方法論記事

前臨床モデルにおける肺線維症の評価を強化するためのマイクロCTを使用した片側肺活量分析

DOI：

10.3791/67837

⸱

2025年6月20日

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、マイクロコンピューター断層撮影法(マイクロCT)を利用して、病変側の気管内注入を介して片側ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルの換気領域を定量化するプロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺線維症(PF)は、進行性で不可逆的な間質性肺疾患であり、予後不良と治療選択肢が限られていることを特徴とする。ブレオマイシンの気管内注入によって誘発される肺線維症の従来のマウスモデルは、薬物分布が不均一になり、死亡率が高くなる可能性があります。マウスにブレオマイシンを投与するための洗練された片側気管内点滴法により、より均一で制御された肺線維症モデルの作成が可能になり、ヒトでの疾患のシミュレーションが向上します。ここでは、マイクロコンピューター断層撮影法(マイクロCT)を利用して、病変側の気管内注入を介して片側ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルの換気領域を定量化するプロトコルを紹介します。このアプローチにより、全体的な肺活量と換気された肺領域を定量化することができ、疾患の進行と治療反応を高感度かつ正確に測定することができます。この研究では、麻酔、正確な薬物投与、マイクロCTスキャン、および画像分析のための3Dスライサーソフトウェアを使用した後処理が含まれます。ブレオマイシン治療後の片側肺活量解析では、対照群と比較して肺活量の有意な減少が示されました。Massonのトリクローム染色により、BLM処理マウスにおけるコラーゲンの存在と沈着の増加が確認されました。ここでは、マイクロCTを使用して片側肺容積分析を行うことにより、前臨床モデルの肺線維症を評価し、PF研究における治療介入を評価するための正確で徹底的な評価方法を研究者に提供しました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肺線維症(PF)は、治療法が限られている壊滅的で不可逆的な肺疾患です。PFの世界的な発生率は、100,000人あたり1〜13人の範囲で、年齢1が上がるにつれて有病率の大幅な増加が観察されます。過去数十年にわたる多大な努力にもかかわらず、PFの治療環境は依然として限られており、現在PF2の治療薬として承認されている抗線維化薬は、ニンテダニブとピルフェニドンの2つだけです。肺線維症の根底にある病因は非常に複雑で、分子生理学および細胞生理学のさまざまな側面を網羅しています3。さまざまな薬剤によって誘導される実験 的なin vivo 動物モデルは、現在、病原性メカニズムや疾患の表現型を調査するために不可欠なツールとなっています。

ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルは、気管内注入により投与され、根底にある細胞および分子メカニズムを解明し、潜在的な治療標的を同定するために広く認識されています4。しかし、気管内注入されたブレオマイシンの非対称で非選択的な分布は、主に不均一な線維症と両側性肺損傷により、高い死亡率につながる可能性があります5,6。この問題に対処するために、左肺内での実験薬の均一な送達を確保し、PF患者で観察される病理学的プロセスをよりよく模倣するための片側気管内投与アプローチを提案しました7,8,9。さらに、片側投与技術は、局所的な分布を必要とする薬物の評価や、特定の肺を標的とする他の実験的介入にも利用できます。

前臨床モデルでは、マイクロコンピューター断層撮影法(マイクロCT)は、肺の病状を調査するためにますます価値が高まっており、縦断的研究の強力なツールであることが証明されています。これは、疾患の進行と治療介入への反応を監視するための定性的および定量的データを提供できる10。マイクロCTは、総体積、換気された領域と換気されていない領域、気管支の形態、および組織密度を評価するために利用されています。これまでの研究に基づき、マイクロCTを用いて片側肺容積を解析し、肺線維症のマウスモデルにおける線維化レベルを評価する新しいイメージング法を開発しました7,8,9。この方法により、曝気された肺領域の定量化が可能になり、疾患の進行と治療に対する反応をより正確かつ高感度で測定できます。

この研究では、ブレオマイシンで治療したマウスのマイクロCTスキャンから導き出された片側換気肺活量分析法を紹介します。この革新的な方法は、肺線維症のより正確で包括的な評価を提供し、前臨床試験における治療介入の有効性の評価方法を変える可能性があります。この研究は、前臨床肺線維症モデルの解析に優れた改良をもたらし、疾患の進行に伴う治療効果を評価するための強力な定量解析方法を提供します。

