In vitroヒトを用いた肺線維症の先進モデルの確立と評価

Summary

線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)に基づいて、ヒト精密切断肺切片における線維芽細胞の活性化を評価するためのイメージング法が開発されました。この方法論は、線維性進行を病期分類するための堅牢で再現性の高いプラットフォームを確立し、ヒト組織微小環境の忠実度を維持しながら、治療開発のためのトランスレーショナル in vitro モデルを進歩させます。

Abstract

肺線維症は、肺胞構造の不可逆的な破壊と細胞外マトリックスの過剰な沈着を特徴としています。動物モデルは肺線維症の研究で広く使用されていますが、現在利用可能なモデルはいずれも、IPFの進行性の性質や、線維芽細胞病巣などのその決定的な組織学的特徴を完全に再現していません。精密切断肺切片(PCLS)を含む高度な in vitro モデルは、生理学的に最も関連性のある肺検査システムと見なされることが多く、薬物スクリーニングに採用されています。それにもかかわらず、IPF肺の線維化の程度を区別できないため、得られたPCLSは盲検化され、不確実性が生じています。これまでの研究では、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)がILDの線維化促進性活性を評価できることが示されており、早期診断や適切な治療ウィンドウの選択に貢献できる可能性が示されています。この研究では、ショックスライサーを使用して健康なドナーとIPF患者から600μmのPCLSを取得し、FAPを標的とする分子プローブを使用して評価し、蛍光シグナル強度に基づいて線維芽細胞の活性度を決定します。このアプローチは、肺線維症研究のための高度な in vitro モデルと評価技術を提供し、疾患メカニズムの研究と治療介入の評価能力を向上させます。

Introduction

肺線維症(PF)は、病因が不明で、特に予後不良で、5年生存率の中央値はわずか25^%1の一般的な形態です。気管内ブレオマイシン投与モデルは、現在、前臨床試験で最も広く使用されている動物モデル^です2。しかし、ブレオマイシンによって誘発される線維化は一過性であり、時間の経過とともに解消するため、IPF³の不可逆的な性質とは大きく異なります。さらに、気管内ブレオマイシンモデルは、外科的または非外科的かどうかにかかわらず、気管内投与に起因する線維症の不均一な重症度のために重大な課題を提示します。現在の動物モデルのこれらの制限は、IPF⁴を標的とした臨床試験の高い失敗率の一因となっています。

精密切断肺スライス(PCLS)は、疾患特異的な細胞クロストークネットワークと微小環境を忠実に保持するため、さまざまな疾患で使用されてきました^5,6,7。肺線維症では、IPF肺からのPCLSは天然の組織構造と細胞の不均一性を保持し、さまざまな細胞タイプと細胞外^{マトリックス相互作用の}観察を可能にし^8,9、肺の病態生理学を研究するための代表的なex vivoモデルとして確立されています。ただし、肺線維症は肺の不均一な線維性病変を特徴とするため、PCLSサンプリングは本質的に盲目です。得られた切片が静止期、活動期、または正常な肺組織の線維性領域を表しているかどうかを視覚的に区別することはできません。この制限は、視覚的な評価とスクリーニングツールの必要性を強調しています。これまでの研究では、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)がIPF患者の肺組織で高濃度かつ特異的に発現していることがわかり、FAPが^ILD10の線維化促進活性を評価できることが示されました。

この研究では、FAPに対する一本鎖抗体をインドシアニングリーン(ICG)で標識し、組織浸透性が強化された標的分子イメージングプローブを開発しました。健康なドナーとIPF患者から得られた600μmのPCLSをこのプローブを使用してイメージングし、蛍光シグナル強度に基づいて線維芽細胞活性を評価しました。このイメージングモダリティは、操作が簡単で、細胞構造の完全性と生存率を維持しながら、病原性の進行を縦断的に追跡できるという、従来の線維症評価技術(ウェスタンブロッティング、qPCR、マッソントリクローム染色、免疫蛍光法)を凌駕しています。さらに重要なことに、操作が簡単で、わずか90分しか必要としません。これにより、PCLS in vitro モデルのための高度なスクリーニングツールが提供され、肺線維症の研究が容易になります。

