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研究記事

干ばつストレス下でのシロイヌナズナ DREB1A を発現するトランスジェニックサトウキビにおける光合成と水利用効率の向上

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DOI：

10.3791/67861

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2025年10月3日

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1Agricultural Biotechnology Division, National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering College, Pakistan Institute of Engineering and Applied Sciences (NIBGE-C, PIEAS), 2National Agricultural Research Center (NARC), 3Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences, Superior University, 4Department of Laboratory & Blood Bank, Dr. Sulaiman Al Habib Medical Group, Qassim 51431, Saudi Arabia, 5Department of Horticulture, Faculty of Agriculture, University of the Punjab, 6Department of Biology, College of Science, Princess Nourah bint Abdulrahman University, P.O. Box 84428, Riyadh 11671, Saudi Arabia, 7Institute of Molecular Biology and Biotechnology (IMBB), The University of Lahore, 8School of Life Sciences, Nantong University

この記事について

サマリー

この研究では、トランスジェニックサトウキビにおけるシ ロイヌナズナ DREB1A を介した干ばつ耐性を評価します。ストレス下では、光合成の亢進、水利用効率、バイオマスの蓄積が観察されました。DR-21は DREB1A の発現が最も高く、干ばつに対する回復力が向上しました。この発見は、分子メカニズムについての洞察を提供し、水が限られた地域で気候変動に強いサトウキビ品種を開発するための潜在的な戦略を提供します。

要約

干ばつストレスはサトウキビの生産性に重大な制限を課すため、持続可能な農業のためにストレスに強い品種の開発が必要になります。本研究は、ストレス誘導性rd29Aプロモーターの制御下でシロイヌナズナDREB1A遺伝子を導入することにより、サトウキビの干ばつ耐性を高めることを目的としました。トランスジェニックサトウキビ系統は、粒子衝撃を介した形質転換によって生成され、その後、制御された干ばつストレス条件下で分子的、生理学的、および農学的評価を通じて評価されました。

分子解析により、安定した導入遺伝子の取り込みが確認され、トランスジェニック株は野生型植物と比較して DREB1A 発現が最大10倍増加しました。生理学的評価により、60%の圃場容量(FC)での干ばつストレス下で、トランスジェニック系統は224〜270%高い光合成速度(PN)を維持し、気孔コンダクタンス(gs)は84〜167%増加し、相対水分含有量(RWC)は非トランスジェニック対照と比較して25〜31%増加しました。さらに、トランスジェニックサトウキビの葉は、浸透圧調節と水利用効率の改善を示しました。農学的評価により、植物の成長と生産性の大幅な改善がさらに明らかになりました。干ばつストレス(60%FC)下では、トランスジェニック系統はサトウキビの高さが76〜109%大きく、サトウキビの直径が71〜86%大きくなった。シュートバイオマスは39〜87%増加し、根バイオマスは65〜103%増加しました。

さらに、スクロースの蓄積を示すBrixパーセンテージは、60%FCのトランスジェニック植物で36〜55%増加しました。これらの発見により、 DREB1A 発現、生理学的回復力の強化、干ばつ条件下での農学的パフォーマンスの向上との間に確固たる相関関係が確立されました。 DREB1A を発現するトランスジェニック サトウキビは、より高い光合成活性、優れた水利用効率、バイオマス蓄積の増加を維持する能力は、干ばつに強いサトウキビ品種を開発するための遺伝戦略としての可能性を強調しています。この研究は、干ばつ耐性の根底にある分子メカニズムに関する新たな洞察を提供し、水不足地域で持続可能なサトウキビ栽培を確保するための有望なアプローチを提供します。

概要

サトウキビ (Saccharum officinarum L.) はパキスタンで 2 番目に主要な換金作物であり、主にショ糖含有量が高いために栽培されています。ただし、定期的な水不足により、最適な生産が達成されることはめったにありません 1,2。イネ科の草科のメンバーであり、亜科Panicoideae3のPACCADクレードに分類されます。このクレードのメンバーは、しばしば暖かい季節の草と呼ばれ、C4光合成システム4を示します。サトウキビにおける CO2 固定の主なモードは、光呼吸が最小限の C4 光合成です5。サトウキビなどのC4草は、C3草よりも多くのCO2を固定することができ、より高いショ糖レベルを生成し、より優れた窒素利用効率(NUE)と水利用効率(WUE)を示します6,7,8。しかし、サトウキビの土壌水分要件は非常に高い9,10,11です。

気候の変化と利用可能な水の制限により、高収量の水ストレス耐性サトウキビ品種を生産することが非常に重要です12,13,14。水ストレスに対する植物の耐性は、ストレスの強度、時間、持続時間に影響される多遺伝子形質です。パキスタンの地理的位置(北緯30.3753度、東経69.3451度)により、開花と花粉の生存率が低いため、従来の育種方法は実行不可能です15。したがって、伝統的な育種による品種改良は、遺伝的変異とその後の望ましい農学的形質の選択に依存します16。これに関連して、遺伝子工学によるストレス関連遺伝子の形質転換は、植物のストレス耐性を改善するための最も有望な代替アプローチの1つである17,18,19。

植物の非生物的ストレス応答は、複数の転写因子(TF)ファミリーと、 WRKY、 MYB、 bHLH、 ERF、 NACなどのシス作用要素によって調節されます。これらのTFは、浸透圧調整、活性酸素種(ROS)除去、気孔調節、およびストレスシグナル伝達経路20、21、22、23、24、25、26のネットワークを調節します。たとえば、 WRKY TFはABA依存性経路を介してストレスシグナル伝達を調節し、 MYB タンパク質は干ばつストレス下でフラボノイド生合成と気孔機能を調節します27。同様に、 bHLH および ERF 因子はエチレンシグナル伝達と相互作用し、それによって干ばつ回復力を高めます28。ストレス反応の複雑さを考慮すると、 DREB1A などの主要な調節因子を標的とすることは、干ばつ耐性を高めるための有望な戦略です。

