全血からの低密度および正常密度好中球の単離と特性評価

サマリー

ここでは、磁気分離(ネガティブセレクション)と不連続密度勾配培地を使用して、全血から低密度および正常密度の好中球を分離するための信頼性の高いアプローチを提供します。高純度細胞(≥93%)を手つかずで分離し、健康や疾患における好中球亜集団の役割を理解するために重要な、好中球亜集団の正確な下流分析を促進します。

要約

新たな研究によると、ヒトの循環好中球集団は多様なサブタイプで構成されており、歴史的に行われてきたように単一の集団として研究すべきではないことが示されています。特に、低密度および正常密度の好中球(LDN、NDN)は、機能的および代謝的に異なるプロファイルを持つことが示されており、好中球研究を発表する際に考慮しなければならない要素です。ここでは、全血からLDNとNDNを手つかずで単離および分離するための改良された方法を紹介します。

密度グラジエント培地(1.135 g/mL)を9:10で10x PBSと混合します。その後、100% 密度勾配培地と 1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を組み合わせることにより、55%、70%、81% の比密度勾配が得られます。ネガティブ選択ベースの磁気分離キットを使用して同意したドナーから得られた末梢全血12mLから単離された好中球は、55%画分に再懸濁されます。81%および70%のフラクションの3mLの容量を15mLチューブに層状にし、続いて総好中球を含む55%フラクションを層状にします。次に、密度勾配を720 x g で30分間遠心分離します。55%/70% インターフェイス (LDN) と 70%/81% インターフェイス (NDN) で 2 つの異なるバンドが取得されます。細胞を慎重に別々のチューブにピペットで移し、PBSを使用して洗浄します。単離された画分の純度は、フローサイトメトリーを用いて決定します。LDNとNDNはどちらも、フローサイトメトリーによりCD14lo CD15+ SSChiと定義されました。単離純度は、両タイプについて生細胞の≥93%で計算しました。

この方法は、末梢血からLDNとNDNを分離するための信頼性と効率的なアプローチを提供し、単離された細胞の高純度と生存率を確保します。好中球単離の精度を高めることで、これらの異なる好中球亜集団の下流解析をより正確に行うことができます。これらは、好中球の不均一性と、さまざまな生理学的および病理学的状況におけるその意味についての理解を深めるために重要です。

概要

好中球は顆粒状の免疫細胞であり、末梢血中に最も豊富な白血球であり、平均して白血球の約50〜70%を占めています。それらは顆粒球-単球前駆細胞(GMP)から骨髄で発生し、GMPは顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)の存在下で造血前駆細胞(HPC)から発生します。恒常性では、寿命は~24時間ですが、研究によると、特定の生理学的条件や、慢性免疫活性化¹、炎症¹、さらには定^{常状態での}組織居住2などの関連微小環境下でも寿命を延ばすことができることが示されています。好中球は、脱顆粒、食作用、好中球細胞外トラップ(NET)の活性化と放出(NETosis)という3つの主要なエフェクター機能を通じて、病原体に対する防御の最前線であると長い間考えられてきました。

好中球の機能と生物学に関するほとんどの研究では、好中球の全集団の結果を調べています。しかし、N1(抗腫瘍)/N2(腫瘍誘発性)のサブタイプを描写するがん環境での研究から、成熟度、疾患、生理学的状態に基づく好中球の分類、さらには細胞密度(低密度および正常密度の好中球)まで、ヒト好中球集団が表現型的に多様なサブタイプを構成することがますます明らかになっています。これらの好中球サブタイプの存在が、完全に異なる細胞型であることに起因するのか、それとも可塑性の複雑な性質によるものなのかにかかわらず、非定型好中球に関する文献は増え続けており、正常密度の好中球3とは別に低密度の好中球を研究する魅力的な機会^{を提供しています。}

SLE患者で初めて炎症誘発性好中球サブセット⁴として記載されたLDNは、それ以来、慢性疾患、妊娠、さらには健康な循環において、炎症誘発性および抑制能力^5,6,7,8で同定されています。LDNは、全血を密度勾配培地上で遠心分離すると、末梢血単核細胞(PBMC)と同時に検出されます。その比重は約1.077 g/mLに相当しますが、NDNは1.083 g/mLです⁹。このテーマについてはまだかなりの議論がありますが、LDNはより未熟な顆粒球の表現型(前骨髄球や骨髄球に似ており、密度は1.080 g / mL未満)に似ているという憶測があります^9,10。他の人々は、疾患の有無によって成熟LDN表現型と未成熟LDN表現型の両方が存在すると推測している11,12,13。それにもかかわらず、LDNは健康な個人でも検出されています。ただし、十分な数でそれらを分離することが難しいため、一部の研究に含めることは制限されています⁵。