Protocol

この研究は、広州医科大学第一病院の倫理委員会(2021G-29)によって承認されました。IPFは、ATS/ERS/JRS/ALAT(2022)が定めた診断基準に従い、身体検査と胸部高解像度コンピュータ断層撮影所見に基づいて診断されました。すべてのIPF患者検体は、肺移植または肺生検から採取されました。健康な肺組織サンプルは、脳死と診断された臓器提供者から採取されました10。組織採取については、採取前に各患者または患者の家族から書面による同意を得ています。このプロトコルで使用されるすべての材料、溶液、および機器の詳細については、 材料の表を参照してください。

1. ヒトPCLSの調製

注:患者は、肺移植または生検の前に、HIV、HCV、梅毒などのウイルスについて定期的にスクリーニングされ、実験室の人員の労働安全を確保するために、その後の実験に進む前に陰性でなければなりません。

1. ソリューションの準備
   1. リン酸緩衝液(1× PBS)を調製し、4°Cで予冷します。
   2. 2%アガロース溶液を調製します。アガロース2gを秤量し、三角フラスコに移します。PBS100mLを加え、よく混ぜ合わせ、電子レンジで加熱して、混合物が激しく沸騰するまで(≥95°C)、完全に透明で均質になり、目に見える粒子や縞がなくなります。加熱中は時々フラスコを回転させて、過度の沸騰を防ぎます。使用するまで、溶液を37°Cのウォーターバスに入れます。
2. 精密にカットされた肺スライス
   1. 肺組織の外面をPBSで洗浄して、余分な不純物や血液を取り除きます。
   2. 20 mLのシリンジ(1.2 mm針)を使用して、適切な量のアガロースを吸引し、気管に挿入します。.アガロースを肺葉にゆっくりと注入し、完全に膨らむまで注入します。.アガロースの漏れを防ぐために、顕著な抵抗に遭遇した場合は注入を中止してください。
      注:オーバーフローを避けるために、5 × 2 × 1 cmの組織ブロックごとに約10 mLのアガロースが必要です。小さなティッシュピースの場合は、5 mLシリンジと埋め込み型(シリコン型、プラスチックトレイ、サイズに合わせてカットされた遠心分離チューブなど)を使用して埋め込みを支援します。厚さ1〜2mmのアガロースのベース層を型に流し込み、半固化させます。肺組織を半固体のアガロースにそっと置き、泡を避けながら、追加のアガロースをゆっくりと注ぎ、組織を完全に覆います。アガロースが完全に固まるまで待ちます。
   3. 肺を氷の上に約30分間置き、アガロース重合を可能にします。胸膜の硬度と冷たさをチェックして、重合を確認します。必要に応じて冷やし続けます。
   4. 鋭利な刃を使用して肺組織を1〜2cmのスラブに切ります。
   5. アイスバストレイをカッティングベンチの中央に置き、予冷のために事前に角氷を入れます。
   6. 電源スイッチを入れ、UPボタンを押し続けると、サンプルステージが適切な位置に上昇します。
   7. ブレードをナイフホルダーに慎重にロードします。
      注意: 怪我をしないように、ブレードは慎重に取り扱ってください。使用済みのブレードは、指定された鋭利物容器に廃棄してください。
   8. 長さ約3 cm、幅1 cmのテープをカットします。粘着面をトレイに取り付け、粘着性のない面をシアノアクリレート接着剤で均一にコーティングします。
   9. 鉗子を使用して肺組織の一部を拾います。表面を吸収紙で乾かし、接着剤でコーティングされたテープの上に置きます。しっかりと密着するように優しく押します。
   10. 接着剤が固まったら、トレイをアイスバストレイにセットします。ティッシュブロックが水没するまで、予冷したPBSを充填します。
   11. 振動数を「10」、切削速度を「2」に設定します。 FWD ボタンを押してスライスを開始します。最初のスライスが完全にカットされたら、 STP ボタンを押して停止し、 RVE ボタンを押してブレードを引っ込めます。最初のスライスを破棄します。
   12. ターンテーブルを手動で6回回転させて、セクションの厚さを600μmに設定します。 FWD ボタンを押してスライスを再開し、セクションをカットした後で STP ボタンを押します。 RVE を押してナイフを引っ込め、ピンセットを使用して肺スライスを回収します。スライスを1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含むPBSに入れ、氷の上に保ちます。
   13. 上記のスライス手順を繰り返して、それぞれ約600μmの厚さの追加のPCLSを取得します。
   14. 現在のティッシュブロックがほぼ使い果たされたら、新しいティッシュブロックと交換し、手順1.2.4から1.2.13を繰り返します。

