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方法論記事

受精中に精子から卵子に移された父方代謝産物の質量分析同定のための安定同位体 生体 内標識

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DOI:

10.3791/67765

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2025年6月17日

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

この記事について

サマリー

この手順は、 2H2O または U13C グルコースによる安定同位体標識とそれに続くメタボローム分析を使用して、受精中に精子から卵母細胞に移された代謝産物を特定することを目的としています。重水素標識の種牡馬は、標識のないダムと交配されます。採取した着床前胚を質量分析法で分析し、父方(重水素化)代謝物と母性(非重水素化)代謝物を選別します。

要約

胚遺伝学への父方の貢献は、これまで何十年にもわたって対立遺伝子配列に限られてきた。それどころか、10年にわたる結果は、エピジェネティックな因子(DNAメチル化、ヒストン修飾、染色体組織化、および制御性RNA)が父方の遺伝に重要な役割を果たし、胚発生と接合子遺伝子発現に影響を与えることを示唆しています。核酸とともに、精子メタボローム(脂質、炭水化物、遊離アミノ酸)はエピジェネティックなシグナルとして作用する可能性があります。このプロトコルは、質量分析によって精子から卵子へ移行した代謝物を特定することを目的としています。この手順には、 2H2OまたはU13C Glucoseによる精子細胞の安定同位体標識が含まれ、メタボロミクスにより、受精中に卵母細胞に移された父方の代謝産物を追跡します。プロトコルの全体的な目標は、父親の精子メタボロームの役割を明らかにすることです 子孫の代謝異常に対する感受性、およびそれは、食事や汚染物質への曝露などの環境条件がどのように父親の代謝メッセージを変化させるかについての洞察を提供するために適応される可能性があります、潜在的に子孫の健康と糖尿病、肥満、および心血管疾患の素因に影響を与えます。

概要

父方のエピゲノムは、代謝障害に対する子孫の感受性に影響を与える
胚発生中に母親が利用する受胎前および受胎後の役割の多さとは異なり、精子細胞の寄与は何十年もの間、もっぱら遺伝的であると考えられてきました。遺伝的遺伝理論によれば、個人の表現型の多様性に対する父方の寄与(病気に対する感受性を含む)は、父方から受け継がれた対立遺伝子多様体の遺伝的配列と、母方から受け継がれたそれらとの相互作用にのみ起因する必要がありました1。今日では、受精中に父親が子孫に伝達する遺伝的メッセージは対立遺伝子だけではなく、それどころか、多数のエピジェネティックなシグナルが父方の遺伝に寄与していることは明らかです2,3,4。これまでに同定されたエピジェネティックなシグナルには、(1)親ゲノム5,6,7のシトシンに共有結合的に付加されたメチル基、(2)精子染色体に結合して卵母細胞に送達されたヒストンの翻訳後修飾(アセチル化、メチル化)8、(3)受精卵9に持続する染色体内相互作用(トポロジカル会合ドメイン、TADとも呼ばれる)につながる父方染色体の3D組織化が含まれます、10、および(4)制御RNA分子(miRNA、tRNA由来フラグメント、およびpiwi相互作用RNA)11,12、および受精中に精子から卵子に放出されるrRNA13およびtRNA14。

父方のエピゲノムは、子孫にとって重要な情報の媒体です。父親の情報は、受精卵、その発生中の胚、そして出生後の子孫の代謝障害や病気の傾向に影響を与えます。この非メンデル遺伝(それが1つの世代に影響を与えるか、複数の連続する世代に影響を与えるかによって、世代間または世代間と呼ばれる)は、多くの著者によって、先進西洋諸国で発生する代謝異常疾患の劇的な増加の原因となる隠れた要因の1つと考えられています15。実際、PoHaD(健康と疾患の父方起源)およびDoHaD(健康と疾患の発達起源)理論によれば、親のエピジェネティックな寄与は、子孫が成人期に糖尿病、肥満、および心血管疾患を発症する素因となる要因の1つです16,17。興味深いことに、親のエピゲノムは環境刺激に非常に敏感であり、代謝状態(薬物使用、食習慣、代謝フィットネスなど)18だけでなく、厳密に環境パラメータ(汚染物質への曝露、社会的関係、精神的および関係的ストレスなど)5,11によって影響を受ける可能性があります。.したがって、上記の各刺激は、胚細胞(精子と卵子)のエピゲノムを変化させ、将来の世代に影響を与える可能性があります。

