微小粒子状物質に曝露されたゼブラフィッシュ胚中の多環芳香族炭化水素を検出するための修正QuEChERS-HPLC法

Summary

私たちは、ゼブラフィッシュ胚における16種類のPAHの内部レベルを評価するために、修正されたQuEChERS-HPLC法を開発しました。

Abstract

空気力学直径が2.5μm以下の微小粒子状物質(PM_2.5)への母親の曝露は、人間の自然流産やさまざまな先天性疾患に関連しています。しかし、その根底にあるメカニズムは依然として不明です。ゼブラフィッシュの胚は、PM_2.5 の発生毒性の研究に広く使用されていますが、PM_2.5の主要な毒性成分である多環芳香族炭化水素(PAH)の内部レベルの測定は課題となっています。この研究では、米国環境保護庁(EPA)の優先汚染物質リストに記載されている16のPAHの内部レベルを評価するために、迅速、簡単、安価、効果的、堅牢、安全な高速液体クロマトグラフィー(QuEChERS-HPLC)法を開発しました。ゼブラフィッシュの胚をPM_2.5 由来の抽出性有機物(EOM)で受精後2〜72時間(hpf)処理しました。サンプル調製にはQuEChERS法を、PAHの定性・定量分析にはHPLC-FLD/DAD(蛍光検出器とダイオードアレイ検出器を備えたHPLC)を用いました。_PM2.5に曝露したゼブラフィッシュの胚から、6つのPAH(フェナントレン、アントラセン、フルオレン、アセナフテン、フルオランテン、ピレン)を検出することに成功しました。この方法は、PM_2.5による発生毒性のメカニズムを調査するために重要です。

Introduction

微小粒子状物質(PM_2.5)で、空力直径が2.5μm以下。は、主要な環境リスク要因です。その小さなサイズのために、PM_2.5は循環系に入り、母体と胎児の障壁を透過することができます。疫学研究では、母親の_PM2.5への曝露は、自然流産やさまざまな先天性疾患と関連しています1,2,3,4。しかし、PM_2.5の胚毒性の根本的なメカニズムはよく理解されていません。PM_2.5の主要な毒性成分であるPAHは、その変異原性および発^がん性5,6のために、人間に対して非常に毒性があります。数百のPAHのうち、16は米国環境保護庁(EPA)によって優先度の高い汚染物質として割り当てられています。

ゼブラフィッシュ、Danio rerioは、ヒトとの遺伝的類似性、急速な発達、高い繁殖率、および維持の容易さにより、強力な脊椎動物モデル生物....

Protocol

1.サンプル処理

1. _PM2.5コレクション
   1. 47mm石英メンブレンフィルターに_PM2.5 を収集します。
      注:PM_2.5 は、中国の蘇州市街地で収集されました。
2. EOM抽出
   1. フィルターを細かく切り、アセトニトリル150mLを入れた円錐形のガラスフラスコに入れます。
   2. フラスコを35°Cで1時間超音波処理し、抽出物を4本の50mLチューブに移します。
   3. 7,000 × g で20分間遠心分離した後、上清をロータリーエバポレーターに移し、約5 mLに濃縮します。
   4. 35°Cの水浴で窒素流下で蒸発して乾燥させ、残留物をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解します。
3. ゼブラフィッシュ胚治療
   1. ゼブラフィッシュを28°^C16で14時間の光と10時間の暗サイクルで再循環水系に維持します。
   2. 受精卵(グループあたり200個の胚)を収集し、再循環水システムから30mLの水を入れたガラスのペトリ皿(ソーダライムガラス、80 x 15 mm)に移します。
   ....

