため、通常はペルメチル化が使用されます²⁰。さらに、ペルメチル化により、硫酸化糖鎖やシアル化糖鎖などの負に帯電した糖鎖がポジティブモードで検出されやすくなり、シアル酸やフコースなどの不安定な糖鎖エピトープが保存されます²⁰。最も一般的には、過メチル化は5〜10分間実行することが許され、^14,21、一部の報告では反応が40分²²まで継続することが許可されています。ここでは、試験した条件下では、5分間の過メチル化後にシアル化糖鎖が効率的に検出されず、より長いインキュベーションが必要であることを示しました。

反応時間に加えて、過メチル化効率に影響を与える可能性のある別の要因は、反応中の水の含有量です。水の存在は、糖鎖の過小メチル化または部分的なメチル化につながる可能性があり、すべてのヒドロキシル基がメチル基に変換されているわけではない²³。これは、メチル化が不十分であるかのように簡単に判断でき、14 Da(ヒドロキシル基とメチル基の質量差)異なるピークのグループを質量スペクトルで観察できます。この問題は、ペルメチル化反応を繰り返し、データを再解析することで解決できます。

糖鎖分析における制限要因は、スペクトルの解釈です。近年の進歩にもかかわらず、このプロセスはまだ大部分が手作業であり、スペクトルに正確にアノテーションを付けるためには、糖鎖生合成経路に関する十分な知識と理解が必要です。Glycoworkbench²⁴ のようなツールは、アノテーション、糖鎖構造、組成を提供することで支援することができますが、糖鎖混合物には固有の不均一性があるため、研究者はどの選択が正しいかを判断する必要があります。上記の PGM を使用した例では、Glycoworkbench は mz 2,025.7620 のピークに対して 2 つの潜在的な糖鎖組成を提供し、フラグメンテーションプロファイルに基づいて、シアル化構造ではなくフコシル化構造が存在すると結論付けました。しかし、フラグメンテーションスペクトルが利用できない場合(存在量が少ない糖鎖ではよくあることです)、研究者は、Hex3HexNAc1Neu5Ac3 の組成を持つ糖鎖がムチンではなくガングリオシドに見られるという知識に基づいてアノテーションを入力できるため、このオプションは PGM のコンテキストで検討すべきではありません。したがって、同定された糖鎖の構造または組成は、以前の論文と相互参照し、 O-グリカン生合成の原理と一致する必要があります。全体として、このプロトコルは、特に糖鎖生物学の分野に不慣れで、粘膜界面で発生する相互作用の研究に関心のある研究者にとって、貴重なリソースとして機能します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
150mmガラスパスツールピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	15202699	消耗品 本文内の参照(該当する場合):ガラスピペット
5mLチューブ	エッペンドルフ	30122305	消耗 品
96ウェルHLB抽出板	フィッシャー・サイエンティフィック	16553290	消耗 品
酢酸	シグマ・オルドリッチ	A6283	試薬
アセトニ トリル	フィッシャー・サイエンティフィック	15624520	試薬
無水DMSO	シグマ・オルドリッチ	5.89569	試薬
無水メタノール	シグマ・オルドリッチ	5.89596	試薬
オートフレックス質量分析計	ブルーカー		備品
DOWEX 50w x8 レジン、H+フォーム、200-400メッシュ	シグマ・オルドリッチ	44519	試薬 本文中の参照(該当する場合):カチオン交換樹脂
ドライブロックヒーター	叶える	QBD2	備品
ブロックヒーター用の蒸発器/濃縮器	コール・パーマー	WZ-36610-99	備品
flexAnalysis	ブルーカー		ソフトウェア、独自製品
flexControl	ブルーカー		ソフトウェア、独自製品
ジュネバックEZ-2	バイオ医薬品	EZ-2	機器 本文中の参照(該当する場合):遠心蒸発器
PTFEキャップ付きのガラスバイアル(4 mL)	ウィートン	DWKW224582-144EA	消耗 品
PTFEキャップ付きのガラスバイアル(8 mL)	フィッシャー・サイエンティフィック	11587413	消耗 品
グラスウール	スペルコ	1.04086	消耗 品
グリコワークベンチ	NA		ソフトウェア;https://glycoworkbench.software.informer.com/ からダウンロード可能
HLB SPEカートリッジ	スペルコ	57493-U	消耗品、96ウェルHLB抽出プレートの代替として
ヨードメタン	シグマ・オルドリッチ	289566	試薬
MALDIターゲットプレート	ブルーカー		備品
ModulyoD フリーズドライヤー	サーモ・フィッシャー	ModulyoD-230	機器 本文の参照(該当する場合):フリーズドライヤー
NaBH4	シグマ・オルドリッチ	452882	試薬
ナオオホー(NaOH)ペレット	シグマ・オルドリッチ	567530	試薬
NaOH溶液50%	シグマ・オルドリッチ	415413	試薬
正圧96プロセッサー	水	186006961	備品
スーパー・DHB	シグマ・オルドリッチ	50862	試薬
トリフルオロ酢酸	シグマ・オルドリッチ	T6508	試薬