この研究は、これら2つの集団を、下流のin situ代謝実験(最小0.5 × 10⁶細胞/mL)を行える量で単離することを目的としていました。その際、既存のプロトコル⁵を、一般的に報告されている表現型^{マーカー13,14}を用いて最適化し、全血からLDNおよびNDNを単離および特性評価するための最良の結果を提供した(図1A)。

プロトコル

血液サンプルは、健康な参加者からのインフォームド コンセントに基づいて収集されました。この研究は、セントジェームズ病院とタラト大学病院の両方の研究倫理委員会から承認を受けました。

1. 密度勾配培地、等張性作業溶液、フラクション、細胞分離バッファーの調製

1. 密度勾配媒体からの等張作業溶液の調製
   1. 等張性 100% 作業溶液 (~1.123 g/mL) の調製
      1. 等張性100%ワーキング溶液を調製するには、27 mLの密度勾配培地と3 mLの10x PBSを組み合わせます。これにより、さらなる希釈に適した等張溶液が得られます。
   2. 等張性 81% 使用溶液 (~1.0996 g/mL) の調製
      1. 8.1 mLの等張性100%使用溶液(ステップ1.1.1で調製)と1x PBS1.9 mLを混合して、等張性81%使用溶液を調製します。均一性を確保するために十分に混合します。
   3. 等張性 70% 作業溶液 (~1.0861 g/mL) の調製
      1. アイソトニック70%ワーキング溶液を調製するには、7 mLのアイソトニック100%ワーキング溶液と3 mLの1x PBSを組み合わせます。溶液が十分に混合されていることを確認してください。
   4. 等張性55%作業溶液(1.0676 g/mL)の調製
      1. 5.5 mLの等張性100%使用溶液と4.5 mLの1x PBSを混合して、等張性55%使用溶液を作成します。よく混ぜます。
2. グラデーションフラクションのレイヤー化
   1. グラデーションフラクションのレイヤー化
      1. 15 mLのコニカルチューブを使用して、底部に3 mLの等張性81%ワーキング溶液を慎重に重ねます。次に、3 mLの等張性70%ワーキング溶液をゆっくりと穏やかに重ね、層が混在しないようにします。この勾配は、細胞分離に使用されます。
3. 細胞分離バッファーの調製
   1. 500 mLの細胞分離バッファーの調製
      1. 細胞分離バッファーを調製するには、2%ウシ胎児血清(FBS)と1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を1x PBSと組み合わせ、総容量500 mLにします。このバッファーを使用して、単離プロセス中に細胞を洗浄し、再懸濁します。
         注意: レイヤーが十分に分離され、邪魔されていないことを確認してください。このプロトコルでは、等張性ワーキング溶液は、調製方法に基づいて「100%」、「81%」、「70%」、および「55%」と呼ばれ、以前の研究⁵と一致しています。ただし、これらのラベルは作業溶液の実際の最終濃度を表していないことを明確にすることが重要です。例えば、「100%」密度グラジエント培地は、27 mL の純密度グラジエント培地と 3 mL の 10x PBS を混合して調製され、最終濃度は 90% アイソトニックワーキング溶液になります。その後の希釈(例:「81%」、「70%」、および「55%)」は、真のパーセンテージ濃度ではなく、調製比を同様に反映します。この命名法は、この主題に関する以前の文献で使用されていた用語との一貫性を維持するために保持されました。

2. ネガティブセレクションによる全血からの好中球の単離

1. 磁気ビーズの調製
   1. 磁気ビーズを30秒間完全にボルテックスして、使用前に完全に再懸濁されていることを確認します。
2. 血液の準備
   1. ドナーごとに、全血4 mLを3つの別々の14 mL丸底チューブに分注します。.
3. 好中球単離カクテルと磁気ビーズの追加
   1. 各チューブに、血液1 mLあたり50 μLの好中球単離カクテルと50 μLの磁気ビーズを加えます。血液4 mLに対して、各試薬200 μLを添加します。
   2. ピペッティングで穏やかにピペッティングして混合物を十分に懸濁し、室温(RT)で5分間インキュベートして、試薬が不要な細胞に結合するまで待ちます。
4. 洗浄と磁気分離 - 最初のラウンド
   1. Cell Separation Bufferを使用して各チューブを12 mLに補充し、十分に混合します。
   2. 蓋をせずにチューブを磁石に置き、RTで10分間インキュベートして、不要な細胞に結合した磁気ビーズをチューブ壁に引き寄せます。
5. 非結合セルのコレクション
   1. 好中球を含む透明細胞懸濁液を、トランスファーピペットを使用して、各チューブから新しいきれいなチューブに慎重に移します。元のチューブを磁石から取り外します。
6. 磁気ビーズの再塗布とインキュベーション - 第2ラウンド
   1. 磁気ビーズを再度30秒間ボルテックスします。ステップ2.3と同じ量の磁気ビーズを、新しく移したセル懸濁液に加えます。十分に再懸濁し、室温でさらに5分間インキュベートします。
7. 最終的な磁気分離と収集
   1. チューブを蓋のない磁石に戻し、室温でさらに10分間インキュベートします。
   2. 透明細胞懸濁液を新しいチューブに慎重に移します。この最終的な懸濁液は、単離された全好中球集団を表します。

3. 全好中球集団からの低密度好中球(LDN)と正常密度好中球(NDN)の分離

1. 細胞懸濁液のプーリングと調製
   1. 各ドナーについて、単離された好中球懸濁液を50mLチューブにプールします。細胞分離バッファーを使用して、各チューブを総容量50 mLまで補充します。
2. 遠心分離
   1. ブレーキをかけた状態で、チューブを400 x g でRTで5分間遠心分離します。
3. 再懸濁と細胞計数
   1. 上清を捨て、好中球ペレットを1 mLの細胞分離バッファーに再懸濁します。細胞数を実行して、好中球の総数を決定します。
4. 密度グラジエント培地調製
   1. ブレーキをかけた状態で、チューブを再び400 x g でRTで5分間遠心分離します。上清を捨て、好中球ペレットを55%密度勾配培地の3mLに再懸濁します。最適な分離を得るには、5-6 × 10⁶ total neutrophils あたり 3 mL の 55% 密度グラジエント培地を使用します。
   2. 必要に応じて、再懸濁した細胞を複数の既製の密度勾配チューブに分割し、3 mLの細胞懸濁液が各チューブに層状になるようにします。
5. 密度勾配チューブへのレイヤー化
   1. 55%密度勾配培地を含む3mLの細胞懸濁液を、既製の密度勾配チューブ(セクション1で説明したように調製)にゆっくりと重ねます。グラデーションを乱さないように、慎重なレイヤーを確保してください。
6. 密度勾配遠心分離
   1. ブレーキを使用せずに、チューブを720 x g で30分間遠心分離します。遠心分離後は、層を乱さないようにチューブを慎重に取り扱ってください。
7. 好中球画分の単離
   1. 遠心分離後、好中球が2つの異なる層に分離するのを観察します。
      低密度好中球 (LDN) は 55%/70% 界面に位置し、約 3 mL マークで上部バンドを形成し、正常密度好中球 (NDN) は 70%/81% 界面にあり、6 mL マーク付近で下部バンドとして現れます。
   2. トランスファーピペットを使用して、各層を慎重に分離し、それらを別々の15 mLチューブに移します。
8. 分離されたフラクションの洗浄
   1. 残留密度グラジエント培地を洗い流すには、各15 mLチューブに1x PBSを15 mLマークまで追加します。
   2. ブレーキをオンにした状態で、RTで400 × g で5分間遠心分離します。細胞が固いペレットを形成せず、代わりに懸濁したままの場合は、この洗浄ステップを繰り返して、残りの密度勾配培地の存在を示します。
9. 細胞数およびダウンストリームアプリケーション
   1. 各画分中の細胞をカウントし、必要に応じて代謝実験、フローサイトメトリー染色、RNA抽出、タンパク質溶解などの下流アプリケーションに進みます。
      注:セルをめっきアウトした後、プレートを210 × g で1分間スピンダウン(ブレーキオフ)することをお勧めします。