2. FAP抗体の精製

注:前述の^11,12のように、C末端のHisタグを含むFAP特異的単一ドメイン抗体を作製する。

1. ファージディスプレイを行い、固定化または溶液相のターゲットに対してコンビナトリアルライブラリを繰り返しパンニングすることにより、FAP特異的抗体フラグメント(scFv)のハイスループット選択を可能にします。結合したファージを厳格な洗浄と溶出により回収します。 大腸菌 に再感染してファージを増幅し、3〜4サイクルで標的結合剤を濃縮します。ファージELISAおよびDNAシーケンシングを使用してクローンを検証し、高親和性抗体を同定^します12。
2. 抗FAP一本鎖可変フラグメントをコードするDNA配列を、 大腸菌¹³での発現のためのHisタグと融合したpET-28a(+)ベクターにクローニングします。
3. 組換えプラスミドを 大腸菌 BL21(DE3)細胞に形質転換します。イソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いて、振とうフラスコ培養物を20°Cで一晩インキュベートしたタンパク質発現を誘導します¹⁴。
4. 上清からニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)ビーズを用いてFAP抗体を精製します。ダウンストリームアプリケーション用にPBSとのバッファ交換を実行します。
5. ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により、抗体の純度を評価します。予想される分子量で単一のドミナントバンドは、高純度を示します。

3. FAP抗体親和性の評価

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)でヒト胚性腎臓293T(HEK 293T)細胞を培養します。
2. ヒト線維芽細胞活性化タンパク質(hFAP)を過剰発現するレンチウイルスを293T細胞に90%コンフルエンスで添加します。96時間インキュベートして、安定した293T-hFAP細胞株を作製します。
3. 293T細胞と293T-hFAP細胞の両方を0.25%トリプシン-EDTAで消化し、細胞を回収します。
4. 細胞をPBSで洗浄し、FAP抗体とインキュベートした後、Alexa Fluor 488標識抗His IgGとインキュベートします。
5. NovoCyteフローサイト^{メーター15,16}を使用して蛍光強度を解析します。

4. scFv-FAP-ICG分子プローブの標識

1. PBSを使用してFAP-scFvの濃度を2 mg / mLに調整します。.
2. インドシアニングリーンNHSエステル(ICG-NHS)を添加して、モル比5:1(ICG-NHS:FAP-scFv)を達成します。
3. ボルテックスと振とうで完全に混ぜます。
4. 反応を暗所で室温で2時間インキュベートします。
5. 脱塩カラムを使用して未結合の色素を除去します。最終的なコンジュゲート製品は、4°Cの暗所で保管してください。

