量子ドットラベリング技術を用いた ヘリコバクター・ピロリ の病原性の迅速検出とタイピング

サマリー

ヘリコバクター・ピロリの診断法は数多くありますが、その中でも量子ドット免疫蛍光法はヘリコバクター・ピロリを迅速にタイピングして検出することができ、臨床治療の決定の基礎となります。この記事では、ヘリコバクター・ピロリ菌のタイピングと検出における量子ドット技術の応用価値について詳しく説明します。

要約

本研究では、 ヘリコバクター・ピロリ 菌の病原性を迅速に検出し、タイピングを行う量子ドット標識技術に基づく手法を提示し、従来の診断法の限界を克服し、個別化臨床治療の基盤を提供することを目指します。キットはダブル抗原サンドイッチ法を用いて設計した。これには、バッファー反応システムの確立や、キット調製中の抗原抗体反応の活性化およびカップリングプロセスの実施など、一連の細心の注意を払ったステップが含まれていました。さらに、 ヘリコバクター・ピロリ菌の感染状態と病原性タイプを決定するためのサンプル収集、処理、および試験操作のための特定の手順がありました。さまざまな結果(ネガティブ、タイプII、タイプI)のデータモデルを確立することにより、タイピング検出における量子ドット技術の有効性が検証されました。ネガティブサンプルの場合、関連する検出領域に弱いまたは有意な信号値がありませんでした。II型サンプルでは、異なる抗体に対して陽性および陰性のシグナル値の特定のパターンが観察され、I型サンプルでは、主要な抗体に対応する陽性シグナル値の明確なセットが認められました。さらに、慢性胃炎や胃がんに関連する研究への適用は、スクリーニング指標として役立つ価値を実証しました。量子ドットベースの方法には、従来の診断方法と比較して感度や特異性が向上するなどの利点があります。しかし、サンプルの保存時間による潜在的な影響や比較的高いコストなどの課題も抱えています。しかし、絶え間ない技術革新により、将来的には ヘリコバクター・ピロリ 菌の検出や関連疾患の診断において、生物医学分野でより重要な役割を果たすことが期待されています。

概要

ヘリコバクター・ピロリ菌(H. pylori)は、胃前庭の幽門粘膜と粘膜下組織の間に見られるグラム陰性菌^です1,2。1994年、世界保健機関/国際がん研究機関(WHO/IARC)は、それをクラスIの発がん性物質として分類しました。液胞性細胞毒素A(VacA)と細胞毒素関連遺伝子A(CagA)毒素の発現の有無によって、I型ピロリ菌感染の毒性株(毒性が強く、患者に有害)の2種類に分けられます。胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃がんの発生率と密接に関連しているII型ピロリ菌感染は、病原性が弱い低病原性株を含み、一般的に軽度の消化不良として現れます^3,4。研究者は、I型の感染率がII型よりも高く、I型とII型の感染率はそれぞれ72.4%と27.6%であることを発見し^{ました5。}ピロリ菌の迅速な検出、特にI型とII型の区別は、臨床治療と疾患予防にとって非常に重要です。

ピロリ菌の感染による慢性胃炎は、^{感染患者において}、萎縮性胃炎、消化性潰瘍疾患、胃腺癌、粘膜関連リンパ組織(MALT)リンパ腫などの重篤な消化器系疾患を引き起こすことがある^6,7,8。2014年のGlobal Burden of Disease Studyでは、2010年以降、毎年10万人あたり約3.5人が消化性潰瘍疾患による死亡になると予測されています⁹。研究報告によると、2018年に世界中で新たに発生した胃がんの症例は約80万人で、ピロリ菌感染に関連していました¹⁰。近年、ピロリ菌感染は神経疾患、心血管疾患、糖尿病などとも密接に関連していることが研究で明らかになっています。 したがって、ピロリ菌感染の正確な検出は、関連疾患の検出にとって重要です。治療は極めて重要であり、ピロリ菌の正確な検出は研究のホットスポットとなっています。

ピロリ菌の感染率は中国で高いため、ピロリ菌の感染をタイムリーかつ正確に検出することは、早期発見と治療に役立ち、胃がんの予防と治療にプラスの意義があります。ピロリ菌の感染を検出するには、迅速ウレアーゼ試験(RUT)、胃粘膜組織切片の染色顕微鏡検査、内視鏡検査、C13またはC14尿素呼気検査などの侵襲的な方法など、さまざまな方法があります。(UBT)、ピロリ菌糞便抗原検査(SAT)およびその他の非侵襲的方法11,12,13。これらの検出方法には、いくつかの制限があります。例えば、組織学的検査では、生検部位で選択された生検サンプルの品質とサイズのために偽陰性の結果が出ることがあります。呼気検査は、患者が最近使用した抗生物質またはプロトンポンプ阻害剤(PPI)およびさまざまな影響因子11,14,15の影響によって影響を受ける可能性がある。従来の方法の限界、例えば、時間がかかり、感度と特異性が不十分であるなどを考慮すると、量子ドット免疫蛍光法(QD-IF)に基づく迅速診断法の開発は、バイオアッセイの分野で大きな応用の可能性を示している^16,17。QD-IF解析では、量子ドット蛍光プローブを導入し、分子標的への特異的結合を通じて分子標的を特異的に検出する^18,19。