4. 単離されたLDNとNDNの表現型

1. ~0.5-1 × 10⁶ LDNs and NDNs を単離します。CD14、CD86、CD15、CD16、CD10、Fc ブロック、および生存率染色を使用して、2倍濃縮抗体マスターミックスを作成します。
2. 単離したLDNおよびNDN集団を等量の抗体マスターミックスで染色し、細胞を染色する抗体の最終希釈率がそれぞれ1:100(CD14、CD86、CD15、CD16、CD10、Fcブロック)および1:50(生存率染色)になるようにします。
3. 室温で暗所で細胞を10分間インキュベートします。
   注:細胞が抗体マスターミックスおよびFcブロックと完全に混合されていることを確認してください。
4. 細胞をPBSで一度洗浄し、次に400 × g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
5. 細胞を1%パラホルムアルデヒド(PFA)に15分間、暗所の室温で固定します。
6. 細胞をPBSで再度洗浄し、400 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
7. 細胞を200 μLのPBSに再懸濁するか、必要に応じて使用するために、できるだけ早くフローサイトメーターで細胞を採取します。
   注:染色および固定された細胞は、蛍光色素の光退色を防ぐために、暗所で4 ^°Cで短期間保存できます。しかし、理想的には、最適な細胞生存率と正確な結果を確保するために、染色と固定の直後に表現型検査を実施する必要があります。

結果

密度勾配媒体上に全好中球がうまく層状になることは、 図1Bで観察できます。2 つの異なるバンドを取得する必要があります。グラジエントの混合が発生した場合、またはチューブごとに層状になる好中球の総数が多い場合(約5-6×10⁶より大きい)、バンドは拡散して見え(図1C)、2つの好中球サブタイプが混合するリスクが大幅に増加します。後者を避けるために、密度勾配チューブごとに最大5〜6個×10個⁶ 個の全好中球を重ねることをお勧めします。健康な人ではLDNの数が非常に少ないため、下流の研究では達成できないという報告がありますが、この方法では、健康な参加者からのLDN(平均3.28 × 10⁶ 細胞/mL)とNDN(平均10.64 × 10⁶ 細胞/mL)の両方の良好な収量と純度が示されています(図2)。

LDNの平均単離純度は...

ディスカッション

ここでは、好中球の全集団を低密度と正常密度の好中球に分割する最適化された方法を紹介するとともに、^{以前の方法5}から適応したフローサイトメトリーを使用して各細胞タイプの表現型特性評価を行います。

このプロトコルは、全血からのLDNおよびNDNの単離に基づいています。重要なステップは、総好中球をネガティブセレクション法で単離することです。ポジティブセレクション法では、表面マーカーに結合する抗体を使用し、好中球を活性化し、脱顆粒を誘発する可能性があります⁵。この活性化は、好中球の機能的および代謝状態を変化させることにより、下流の実験を妨げ、不正確な結果をもたらし、実験結果の解釈を歪める可能性があります。したがって、ネガティブセレクションは、活性化や機能変化を誘発することなく好中球の単離を確実にします。さらに、ネガティブセパレーションベースの磁気絶縁を使用することで、赤血球(RBC)の溶解が不要になります。これにより、余分な洗浄ス...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
14 mL ポリプロピレン丸底チューブ (17 x 100 mm)	Corning Science	352059
APC 抗ヒト CD14 (63D3)	BioLegend	367118
Brilliant Violet 421 抗ヒト CD10 (25 テスト)	BioLegend	312217
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Sigma	D8537-1L
EasyEights EasySep マグネット	StemCell Technologies	#18103
EasySep Buffer (cell separation buffer)	StemCell Technologies	#20144
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit	StemCell Technologies	#19666
FcR Blocking Reagent, human	Miltenyi Biotec	130-059-901
FITC anti-human CD16 (3G8)	BioLegend	302005
OneComp eBeads Compensation Beads	イーバイオサイエンス株式会社	01-1111-42
PE/Cy7 抗ヒト CD86 (BU63)	BioLegend	374209
PE/Dazzle 594 抗ヒト CD15 (SSEA-1)	BioLegend	323037
リン酸緩衝生理食塩水錠	Gibco	18912-014
ゾンビ NIR 固定可能生存キット	BioLegend	423105