5. PCLSにおける線維芽細胞活性評価のためのscFv-FAP-ICG分子プローブ

1. PCLSを切断した後、ウェルごとに1つの切片を12ウェルプレートに入れます。各ウェルを1 mLのPBSで2回すすぎ、残留血液と破片を取り除きます。
2. PCLSをFBSなしで1mLのDMEMに浸します。scFv-FAP-ICGを最終濃度5 μg/mLで添加します。シェーカーで室温で1時間、軽く振とうしながら、光から保護してインキュベートします。
3. サンプルをPBSで3回、各5分間洗浄します。
4. in vivo動物イメージングシステムを用いて、励起波長785nm、発光波長810nmの設定でPCLSのICG蛍光画像を取得します。
5. 蛍光強度に基づいてPCLSの線維化活性を評価します。互換性のあるソフトウェアを使用して関心領域(ROI)を定義し、蛍光輝度をphotons/s/cm²/srで表します。
   1. [ROIの選択]ボタンをクリックすると、ソフトウェアが擬似色の領域の輪郭を自動的に描くことができます。ROIの配置が不正確な場合は、手動で調整します。「Calculate」をクリックして、領域内の信号強度を決定します。複数のサブ領域が選択されている場合は、すべてのサブ領域の値を合計します。

Results

ヒト肺組織のPCLSの調製手順を 図1に示します。ヒト肺組織をアガロースに包埋し、続いてカミソリの刃を用いて約^1cm3 の大きさの組織ブロックにトリミングした。トリミングして平らにした組織を、ミクロトームを使用して厚さ600μmで切片化するためのプラットフォームに貼り付けました(図1A、B)。PCLSは12ウェルプレートでインキュベートしました(図1C)。

線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)を標的とする一本鎖抗体であるscFv-FAPの調製とアフィニティー特性評価を 図2に示します。scFv-FAPは、293F発現システムを使用して精製しました。精製したタンパク質の分子量と純度は、SDS-PAGEゲルのCoomassieブリリアントブルー染色 によって 評価されました。scFv-FAPの観測された分子量は...

Discussion

以上の研究方法により、健常者とIPF患者からのPCLSを調製した。同時に、哺乳類細胞を用いてFAPの一本鎖可変フラグメントを発現させ、その純度と特異性を検証しました。FAPを標的とし、ICGで標識された分子プローブを使用して、線維芽細胞の活性化の程度を反映したFAP発現レベルを検出しました。このアプローチは、肺線維症治療のための高度な評価方法を提供します。

PCLSは、組織の生存率を維持しながら、自然な細胞組成、細胞間相互作用、および細胞-マトリックス関係を保持します^5,6,7。さらに、連続するセクションの厚さと形状が均一であることは、実験結果の再現性を高めます⁸。しかし、PCLSの調製には技術的な課題があり、特にアガロース重合前の均一な浸潤には細心の制御が必要なクライオアガロース包...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% トリプシン-EDTA	Gibco	15050-057
2&回;カラー SYBR グリーン qPCR マスターミックス (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 ml シリンジ	勝	者
293T 細胞	Beyotime	C6008
502 接着剤	Zhuolide	D-40
アガロース、低ゲル化温度	Sigma Aldrich	A9414-25G
抗コラーゲン I 抗体	abcam	ab138492
抗フィブロネクチン抗体	abcam	ab2413
抗ヒスタグ mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
ブレード	ジレット	7in83a7Q
カラー逆転写キット (gDNA リムーバー付き)	EZBioscience	A0010CGQ
クマシー ブルー スーパーファスト染色液	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
フラスコ	四川順波	GG-17
FAP ウサギ mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
鉗子	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
マイクロ天びん	Secura	Secura225D-1CN
マイクロ波	Mideo	PM2002
マルチモード In Vivo 動物イメージング システム	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte フローサイトメーター	ACEA Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
ユニバーサル RNA 精製	EZBioscience	EZB-RN4
ビブラトーム	DOSAKA	DTK-1000N
β-アクチン Rabbit pAb	Yeasen	30102ES
プライマー
&ベータ;-アクチンプライマー-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-アクチンプライマー-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGACGAT
FAP プライマー-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP プライマー-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
コラーゲン-I プライマー-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
コラーゲン-I プライマー-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
フィブロネクチン プライマー-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
フィブロネクチン プライマー-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA