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方法論記事

微小粒子状物質に曝露されたゼブラフィッシュ胚中の多環芳香族炭化水素を検出するための修正QuEChERS-HPLC法

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DOI:

10.3791/67757

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2025年6月13日

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、ゼブラフィッシュ胚における16種類のPAHの内部レベルを評価するために、修正されたQuEChERS-HPLC法を開発しました。

要約

空気力学直径が2.5μm以下の微小粒子状物質(PM2.5)への母親の曝露は、人間の自然流産やさまざまな先天性疾患に関連しています。しかし、その根底にあるメカニズムは依然として不明です。ゼブラフィッシュの胚は、PM2.5 の発生毒性の研究に広く使用されていますが、PM2.5の主要な毒性成分である多環芳香族炭化水素(PAH)の内部レベルの測定は課題となっています。この研究では、米国環境保護庁(EPA)の優先汚染物質リストに記載されている16のPAHの内部レベルを評価するために、迅速、簡単、安価、効果的、堅牢、安全な高速液体クロマトグラフィー(QuEChERS-HPLC)法を開発しました。ゼブラフィッシュの胚をPM2.5 由来の抽出性有機物(EOM)で受精後2〜72時間(hpf)処理しました。サンプル調製にはQuEChERS法を、PAHの定性・定量分析にはHPLC-FLD/DAD(蛍光検出器とダイオードアレイ検出器を備えたHPLC)を用いました。PM2.5に曝露したゼブラフィッシュの胚から、6つのPAH(フェナントレン、アントラセン、フルオレン、アセナフテン、フルオランテン、ピレン)を検出することに成功しました。この方法は、PM2.5による発生毒性のメカニズムを調査するために重要です。

概要

微小粒子状物質(PM2.5)で、空力直径が2.5μm以下。は、主要な環境リスク要因です。その小さなサイズのために、PM2.5は循環系に入り、母体と胎児の障壁を透過することができます。疫学研究では、母親のPM2.5への曝露は、自然流産やさまざまな先天性疾患と関連しています1,2,3,4。しかし、PM2.5の胚毒性の根本的なメカニズムはよく理解されていません。PM2.5の主要な毒性成分であるPAHは、その変異原性および発がん性5,6のために、人間に対して非常に毒性があります。数百のPAHのうち、16は米国環境保護庁(EPA)によって優先度の高い汚染物質として割り当てられています。

ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、ヒトとの遺伝的類似性、急速な発達、高い繁殖率、および維持の容易さにより、強力な脊椎動物モデル生物です。ゼブラフィッシュの胚は透明であるため、顕微鏡で全身を直接観察することができ、詳細な研究が可能です。溶解したPAHは、拡散によってゼブラフィッシュの胚に侵入することができる7。多くの研究では、ゼブラフィッシュの胚を使用して、PM2.5 8,9,10,11からの抽出可能な有機物(EOM)の毒性効果とメカニズムを調査しています。しかし、これらの研究のほとんどは、ゼブラフィッシュ胚12のPAHの内部レベルを検出することなく、EOMにおける16の優先PAHのみを特徴付けています。この課題は、ゼブラフィッシュの胚のサイズが小さいことと、胚マトリックスが複雑であることが原因である可能性があります。

Quick, Easy, Cunche, Effective, Rugged, and Safe(QuEChERS)法は、食品および環境サンプル中の残留農薬、動物用医薬品、その他の汚染物質の分析に使用される革新的なサンプル調製技術です13,14。この分析法は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)と組み合わせることで、ゼブラフィッシュ15の農薬の検出に使用されています。PAHは、2つ以上のベンゼン環を含むため、強い蛍光特性を持つため、蛍光検出器を用いた検出に特に適しています。本研究では、EOMに曝露したゼブラフィッシュ胚の16種類のPAHsのレベルを評価するための修正QuEChERS-HPLC法を開発しました。

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プロトコル

1.サンプル処理

  1. PM2.5コレクション
    1. 47mm石英メンブレンフィルターにPM2.5 を収集します。
      注:PM2.5 は、中国の蘇州市街地で収集されました。
  2. EOM抽出
    1. フィルターを細かく切り、アセトニトリル150mLを入れた円錐形のガラスフラスコに入れます。
    2. フラスコを35°Cで1時間超音波処理し、抽出物を4本の50mLチューブに移します。
    3. 7,000 × g で20分間遠心分離した後、上清をロータリーエバポレーターに移し、約5 mLに濃縮します。
    4. 35°Cの水浴で窒素流下で蒸発して乾燥させ、残留物をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。
  3. ゼブラフィッシュ胚治療
    1. ゼブラフィッシュを28°C16で14時間の光と10時間の暗サイクルで再循環水系に維持します。
    2. 受精卵(グループあたり200個の胚)を収集し、再循環水システムから30mLの水を入れたガラスのペトリ皿(ソーダライムガラス、80 x 15 mm)に移します。
    3. 受精後2時間(hpf)に、200個の胚が入ったガラス製のペトリ皿に30 μLのEOM(10 mg/mL)を加えます。未処理のグループは、空白のコントロールとして機能します。
      注:EOMの最終濃度は、心臓奇形率に基づいて10 mg / Lです(補足図S1)。.
    4. 皿を28°Cのインキュベーターに入れます。

2. QuEChERSサンプル調製

  1. インキュベーターから72 hpfの胚の入った皿を取り出します。胚を純水で3回洗います。
  2. 胚を1.5mLのチューブに移し(グループによって異なります)、余分な水分を取り除きます。
  3. チューブを-80°Cの冷凍庫に30分間入れて、embyros17 を凍結乾燥し、凍結乾燥します。次に、ガラス棒を使用して胚を粉砕します。
  4. 25 μL の 16 PAH 混合標準溶液 (2.0 μg/mL) を DMSO コントロール群に加えて、スパイク回収率をテストします。
  5. 1mLの n-ヘキサンとボルテックスを30秒間加え、次いで35°Cで30分間超音波処理する。
  6. 7,000 × g で5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
  7. 手順 2.5 と 2.6 を繰り返します。
  8. 収集した上清を窒素流下で35°Cの水浴中で蒸発させて乾燥させます。
  9. 1 mLのアセトニトリルを加え、ボルテックスで30秒間加熱します。
  10. 10 mgの第一級二級アミン(PSA)、45 mgの硫酸マグネシウム、および15 mgのC18充塡剤を加え、次いで30秒間ボルテックスする。
  11. 7,000 × g で5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。
  12. ステップ2.9を繰り返し、7,000 × g で5分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。
  13. 窒素下で上清を0.5mLまで蒸発させます。
  14. 0.22 μmの微多孔質メンブレンでろ過します。

3. HPLCを用いたPAHsの測定

  1. アセトニトリルと 16 PAH 混合標準試料用の一連のワーキング溶液(1 〜 500 ng/mL の範囲)を調製し、アセトニトリル/水を移動相として使用して液体クロマトグラフに注入します。
    1. 20 μLを注入し、次の溶出手順を使用します:0-18.5分、40%アセトニトリルから100%アセトニトリル;18.5-28分、100%アセトニトリル;28〜29.5分、100%〜40%アセトニトリル;停止時間:32分。カラム温度:25°C;流量:1.8mL/分標準標準溶液の質量濃度を X 軸に、対応するピーク面積を Y 軸に 5 ng/mL から 500 ng/mL の範囲で測定した標準曲線をプロットします。
      注:PAHの励起/発光波長は 、補足表S1に記載されています。
  2. 精製したサンプル(ステップ2.14)を、蛍光検出器(FLD)とダイオードアレイ検出器(DAD)を使用して液体クロマトグラフに注入します。
  3. 保持時間を比較してPAHの存在を特定し、関連するピーク面積を測定します。
    注:PAHの質量濃度は、ステップ3.1.1で以前に作成した標準曲線を使用して決定しました。
  4. サンプルの測定質量濃度に基づいて、16 の PAH の内部濃度を計算します。

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結果

EOM曝露、サンプル調製、およびPAH検出の全手順を 図1に示します。HPLC-FLU/DADでは、シグナル対ノイズ比が3:1、検出範囲が0.3〜5.0 ng/mLであれば許容できると考えられました。分析法の検出限界は、3.0 × 10-4 から 5.0 × 10-3 ng/生物の範囲でした。すべての検量線は高い直線性を示しました(r2 > 0.999)。マトリックスサンプルから得られた抽出物を用いて決定された精度値は5%未満でした。急上昇した回復率は82.0%から96.3%の範囲でした(表1)。

表2および補足図S2に示すように、EOMに曝露されたゼブラフィッシュの胚において、フェナントレン(Phe)、アントラセン(Ant)、フルオレン(Flu)、アセナフテン(Acp)、フルオランテン(Fla)、およびピレン(Pyr)の6つのPAHが検出されました。...

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ディスカッション

ゼブラフィッシュの胚は、発生毒性試験のための強力な脊椎動物モデルですが、そのサイズが小さいため、PAHなどの半揮発性有機化合物(SVOC)の検出が難しくなります。サンプル調製では、ゼブラフィッシュの胚の汚染を防ぐことが重要です。サンプルの適切な洗浄は、露光媒体からサンプル抽出物への化合物のキャリーオーバーを回避するための重要なステップです。不完全な洗浄は過大評価につながる可能性があり、過度の洗浄は胚内からの物質の損失を引き起こし、過小評価につながる可能性があります。PAH抽出時には、ゼブラフィッシュの胚に由来する水分と不純物を除去する必要があります。

脱水には、珪藻土または無水硫酸ナトリウムが一般的に使用されます。しかし、珪藻土と無水硫酸ナトリウムの両方で微量のPAHが検出され、ブランドによってわずかなばらつきがありました。したがって、これらの材料は、使用前に少なくとも2時間450°Cで焼く必要があります。サンプルの乾燥には便利な低温凍結乾燥法を採用し、PSAとC18 を添加して汚染を避け、不...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

本研究は、中国国家自然科学基金会(助成番号:81972999)および蘇州科学技術発展計画(医療応用基礎研究、SKY2023036およびSKY2023115)の助成を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16 PAH 混合標準溶液  o2si Smart Solutions (米国サウスカロライナ州)110124-0616 PAH 混合標準溶液   ナフタレン (Nap)、アセナフチレン (Acy)、アセナフテン (Ace)、フルオレン (Flo)、フェナントレン (Phe)、アントラセン (Ant)、フルオランテン (Flu)、ピレン (Pyr)、ベンゾ [a] アントラセン (BaA)、クリセン (Chr)、ベンゾ [b] フルオランテン (BbF)、ベンゾ [k] フルオランテン (BkF)、ベンゾ [a] ピレン (BaP)、インデノ [1,2,3-cd] ピレン (IcdP)、ジベンツ [a、h]アントラセン(DahA)、ベンゾ[g,h,i]ペリレン(BghiP)。
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (米国サンタクララ)FLD(G1321A);DAD SL (G1315C)
アセトニトリルScharlab (スペイン、バルセロナ)AC03661000溶媒
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(中国、上海)SBEQ-CA0801C18 パッキンは、親水性と疎水性のバランスが取れた逆相パッキンで、極性有機化合物と非極性有機化合物をよく吸着して分離できます。
珪藻土Agilent Technologies, Inc (米国サンタクララ)12214013有機不純物の分離、精製、除去用 ‌
分散型 SPE 15 mL、ENAgilent Technologies, Inc (サンタクララ、米国)5982-5056サンプル精製
フィルターANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(上海、中国)SCAA-104有機相ニードルフィルター (ナイロン)、0.22&マイクロ;m
HexaneScharlab (スペイン、バルセロナ)HE02481000溶媒
MilliporeMerck (米国ニュージャージー州)超純水の調製
有機化 - N-EVAP 窒素蒸発器有機化 (米国マサチューセッツ州)溶媒の蒸発
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (ウォルサム、米国)遠心分離
 Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (ニューヨーク、米国)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918カラムは、PAH の正確で信頼性の高い分析を実現するために HPLC システムで一般的に使用されます。
この

参考文献

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