高脂肪食(HFD)の消費は、父方のエピゲノムを変化させ、子孫に有害なメッセージを届ける可能性のある最も広く研究された環境刺激の1つです19。この刺激は、カロリー摂取量に関係なく、代謝異常を発症する傾向が強いことが多い子孫の表現型(第3世代まで)に影響を及ぼします。HFDを摂取した父親の子孫は、マウスとラットの両方で成長遅延、耐糖能異常、およびインスリン抵抗性を示します20,21。ヒトでは、エピジェネティックな遺伝は、主に飢饉や過剰摂取の時期やその直後に生まれた世代で研究されてきた22。Överkalixコホートでは、父方の祖父母の遅い成長期の食料利用可能性は、孫の全体的な死亡リスク、心血管疾患、BMI、胴囲、および体脂肪量と相関していました23。最近、父親の世代間感染の証拠が他のコホートで確認されています24。

世代間遺伝に関与する父方代謝産物
臨床的および疫学的証拠にもかかわらず、父方の世代間遺伝の分子的詳細は不明のままである。まず、エピジェネティックな情報のすべての分子トランスデューサーの同定はまだ完了していません。科学的証拠は、精子の核成分だけでは、世代間遺伝の複雑さを説明できないことを示唆しています。DNAメチル化の変動は、HFDを与えられたマウスとラットの精子で実際に測定されていますが、精子集団の割合が非常に低いため、これは子孫に観察された代謝異常表現型の高い浸透度を説明することができません25。一方、精子から卵子に移されたシグナル伝達RNAのプールは半減期が非常に短く、接合子遺伝子の発現に影響を与えることはできるものの、受精後、2日目、3日目の胚の受精卵、桑実胚、胚盤胞において有効な濃度に維持される可能性は低いと思われます。したがって、新しい分子決定要因が世代間遺伝メカニズムに関与しているに違いないことは明らかであるように思われます。

核酸と共に、精子はまた、脂質、炭水化物、およびアミノ酸26,27,28,29のようなメタボローム成分を接合子に寄与する。これらの代謝産物、特に調節活性を持つものは、接合子遺伝子の発現と胚発生に影響を与える可能性があり、したがってエピジェネティックなシグナルとして作用する可能性がある30。さらに、核酸と同様に、精子中のこれらの代謝産物の濃度および相対的な存在量は、父親が経験した環境条件によって影響を受ける可能性があり、したがって、子孫のための情報の媒体を表すことができる 28,30,31,32,33,34.実際、成熟した精子の精子メタボロームは、父親の健康状態に依存し、食事、運動、有毒物質、内分泌かく乱物質などの環境要因の影響を受けることが示されています。

胚発生における精子代謝産物の役割を理解することは、いくつかの技術的な制限によって複雑になります:(1)精子と卵子のサイズの違いにより、精子の接合子への代謝質量の寄与が最小限に抑えられます、および(2)精子が生産段階(精子形成)、精巣上体の成熟中に受けるいくつかのメタボローム変動、 射精、卵子との融合。

精子成熟期における精子メタボロームの変動
哺乳類では、精子形成を通じて精子が精巣で産生され、精原幹細胞に依存するプロセスにより、コミットされた精子が初代精母細胞に成長し、減数分裂に入り、丸い一倍体の精子細胞が生成されます。これらの細胞の精子への形態形成は、精子形成、つまり円形細胞から精子形成の最終段階に対応する細長い/凝縮した/高度に特殊化された細胞への精子の大規模な形態機能的リモデリングを通じて発生します。しかし、結果として生じる精子は不動であり、まだ受精する能力がありません35。精子形成後、精子が網状精巣から精巣上体に放出されると、精子細胞は上皮精巣上体細胞と相互作用し、これらの細胞が分泌するタンパク質およびエキソソーム小胞(スフィンゴミエリンとアラキドン酸が豊富な精巣上体)と関与します。精巣上体を通過することで、精子は完全な成熟に達することができ、たとえ事前に容量のある状態に維持されていても、精子は運動能力を獲得する36。精巣上体通過中、精子膜はより負に帯電し、スフィンゴミエリンが豊富になります。精子膜は、コレステロールの漸進的な減少とそれに伴う多価不飽和脂肪酸(主にアラキドン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸)の増加により、より流動的になります。射精後、女性の生殖管では、精液タンパク質とアルブミンが過分極とカルシウム流入を促進して精子の運動性を活性化することにより、精子の能力化を促進します。容量のある精子の原形質膜は、流動性がさらに向上し、コレステロールとリン脂質の比率が低くなり、シアル酸、GM1ガングリオシド、およびトリグリセリド含有量が減少します31,37。

卵子に出会う前に、精子は先体反応、先体(精子核の前部を覆い、精子形成中に形成されるゴルジ体由来の膜状小器官)と精子原形質膜との融合を受け、精子原形質膜の再編成と精子原体を取り巻く糖タンパク質のマトリックスである透明帯(ZP)の浸透を促進します35、38.最終段階として、精子タンパク質IZUMO1、SPACA6、およびTMEM95によって促進される精子と卵子膜との間の半融合39は、精子脂質の卵子膜への取り込みおよび卵子への核および代謝内容物の移動をもたらす。

手続きの理論的根拠
この手順の目的は、精子によって輸送され、受精時に卵子に移される代謝物を特定することです(図1)。受精卵の精子由来代謝産物と卵子由来代謝産物を区別するために、精子は重水素(2H、水素同位体)または13C(炭素同位体)で標識され、酸化重水素、2H2O40、または均一に標識されたU13Cグルコース41による生体内代謝標識が使用されます。 次に、同位体標識された雄マウスを標識されていない雌と交配させ、最終的に接合子、桑実胚、および胚盤胞を収集します。初期段階の胚をプロセシングして、(1)極性物質、(2)非極性代謝物、(3)ステロールを抽出します。次に、メタボロームを質量分析技術を用いて分析します。同位体標識された(父方の)代謝物は、標識されていない(母方の)代謝物と識別され、それらの父方の起源を明確に示します。

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プロトコル

すべての動物実験は、イタリアのナポリ大学フェデリコ2世の動物管理・使用委員会によって承認されました。この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. C57BL/6Jオスの選抜とグループ化

  1. 約12週のC57BL/6Jオスを選択します。
  2. オスを2つのグループに分け、LABELED(安定同位体標識を受けている)またはUNLABELED(対照として、また精子細胞と桑実胚の同位体標識の有効性を測定するために使用)と名付けます。
  3. 標識されていない精子細胞から精巣上体を空にするために、オスがペアのメスと交尾できるようにします。

2. C57BL/6J雄の安定同位体標識

  1. 2H2Oをin vivo標識に使用する場合は、100 mLの2H2Oを900 mLの水道水と混合して、飲料水として使用する10% v/v 2H2O濃縮水を調製します。生体内標識にU13C-Glucoseを使用する場合は、50〜150 gのU13C-Glucoseを1 Lの水道水に溶解して、飲料水として使用する5%〜15%のU13C-Glucose水を準備します。
    注意:2H2Oの長時間摂取はマウスにとって有毒です。各特定のマウス系統に対して、最大量の2H2Oを飲料水に追加して、最大の標識効率と最小限の副作用を達成するように設定します。グルコースの長期摂取は、マウスの高血糖と糖尿病を引き起こします。飲料水に添加するU13C-Glucoseの最大量を設定すると、標識効率が最大化され、副作用が最小限に抑えられます。
  2. 水筒を同位体標識の飲料水が入ったものと交換し、マウスが2.5〜5週間(少なくとも半分の精子形成をカバーする)飲ませ、週に2回液体を更新します。
  3. 治療期間の終わりに、ラベル付けされたオスが過排卵したメスと交尾するのを待ちます。