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プロトコル

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すべての動物実験は、広州医科大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。実験は、6-8週齢、25-30gの雄C57BL/6マウスで行った。マウスは、食物と水への自由的なアクセスを備えた12時間の明暗サイクル(明暗:25ルクス)の下で飼育され、対照群とBLM群に無作為に割り当てられました。

1. 片側性肺気管内点滴

  1. C57BL/6 雄マウス (6-8 週齢、25-30 g) に 1% ペントバルビタール ナトリウム (50 mg/kg) の腹腔内注射を麻酔します。
  2. 呼吸数と四肢離脱反射を観察することにより、麻酔のレベルを監視します。
  3. マウスを70°〜90°の角度のプラスチックボードに仰臥位で固定し、切歯と手足で拘束します。
  4. 滅菌された鈍い先端の鉗子を使用して、舌を静かに引っ込めます。
  5. 小動物の喉頭鏡を使用してカスタムの22Gの鈍針を気管に挿入し、喉頭蓋と中咽頭の構造を視覚化します。ボードを反時計回りに-70°回転させて、左のメイン気管支をメイン気管支と平行に合わせます。抵抗が感じられるまで針を進めます。
    注:最適な挿入長さを確保するために、同様のサイズの練習用マウスを使用してカテーテルの長さを事前に測定します。
  6. 30°の角度まで素早く回転させ、40μLのブレオマイシン溶液(0.02mg)を注入します。針を外します。
  7. マウスを少なくとも30秒間所定の位置に保持して、適切な薬物分布を確保します。.
  8. マウスが温暖化ブランケットの上でうつ伏せに回復するのを待ちます。

2. マイクロCT(Micro-CT)スキャニング

注:マウスは、製造元の指示に従ってマイクロCTシステムを使用してスキャンされました。

  1. ブレオマイシン注入後3週間、マウスにマイクロCTスキャンを行います。
  2. 小動物用ガス麻酔器の気化器に適量のイソフルランを追加し、気化器の電源を入れ、誘導濃度を3%に調整し、マウスを誘導ボックスに入れます。
  3. 誘導ボックスからマウスを取り出し、スキャンテーブルに仰向けにして置き、マウスの手足を伸ばし、体を正中線に沿って整列させます。
  4. スキャンテーブルのイソフルラン維持濃度を1%に設定します。
  5. Micro-CTスキャンモードを設定します:横視野43 mm、解像度2K x 2K、ピクセルサイズ0.042 mm、スライス厚さ0.042 mm。
  6. スキャン後、マウスが目覚めるまでマウスを暖かい毛布の上に置きます。

3. マイクロCT後処理:片側選択的肺セグメンテーションと容積解析

注:画像処理と定量分析は、製造元の指示に従って、無料のオープンソースソフトウェア3Dスライサー(http://www.slicer.org)を使用して実行されました。肺窓の臨床ハウンズフィールド単位 (HU) 範囲を適用して HU 画像を正規化し、以前に報告された 8,9,11 のように、肺実質を正常通気領域 ([-1000、-350] HU) に分割しました。画像処理手順の概要は次のとおりです。