量子ドットは、ボーア励起子半径より小さいまたは近い半径(一般に1〜10nm)を持つ半導体ナノ粒子です。量子ドットは蛍光プローブとして使用されます。蛍光シグナルは励起量子ドットによって生成され、デバイスを測定することで定量データが得られます。その利点には、幅広い励起波長、狭い発光波長、調整可能な蛍光サイズ、高感度、良好な光学安定性、長い蛍光寿命、大きなストークスシフト、および高い量子蛍光効率が含まれます。量子ドットは、発光時間が短い、正確な環境要件、再現性の低さ、安定性の低さ(蛍光色素など)、酵素の不活性化、感度の低さなど、他のマーカーの欠点を克服します。量子ドット蛍光免疫測定法は、量子ドット蛍光免疫測定法とバイオマーカー蛍光免疫測定法の利点を組み合わせ、簡便性、迅速性、高特異性、高感度という利点を持っています^20,21。

細菌培養、尿素呼気検査、血清学的検査など、ピロリ菌検出のための従来の診断ツールには、独自の限界があります。細菌の培養には時間がかかり、厳格な実験室条件が必要であり、ピロリ菌の増殖要件が厳しいため、感度が比較的低くなることがよくあります。尿素呼気検査は、抗生物質やプロトンポンプ阻害剤22,23,24の最近の使用など、特定の状況下で偽陰性の結果をもたらす可能性があります。血清学的検査では、場合によっては現在の感染状態ではなく過去の曝露を示すことしかできず、病原体の異なる病原性タイプを区別する能力が欠けています。

対照的に、量子ドット免疫蛍光法(QD-IF)技術は、有望な代替手段として浮上しています。QD-IFは、高い蛍光強度、狭い発光スペクトル、優れた光安定性など、量子ドットの優れた光学特性と免疫反応の特異性を兼ね備えています。これにより、生体サンプル中の ピロリ菌 の抗原または抗体を迅速かつ高感度に検出することができます。さらに、従来の方法では達成に苦労している感染株の病原性タイプを同時に特定できるという独自の利点があります。診断プロセスのこのギャップを埋めることで、QD-IFテクノロジーは、 ピロリ菌 感染症の診断と管理の方法に革命をもたらし、より個別化された効果的な医療介入を促進する大きな可能性を秘めています。

全体として、 ピロリ菌 感染とその病原性タイプ(I型およびII型)を同時に検出できる非侵襲的で効果的な診断方法が緊急に臨床的に必要とされています。この記事では、QD-IF法を使用して組織サンプル中の ピロリ菌 感染の存在を評価し、 ピロリ菌 感染タイプを迅速かつ正確に検出する方法を構築することを目的としています。 ピロリ菌 感染とその病原性タイプの迅速な検出は、精密医療の実現、治療効果の向上、関連疾患のリスク低減、胃がんの予防にとって非常に重要です。これは、臨床スタッフが正確な ピロリ菌 感染検出方法を選択するための科学的理論的基礎を提供します。

プロトコル

この研究 (KY2025-191-01) は、南医科大学広東省人民病院 (広東医科学院) のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。この記事は、インフォームドコンセントの免除の申請に準拠しています。

注: この研究は、量子ドット技術を使用して、参加者の血液種に ヘリコバクター ピロリ ウレアーゼ (ウレアーゼ) 抗体、液胞細胞毒素 A (VacA) 抗体、および細胞毒素関連遺伝子 A (CagA) 毒素抗体が含まれているかどうかを診断するためのキットを設計および開発することを目的としています。 この設計キットは、二重抗原サンドイッチ法を使用して、 ヘリコバクターピロリウレア ーゼ抗体、CagA抗体、およびVacA抗体を測定します。目的物質を含む試験サンプルをサンプルパッドに加えると、サイフォン作用により量子パッドと膜を流れ、固相抗原抗体複合体が形成されます。スポッティング後、検出ラインと質量がそれぞれ分析器によって読み取られます。コントロールラインの信号値を用いて、3つの抗体それぞれのT/Cシグナル値に基づいて、浦瀬抗体、CagA抗体、VacA抗体の陰性状態と陽性状態を判断します。設計図を 図 1 に示します。

図1: ピロリ菌 のタイピングテストカードの概略図。 この図は、テストカードの構造と構成を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. キットの準備

2. コーティングプレートの調製

1. 量子パッドの準備
   1. 量子ドット標識 されたピロリ菌 抗原複合体を量子ドット希釈バッファーで1:5に希釈し、バッチ生産に応じて必要な量を調製します。
   2. クォンタムパッドを手に取り、フィルム噴霧器を使用して一定量の量子ドット標識 ピロリ菌 抗原複合体をパッドに均一に噴霧し、37°Cで30分間乾燥させます。
2. メンブレン調製
   1. 印刷バッファーを使用して、制御ラインとテストラインのコーティング材料を希釈し、バッチ生産量に応じて必要な量を準備します。
   2. ポリ塩化ビニル(PVC)プレートにニトロセルロースメンブレンを貼り付け、フィルムスクラッチゴールドスプレーを使用して、メンブレン上の品質管理ラインとテストライン材料を均一にコーティングし、57°Cで24時間乾燥させます。

3. 組み立て

1. クォンタムパッドとサンプルパッドをフィルムコーティングされたPVCプレートに順番に貼り付けます。

4.ストリップにカットする

1. ストリップカッターを使用して、組み立てた大きなボードをテストストリップにカットします。

5.インナーパッケージ

1. キットの構成要件に従ってパッケージを完成させます。
   注:キットのコンポーネントは次のとおりです:(i)テストカード:テストストリップシェルとテストストリップで構成されています。テストストリップは、PVCプレート、サンプルパッド、量子パッド(量子ドットで標識された抗原複合体、複合体にはウレアーゼ抗原、CagA抗原、VacA抗原、およびマウスIgGが含まれています)、ニトロセルロース膜(検出領域はVacA抗原、CagA抗原、およびウレアーゼ抗原(組換え抗原真核生物発現)で固定され、品質管理領域はヤギ抗マウスIgG(ヤギポリ抗体)でコーティングされています)、 と吸収紙。パッケージ仕様が異なれば、テストカードの量も異なります。1人の試薬には1枚のテストカードが必要です。(ii)SDカード:1個/箱。テストキットの異なるバッチのテストカードとセキュアデジタル(SD)カードのコンポーネントを混在させてはなりません。

6. サンプル処理

注:サンプル収集については、National Clinical Laboratory Operation Proceduresを参照してください。

1. 分離ゲルチューブに血液を採取します。溶血しないように注意してください。
2. 分離した血清サンプルを室温(RT)で4時間以内に試験します。時間内にテストできない場合は、サンプルを2〜8°Cで3日間保管してください。長期(1年以内)の場合は、-20°C未満で密封して保管してください。
3. サンプルをRTに戻し、使用前に十分に混合します。
   注:凍結および解凍されたサンプルは、使用前に完全に解凍する必要があり、凍結融解サイクルの数は5を超えてはなりません。凍結融解サンプルを繰り返すと、分析種が劣化する可能性があるため、避ける必要があります。重度の乳びや溶血のサンプルもテストに影響を与えるため、避ける必要があります。

7. 試験の手順

1. 試薬キットと品質管理材料を取り出して、RTに平衡化します。
2. サンプル調製:全血サンプルを1467gで10分間遠心分離します。
3. SDカードのロット番号が試薬キットのロット番号と一致していることを確認します。SDカードを機器に挿入して、自動キャリブレーションを行います。
4. 機器とオペレーティングコンピュータの電源を入れます。指定したソフトウェアを起動し、 テスト モジュールを選択します。 「初期化設定 」を選択して装置を初期化し、正常に完了するのを待ちます。
5. 装置の試薬エリアにアクセスし、テストカードスロットを取り外します。試薬キットを開き、必要な数のテストカードを選択します。
6. テストカードのホイルポーチを開き、指定された向きに従ってスロットに入れます。カードスロットを機器の試薬領域に再度挿入します。
7. 品質管理(QC)試験
   1. テストモジュール内で、[手動入力]を選択します。「Information Entry」をクリックし、特定のQC材料情報を入力します。「生成」をクリックします。QC材料を指定されたサンプルラックに置き、正しい順序と向きを確保します。
   2. 「テストの開始」をクリックして、QCテストを開始します。装置のサンプルニードルは、サンプルの80μLを吸引し、サンプルウェルに垂直に分注します。装置は、サンプル分注後、自動的にタイミングを開始します。15分後、機器は検出を実行し、測定値を読み取り、結果を出力します。
8. サンプルテスト: テスト モジュール内で、[ 双方向LIS]を選択します。試験するサンプルを指定されたサンプルラックに置き、適切な順序と向きを確保します。 [テストの開始] をクリックします。この装置は、同様にそれぞれから80μLのサンプルを吸引し、QCプロセスと同じように処理します。
9. テストが完了したら、使用済みのテストカードを機器から取り出し、医療廃棄物として廃棄します。

8. 品質管理

1. H.ピロリ 陰性: ヘリコバクター・ピロリ 陰性参照製品、すなわちウレアーゼ抗体、CagA抗体、VacA抗体の結果がすべて陰性であることを確認してください。
2. H. pylori type II感染症: ヘリコバクター・ピロリ II型参照産物、すなわちUlease抗体が陽性であり、CagA抗体とVacA抗体の結果がすべて陰性であることを確認してください。
3. H.ピロリ I型感染: ヘリコバクターピロリ I型参照製品、つまりウレアーゼ抗体が陽性、CagA抗体、および/またはVacA抗体が陽性であることを確認してください。

9. 結果分析

1. 弱いまたは非毒素性の株によるII型感染:Urease抗体の測定値が陽性で、CagA抗体とVacA抗体の測定値が陰性の場合、弱いまたは非毒素性の ピロリ菌 株の感染と解釈します。
2. 高病原性毒素産生株によるI型感染:ウレアーゼ抗体の読み取り値が陽性で、CagA抗体またはVacA抗体の読み取り値のいずれかが陽性、または両方が陽性の場合、高病原性 ピロリ菌 毒素産生株の感染と解釈します。
3. ネガティブ:ウレアーゼ抗体、CagA抗体、VacA抗体の測定値がすべて陰性の場合、 ピロリ菌 株に感染していないと解釈してください。
4. 無効:装置が結果を無効と判断した場合は、誤った操作または試薬キットの失敗を確認し、手順を再試行してください。

10. 蛍光分析装置の校正

1. まず、アナライザーの電源を入れ、約15分間ウォームアップしてパフォーマンスを安定させます。次に、メーカーから提供されたキャリブレーションスタンダードをサンプルホルダーに挿入します。
2. 次に、分析器のインターフェースでキャリブレーション機能にアクセスし、プロセスを開始します。分析装置は、標準の蛍光を自動的に検出し、プリセットされた参照値に一致するように内部パラメータを調整します。
3. その後、キャリブレーションスタンダードを取り外し、ブランクサンプルを挿入して、読み取り値が許容範囲内にあることを確認します。
4. 推奨スケジュールに従ってこれらの手順を定期的に繰り返すことで、分析器の精度を維持し、信頼性の高い測定を行うことができます。

結果

図2は、量子ドット蛍光免疫分析装置の動作原理を示しています。主に、励起光源、受光光源、光電変換回路モジュール、信号処理回路、AD値変換回路、および信号処理計算モジュールで構成されています。励起光源は蛍光マーカーを生成します。同程度の波長の単色光を吸収し、単色光は励起光路を通じて試薬ストリップの固定走査点(試薬ストリップの検出窓上)を照射します。スキャンポイント付近(試薬ストリップの検出ウィンドウ上)の蛍光物質は励起されて蛍光を発します。収集光路が迷光をフィルタリングした後、特定の波長の蛍光が収集され、光電変換回路モジュールに集束されて光信号を電気信号に変換し、信号処理回路を通過し、AD値変換回路が電気信号を数値に変換し、増幅システムを介して増幅します。信号処理計算モジュールを通過した後、測定対象の物質の濃度は特定のアルゴリズムによって計算されます。

ディスカッション

ヘリコバクター・ピロリ菌の現在の診断法は、主に侵襲的と非侵襲的の2つのカテゴリーに分けられる²⁶。迅速ウレアーゼ試験(RUT)、組織学、分子生物学、細菌培養などの方法には、侵襲性、感度、特異性、時間的制約、コスト、機器要件、サンプルの取り扱い、およびリアルタイムモニタリングに制限があります。より一般的なのは、尿素呼気検査、糞便抗原、血清学的抗体検査などの方法を使用した迅速な体外診断です。ただし、尿素呼気テストに影響を与える多くの要因があります。同時に、操作手順は基本的に被験者が独立して完了し、操作仕様22,23,24の品質に違いがあります。糞便抗原検査は、被験者から糞便サンプルを採取する必要があり、実際の手術では非常に不便です。さらに、感度が低く、検出を見逃しがちです。血清学的抗体の検出は上記の側面で改...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)	シグマ	25952-53-8	5 g /ボトル
2-(n-モルヒネ)エタンスルホン酸(MES)	シグマ	145224-94-8	100 g /ボトル
心分離機	シグマ	3K15
蛍光免疫分析装置	広州 Labsim Biotech Co.,Ltd	広東省医療機器登録番号2017221743
ヘリコバクターピロリタイピングテストキット	重慶 iSIA BIO-Technology Co., Ltd	国家医療機器登録番号 20203400330	QDs 免疫蛍光法
N-ヒドロキシチオコクシンイミド (NHS) のナトリウム塩	グマ	106627-54-7	1 g/ボトル