3. C57BL/6J雌の超排卵

  1. 思春期前の年齢で、体重が12.5〜14 gの約4週間の女性を選択します。
  2. PMSG(妊娠中の牝馬の血清)の5IU/50μL/マウスの腹腔内注射により卵胞の成熟を誘導します。
  3. 47時間後、黄体形成ホルモンHCG(ヒト絨毛性ゴナドトロピン、5 IU / 50μL /マウス)の腹腔内注射して、卵胞の成熟の完了を促進し、排卵と黄体の形成を誘導します。.
  4. HCG注射後、 図1のステップ1に従って、雌がLABELEDマウスおよびUNLABELEDマウスと交配するのを待ちます。
  5. 交配後、膣栓制御42を行う。陽性のメスを分離し、ケージに入れます。

4. フラッシングによる着床前胚採取

  1. 施設で承認されたプロトコルに従って、膣プラグ陽性の女性を犠牲にします (桑実葬液を採取するための性交後 2.5 日)。
  2. 動物を背側に横たわってテーブルに置きます。腹部を70%エタノールで濡らし、広範囲開腹術を行います。
  3. 子宮頸部をつまんで子宮頸部の尾側の端を切って、片側の子宮を取り出します。反対側では、子宮角の端(眼枢部)を切断することによって。
  4. 子宮をPBSでペトリ皿に入れてすすぎ、残留物の存在を避けるために別のきれいなペトリ皿に移します。
  5. 子宮を洗い流すには、2.5 mLシリンジに培地をロードし、33 Gの鈍い先端のハミルトン針に取り付けます。.
  6. 上記のように調製した卵管のインファンディブルムに針を挿入し、子宮全体を洗浄します。
  7. 桑実胚を一滴の培地に集めて、残っている粘膜や血液から桑実胚を洗い流します。
  8. 採取したサンプルを新しい採取チューブに移し、LABELED種雄牛またはUNLABELED種雄牛の交配イベントに由来するかに応じて、LABELED MORULAEおよびUNLABELED MORULAEにグループ化します。サンプルを液体窒素で急速凍結します。
  9. 未受精の卵子を収集するために、交配していない過排卵した女性のグループを犠牲にします(施設で承認されたプロトコルに従います)。採取したサンプルを新しい採取チューブに移し、UNLABELED OOCYTESとして標識します。サンプルを液体窒素で急速凍結します。

5. 精巣上体尾部からの精子採取

  1. LABELEDまたはUNLABELEDの種牡馬を犠牲にします。
  2. 動物をテーブルの上に背側に横たわらせ、腹部を70%エタノールで濡らし、広い開腹術を行います。
  3. 精巣上体を取り除き、すぐに3mLのPBS(pH 7.6)に浸し、ゆるく切って管から精子を排出します。
  4. チーズクロスを通して精子サンプルをろ過します。
  5. 精子細胞を800 x g で10分間(室温)遠心分離します。
  6. ペレットを1 mLの冷たい脱イオン水に再懸濁します。精子細胞だけが低張液に抵抗し、非精子細胞は破裂します。
  7. 精子細胞を800 x g で室温で10分間遠心分離します。
  8. チューブにラベルを付け、ラベル付き種牡馬から採取したものかUNLABELD種牡馬から採取したものかに応じて、LABELED SPERMおよびUNLABELED SPERMとしてグループ化します。
  9. サンプルを液体窒素でスナップ凍結し、サンプルを-80°Cで保存します。

6. 脂質および極性代謝産物の抽出

  1. ステップ1〜5のサンプルを氷上で4°Cで平衡化します。
  2. 225 μLの氷冷メタノール(MeOH)をサンプルに加え、-30°Cで1分間インキュベートした後、ソニックバスに10分間入れます。
    1. オプション:実験条件を設定しながら、C16-セラミド-13 C3-15NおよびL-リジン-ε-15N塩酸塩の両方を内部標準として0.1-2 ppm追加し、非極性代謝物および極性代謝物の抽出効率をそれぞれ測定します。
  3. 750 μLの氷冷メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)をサーモミキサーで4°C(550 rpm)で1時間加えます。
  4. 遠心分離後、188 μLのH2Oをサンプルに加えます。上相(脂質)を下相(極性代謝物)から分離し、乾燥させます。.
    注意: MeOHは、飲み込むと失明し、肝臓、腎臓、心臓に損傷を与えます。過度の露出は、中枢神経系に累積的な影響を及ぼします。MTBEは、皮膚、目、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。ヒュームフードの下で作業します。
  5. 真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させます。乾燥したサンプルは、質量/分析分析まで-80°Cで保存してください。
    注:乾燥したサンプルは、質量/分析分析を待つ間、-80°Cで最大6か月間保存できます。着床前胚にあまり含まれていない代謝物を同定するためには、同じ交配ペアと交配イベントから得られたサンプルをプールする必要があるかもしれません。

7. ステロールの抽出

注:プラスチック製のチューブやチップの使用は避けてください[それらは非極性有機溶剤によって溶解されます];代わりに、ガラス管とガラスパスツールピペットを使用して液体を分注します。

  1. ステップ1〜5のサンプルを氷上で4°Cで平衡化します。採取したサンプルをメタノール/H20 70% v/v の溶液 500 μL に再懸濁し、懸濁液をガラス管に移します。
    1. 30秒間ボルテックスして均質化します。ホモジネートを4°Cで16時間放置します。
    2. オプション:実験条件を設定する際に、ステロールの抽出効率を測定するための内部標準として、植物ステロールSitostanol-5,6,22,23-d4の0.1〜2ppmを追加します。
      注意: MeOHは、飲み込むと失明し、肝臓、腎臓、心臓に損傷を与えます。過度の露出は、中枢神経系に累積的な影響を及ぼします。
  2. サンプルを3.220 x g で室温で15分間遠心分離します。上清をきれいなガラス管に移し、500μLのPBSを補給します。
  3. 7 mLの氷冷ジエチルエーテルを加え、1分間ボルテックスします。.サンプルを1〜2分間放置し、相分離を待ちます。チューブをドライアイス/アセトン浴に浸して凍結します。凍結していないジエチルエーテル相を新しくラベル付けしたガラス管に移します。
    注意:ジエチルエーテルは非常に可燃性の液体および蒸気であり、空気中および光中で爆発性の過酸化物に分解します。炎に密着して作業しないでください。ジエチルエーテルは飲み込むと危険で、皮膚に有害です。
  4. 水相を37°Cで解凍し、手順4.3を繰り返します。ステップ4.3〜4.4で採取したジエチルエーテル相を1本のガラス管に組み合わせます。
  5. 真空濃縮器を使用してサンプルを乾燥させます。乾燥したサンプルは、質量/分析分析まで-80°Cで保存してください。

8. サンプル誘導体化

注:サンプルは、特定の代謝物(コレステロール、脂肪酸、アミノ酸)の分析にTMS誘導体化の恩恵を受けます。

  1. 室温でサンプルを平衡化します
    注意: 不完全な平衡化は、チューブの壁やサンプルに大気中の水が結露する可能性があります。水はTMS誘導体化をめぐって激しく競争しています。
  2. サンプルを50 μLのピリジンに溶解し、25 μLのN,O-ビス(トリメチルシリル(TMS)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)を添加して誘導体化します。サンプルを60°Cで90分間インキュベートします。 サンプルをスピンして、すぐにGC-MS分析を進めます。
    注意:ピリジンは可燃性で、刺激性があり、有毒です。BSTFAは可燃性、腐食性、刺激性があります。ドラフトの下で作業し、保護手袋を使用してください。