  1. 3D スライサーを開きます。操作インターフェースを 図 1 に示します。
  2. [ロード]をクリックして、イメージングデータをDICOM形式でインポートします。軸方向、冠状、および矢状方向の画像がメインインターフェースに表示されます(図2)。
  3. 図3に示すように、矢状ビューに関連するパラメータを調整します(オプション)。(1:非表示のオプションを表示する、2:現在のボリュームの名前を変更する、3:新しい名前を入力)。
  4. Segment Editorモジュールで、Add(追加)をクリックして、選択的肺分析(右肺)のセグメンテーションを作成します(図4)(1:ボリューム、2:セグメントエディタ、3:セグメントの追加、4:しきい値の設定、5:しきい値範囲の調整、6:マスキングに使用、7:球体ブラシの設定)。
  5. しきい値の範囲を [-1000, -350] HU に調整し、[ マスキングに使用 ] オプションを有効にします。
  6. ペイント ツールと球体ブラシを使用して、目的の肺領域をセグメント化します。
  7. アイランドツールを選択し、選択したアイランドを保持を選択します。右肺を強調表示し、[Show 3D]をクリックして、視覚化パネルに3Dモデルを表示します(図5)(1:島(接続されたコンポーネント)の編集、2:[選択した島を保持]の選択、3:3Dモデルの表示)。
  8. 用語パネルで、3Dモデルの色を青に変更します(オプション)。
  9. 左肺について手順3.4〜3.6を繰り返します。軸性胸部CT画像をレイヤーごとに処理して、人工呼吸器の左肺容積を計算し、3Dモデルを作成します(図6)。
  10. 3D左肺モデルの色を黄色に変更します(オプション)。
  11. 右肺セグメンテーションの不透明度を 0.2 に設定します。
  12. 必要に応じて3Dモデルをエクスポートします(図7)。
  13. 3Dビューのスクリーンショットをキャプチャするか、画像をスライスして保存します(図8)(1:注釈スクリーンショット、2:画像の形式を選択、3:保存パスを変更します)。
  14. Segment Statisticsモジュールを使用して、各セグメントの肺活量(mm3)を計算し、正常通気領域の定量分析を実行します(図9)。

figure-protocol-1
図1:3Dスライサーソフトウェアのインターフェース。 この図は、3Dスライサーソフトウェアの主な操作インターフェースを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-2
図2:マウスの片側気管内注入によって誘発された肺線維症のCT画像。 軸方向、冠状、矢状面のビュー、およびブレオマイシン点滴後の 3D 肺再建。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-3
図3:矢状図のパラメータ調整。 この図は、パラメータの調整を示しており、正確な視覚化と分析を可能にします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:セグメンテーション編集とパラメータ調整 この図は、セグメンテーション編集のプロセスと対応するパラメーターの調整を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-5
図5:右肺の3Dセグメンテーション。 このプロセスには、肺セグメンテーションの接続されたコンポーネントの編集(ステップ1)、右肺を分離するための 選択 島の選択(ステップ2)、視覚化パネルでモデルをレンダリングするための 3Dの表示 (ステップ3)の3つの連続したステップが含まれます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-6
図6:マイクロCT解析に基づく左肺の3D再構成。 軸性胸部CT画像をレイヤーごとに処理して、曝気領域をセグメント化し、換気量を定量化し、3Dモデルを再構築しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-7
図7:片側性肺線維症モデルにおける換気肺量のマイクロCT分析に基づく3D肺再建。 再構築されたモデルは、指定された形式で事前定義されたディレクトリにエクスポートされました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-8
図8:画像保存のガイド この図は、 Annotation Screenshot メニューからの保存機能の開始から、形式の選択と保存パスの定義まで、画像を保存するための一連の手順の概要を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-9
図9:片側性肺線維症モデルにおけるマイクロCTに基づく統計解析。 ノルモエアレーション領域から得られた定量的データを分析しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. マッソンのトリコーム染色

  1. 肺サンプルを4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で一晩固定し、等級別エタノールシリーズを使用して脱水し、パラフィンに包埋します。ロータリーミクロトームで厚さ5μmのスライスを調製します。
  2. Massonのトリクローム染色を切片に対して以下のように行います。
    1. 脱パラフィン化および再水和した切片を蒸留水ですすぎ、続いて予熱したBouin Fluidで56〜60°Cで1時間またはRTで一晩媒染剤処理を行います。
    2. 洗浄後、切片をヴァイゲルトの鉄ヘマトキシリン溶液で10分間染色し、流水で10分間すすぎ、ビーブリッヒ緋色酸フクシン溶液に10〜15分間浸します。
    3. ホスホモリブディ-リンタングステン酸溶液を使用して10〜15分間分化し、コラーゲンに富む領域が赤から透明に遷移するまでモニターします。
    4. 次に、スライドをアニリンブルー溶液に直接5〜10分間移し、蒸留水ですすぎ、1%酢酸溶液で2〜5分間分化します。
    5. 等級付けされたエタノール(95%から無水アルコール)による脱水とキシレンの清澄化の後、切片を樹脂状媒体で取り付けます。

5. Massonのトリクローム染色機械学習解析

  1. Massonのトリクローム染色を使用して、コントロール肺およびブレオマイシン治療肺のコラーゲン組成分析を組織病理学的に評価します。
  2. 観察者に依存するバイアスを減らすには、ホールスライドイメージスキャナーを使用して、染色された肺切片の高解像度デジタル画像を取得します。
  3. 次いで、自動ソフトウェア軌道画像解析8,9,12を用いてコラーゲン領域を定量的に解析する。トレーニングプロセスについて、以下で簡単に説明します。
    1. 各組織カテゴリー(コラーゲン、正常組織、線維性組織など)の代表的なアノテーションをいくつか手動で描きます。注釈付き学習領域から抽出されたピクセル単位の特徴を使用して、サポート ベクター マシン (SVM) の学習セットを構築します。
    2. Masson染色切片の場合、組織分類をコラーゲン、正常組織、バックグラウンドの3つのカテゴリーに定義します。
      注:機械学習モデルは、病理医が検証した評価によって正確な組織分類が確認されるまで、注釈付けと改良を繰り返すことにより、ホールスライド画像(WSI)の反復トレーニングを受けます。満足のいく分類精度が達成されると、プロセスは完全に自動化され、有効な関心領域(ROI)内の各ピクセルから特徴が抽出され、その後、SVMは対応する組織カテゴリーを高精度で予測します。

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結果

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図10A-Dは、肺活量の変化と染色分析の結果を示しています。

ブレオマイシン(BLM)が肺組織に及ぼす影響を評価するために、3Dイメージング技術を用いて、生理食塩水治療群(Ctrl)とBLM治療群の肺容積の比較解析を行った。左肺容積の定量化(mm3)は、BLMグループで有意な減少を示しています(図10A、C)。

Massonのトリクローム染色は、肺組織における線維症の特徴であるコラーゲン沈着の程度を評価するために採用されました。定量的な結果では、BLMグループでMasson陽性染色が有意に増加していることが示され、BLMグループがコラーゲンなどの細胞外マトリックスを大量に分泌したことが示されています(図10B、D...

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ディスカッション

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肺線維症は、肺組織の進行性の瘢痕化を特徴とする壊滅的な疾患であり、肺機能の低下、最終的には呼吸不全につながります1。さまざまな薬理学的薬剤と投与方法によって誘導される肺線維症マウスモデルは、疾患の進行を理解し、特にブレオマイシン気管内注入における潜在的な治療法の有効性を評価するために不可欠なツールです13。ただし、ブレオマイシン気管内点滴モデルには、肺全体のブレオマイシンの不均一な分布や、点眼の非選択的性質による死亡率が高くなる可能性があるなどの制限があります。この研究では、薬剤の片側気管内投与について説明します。このアプローチには、両側気管内投与に対する従来のアプローチに比べて、2 つの異なる利点があります。まず、この方法では、通常はマウスの1つの葉からなる左肺への選択的な片側投与が可能になります。この解剖学的特徴は、マウスを振るとともに、薬物分布の均一性を促進します。さらに、片側性肺疾患モデルでは、対側の健康な肺をコントロールとして機能させることができ、治療を受けた肺と未...

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開示事項

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著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学基金会(82300092)からの助成金、国家呼吸器疾患重点研究所の独立研究(SKLRD-Z-202302)、および広東省研究機関のイノベーション能力開発プロジェクト(KD032024001)の資金提供によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.9%生理食塩水ホープバイオHBPP008-100
22G鈍針BDの383922
3Dスライサー 画像コンピューティングプラットフォーム3Dスライサー https://www.slicer.org/
ブレオマイシンMCEのハイ-17565
イソフルランRWDのR510-22
マッソンステインキットイェン60532ES58
マイクロCTピンセンSNC-100
軌道軌道画像解析https://www.orbit.bio/
ペントバルビタールナトリウムシグマP3761
小動物用喉頭鏡Yuyan Instruments(ユヤンインストゥルメンツ)CG-02M
SPSSのアイビーエムバージョン19.0 
暖かいブランケットラボアニムテック緯度-16-0323

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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CT 3D Slicer

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