Results

EOM曝露、サンプル調製、およびPAH検出の全手順を 図1に示します。HPLC-FLU/DADでは、シグナル対ノイズ比が3:1、検出範囲が0.3〜5.0 ng/mLであれば許容できると考えられました。分析法の検出限界は、3.0 × ^10-4 から 5.0 × ^10-3 ng/生物の範囲でした。すべての検量線は高い直線性を示しました(r² > 0.999)。マトリックスサンプルから得られた抽出物を用いて決定された精度値は5%未満でした。急上昇した回復率は82.0%から96.3%の範囲でした(表1)。

表2および補足図S2に示すように、EOMに曝露されたゼブラフィッシュの胚において、フェナントレン(Phe)、アントラセン(Ant)、フルオレン(Flu)、アセナフテン(Acp)、フルオランテン(Fla)、およびピレン(Pyr)の6つのPAHが検出されました。.......

Discussion

ゼブラフィッシュの胚は、発生毒性試験のための強力な脊椎動物モデルですが、そのサイズが小さいため、PAHなどの半揮発性有機化合物(SVOC)の検出が難しくなります。サンプル調製では、ゼブラフィッシュの胚の汚染を防ぐことが重要です。サンプルの適切な洗浄は、露光媒体からサンプル抽出物への化合物のキャリーオーバーを回避するための重要なステップです。不完全な洗浄は過大評価につながる可能性があり、過度の洗浄は胚内からの物質の損失を引き起こし、過小評価につながる可能性があります。PAH抽出時には、ゼブラフィッシュの胚に由来する水分と不純物を除去する必要があります。

脱水には、珪藻土または無水硫酸ナトリウムが一般的に使用されます。しかし、珪藻土と無水硫酸ナトリウムの両方で微量のPAHが検出され、ブランドによってわずかなばらつきがありました。したがって、これらの材料は、使用前に少なくとも2時間450°Cで焼く必要があります。サンプルの乾燥には便利な低温凍結乾燥法を採用し、PSAと_C18 を添加して汚染を避け、不.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 PAH 混合標準溶液	o2si Smart Solutions (米国サウスカロライナ州)	110124-06	16 PAH 混合標準溶液   ナフタレン (Nap)、アセナフチレン (Acy)、アセナフテン (Ace)、フルオレン (Flo)、フェナントレン (Phe)、アントラセン (Ant)、フルオランテン (Flu)、ピレン (Pyr)、ベンゾ [a] アントラセン (BaA)、クリセン (Chr)、ベンゾ [b] フルオランテン (BbF)、ベンゾ [k] フルオランテン (BkF)、ベンゾ [a] ピレン (BaP)、インデノ [1,2,3-cd] ピレン (IcdP)、ジベンツ [a、h]アントラセン(DahA)、ベンゾ[g,h,i]ペリレン(BghiP)。
1260 Infinity II LC System	Agilent Technologies (米国サンタクララ)		FLD(G1321A);DAD SL (G1315C)
アセトニトリル	Scharlab (スペイン、バルセロナ)	AC03661000	溶媒
CNWBOND HC-C18 SPE	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(中国、上海)	SBEQ-CA0801	C18 パッキンは、親水性と疎水性のバランスが取れた逆相パッキンで、極性有機化合物と非極性有機化合物をよく吸着して分離できます。
珪藻土	Agilent Technologies, Inc (米国サンタクララ)	12214013	有機不純物の分離、精製、除去用 ‌
分散型 SPE 15 mL、EN	Agilent Technologies, Inc (サンタクララ、米国)	5982-5056	サンプル精製
フィルター	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(上海、中国)	SCAA-104	有機相ニードルフィルター (ナイロン)、0.22&マイクロ;m
Hexane	Scharlab (スペイン、バルセロナ)	HE02481000	溶媒
Millipore	Merck (米国ニュージャージー州)		超純水の調製
有機化 - N-EVAP 窒素蒸発器	有機化 (米国マサチューセッツ州)		溶媒の蒸発
Sorvall ST4 Plus	Thermo Fisher Scientific (ウォルサム、米国)		遠心分離
Vortex- Genie 2 (G560E)	Scientific Industries (ニューヨーク、米国)		Vortex
ZORBAX Eclipse PAH	Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)	959990-918	カラムは、PAH の正確で信頼性の高い分析を実現するために HPLC システムで一般的に使用されます。