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結果

精子から卵子への代謝産物の移動をモニターするために、C57 BL/6J雌から単離された桑実胚をLABELEDおよびUNLABELEDグループの種牡馬と交配させ、質量分析に基づくメタボロミクスによって収集および分析します。代謝物は、ステップ6〜7に記載したように抽出し、ステップ8に記載したTMSで誘導体化した。LABELD桑実胚、UNLABEL桑実胣艇、UNLABELED卵子、LABELED、およびUNLABELED精子細胞のメタボロームおよびリピドミクスプロファイリングを実施しました。得られたプロファイルを統計的に分析、整列、および比較して、特に標識された桑実胚細胞と標識された精子細胞の両方に存在し、標識されていない桑実胚とUNLABLLED卵子には存在しない化学種を特定しました。候補となる化学種は、より重い分子量(主に2〜4 DaのΔm/z)を持ち、天然に存在する対応する分子種と共溶出する必要があります。これらのより重い種の存在は、受精時に特定の父性代謝産物が卵母細胞に移行していることを示している可能性があります。

図2A

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ディスカッション

記載されたプロトコルは、2H2OまたはU13Cグルコースとそれに続くメタボローム分析による雄マウスの安定同位体標識を使用することにより、受精中に精子から卵子に移された代謝産物の同定を可能にする。桑実胚に見られる同位体標識代謝産物は父方起源です。

水素と重水素は同位体ですが、化学的挙動の点では完全に同一ではありません。2H2Oの融点および沸点は、H2Oの融点および沸点よりも高く、さらに、生物学的系で一般的に見られる塩(KCl、NaCl、およびリン酸塩など)の粘度および溶解度は、2H2Oにおいて有意に異なる。この変動は、2H2Oに溶解した生物系の三次元構造と特性を変化させ、重水を生命と不適合にします。したがって、マウスおよびラットは、2H2Oを飲料水として投与...

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開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2H2O ろ過、99.8 原子 % 2Hシグマ・アルドリッチ756822
アセトンシグマ・アルドリッチ179124
アジレント シル-8Agilent (米国カリフォルニア州サンタクララ)
C16-セラミド-13C3-15NLGC規格TRC-C342770-25MG
ジクロロ メタンシグマ・アルドリッチ34856
ジエチルエーテル シグマ・アルドリッチ673811
エタノールシグマ・アルドリッチ1,11,727
HCG(ヒト絨毛性ゴナドトロピン、シグマ・アルドリッチCG5-1VLシリーズ
L-リジン-&イプシロン;-15N塩酸塩シグマ・アルドリッチ608971
男性と女性 C57BL/6JOlaHsdマウスイノチフ C57BL/6JOlaHsd
メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)シグマ・アルドリッチ306975
気象庁シグマ・アルドリッチ1,06,035
N,O-ビス(トリメチルシリル(TMS)
トリフルオロアセトアミド(BSTFA)		スペルコ15238
PBSの応用A0965-9010
PMSG(妊娠中の牝馬S血清)リー・バイオソリューションズ493-10
ピリジンシグマ・アルドリッチ360570
島津製作所 GCMS 2010plus 島津製作所
シトスタノール-5,6,22,23-d4シグマ・アルドリッチ680028
トリフルオロ酢酸ナトリウムシグマ・アルドリッチ1615138
ソラリックスXR 7T ブルカーダルトニックス
TimsTOF Pro Q-TOF ブルカーダルトニックス
U13Cグルコース シグマ・アルドリッチ389374
究極のRS3000 UHPLC サーモフィッシャーサイエンティフィック
VanGuard CSHTM プレカラム(5.0 & 2.1 mm; 1.7 & mu;m、130 Å)水

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