本研究では、トランスジェニックサトウキビにおけるシロイヌナズナDREB1Aの役割を、水ストレス条件下での光合成、水関係、収量形質への影響に着目して調査しました。水ストレス耐性の調節におけるDRE結合(DREB)タンパク質の役割は、以前に報告されています27,29,30。例えば、春日らは、DREB がシロイヌナズナ31 の DRE 配列発現を正に調節することを観察しました。さらに、多くの研究者は、DREB1Aを過剰発現するトランスジェニックサトウキビは、ストレス誘導性遺伝子の構成的発現と野生型サトウキビよりも高い糖レベルを示すことを示唆しています17,28,32,33。

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プロトコル

rd29Aの生成:DREB1A発現ベクター(図1)
全長DREB1Aオープンリーディングフレーム(ORF、651 bp)は、BamHIおよびEcoRI制限部位を組み込んだ遺伝子特異的プライマーを使用して、シロイヌナズナから増幅されました:フォワード5 / -GGCGGATCCATGAACTCATTTTCTGCT-3 /およびリバース5 / -GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3 /。同様に、rd29Aプロモーター(499 bp)は、KpnIおよびBamHI部位を含むプライマーを使用してシロイヌナズナゲノムDNAから増幅されました:フォワード5 / -GCGGGTACCCCTATTAGAACGATTAAGGAG-3 /およびリバース5 / -GGCGGATCCGGTGGTTCCTCTGTTTGATCC-3 /。PCR反応は、2.5 μLの10x PCRバッファー、1.5 mM MgCl2、各dNTPの0.2 mM、各プライマー0.4 μM、Taq DNAポリメラーゼ1 U、および1 μLのDNAテンプレート(ゲノムDNAの場合は約100 ng、cDNAの場合は50 ng)を含む25 μLの容量で実行し、ヌクレアーゼフリーの水を最終容量に加えました。DREB1Aとrd29Aの両方のプロモーターフラグメントの増幅条件は次のとおりです。95°Cで3分間の初期変性。95°Cで30秒間変性35サイクル、58°Cで30秒間アニーリング、72°Cで1分間伸長。続いて、72°Cで7分間最終延長します。増幅された生成物は、0.7%アガロースゲルで分離され、メーカーのプロトコルに従ってゲル抽出キットを使用してゲル精製されました。

増幅されたDREB1Aおよびrd29AプロモーターPCR産物をTAクローニングを使用してクローニングベクターpTZ57R/Tにクローニングし、確認のためにサンガーシーケンシングを行いました。DREB1A配列(アクセッション番号。AM992886)をGenBankに提出しました(rd29AプロモーターをKpnIおよびBamHI部位に挿入し、DREB1Aコード配列をBamHIおよびEcoRI部位に下流に挿入することで、元の2x35Sプロモーターを置き換え、RD29Aの制御下にDREB1Aを位置付けました。最終的なカセット(rd29A::DREB1A::CamV)をKpnIおよびEcoRVを使用して切除し、バイナリベクターpGA482のT-DNA領域にクローニングして、植物形質転換に使用するコンストラクトを生成しました(図1)。クローン生成物を検証するための最初のサンガーシーケンシングの後、それ以上のシーケンシング検証は行われませんでした。

遺伝子配列解析
参照されたバイオインフォマティクスツールを使用して、13の異なる双子葉植物および単子葉植物種からの AtDREB1A および DREB1 のタンパク質配列の系統発生分析を実行し、隣接結合法を介して比較しました。アミノ酸配列は、Phytozome(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)およびGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)から取得しました。Clustal Omegaオンラインプログラムを使用して、複数の配列アライメント解析を実行しました。PhytozomeとGenBankから必須配列を取得すると、配列検索は不要になります。

外植片とカルス誘導銃の準備20,34
サトウキビの栽培品種は、ファイサラバードのNIBGEの実験圃場で栽培されました。6か月後、健康なサトウキビの上部を切除して頂端領域を回収し、末端芽までトリミングしました。無菌条件下で、リーフロールを~5 mmの円筒形セグメントに剥がし、表面を70%エタノールで滅菌しました。頂端分裂組織のすぐ上の領域から、杖ごとに約10〜15個の頂端ディスク(~3 mmサイズ)を調製しました。ディスクは、前述のようにカルス誘導培地(CIM)で培養されました1,20,34。4〜6週間後、得られた胚形成カルを新鮮なCIM上で継代培養して、さらに増殖させました。注:表面消毒に70%エタノールを使用することで十分であることが判明し、追加の滅菌手順は必要ありませんでした。

rd29Aの遺伝的形質転換:ジーンガン20,34を介したサトウキビ中のDREB1A
増殖した胚形成カルスは、CIMを含むペトリプレートの中央に配置されました。3日後、詳細に説明されているように、PDS-1000/He Biolistic銃を用いて 、rd29A:DREB1A を含む金被覆植物発現可能なバイナリベクターpGA482をカルリに照射した。爆撃後、カルスのごく一部をCIMで3日間培養し、26±2 °Cの暗所に置いた。次に、カルスを60 mg/Lのジェネチシンを含むカルス選択培地(CSM)で培養し、10日ごとにCSMで継代培養し、26±2 °Cの暗所に置いた。

30日後、健康なカルスを60 mg/Lの抗生物質を含む再生選択培地(RSM)で培養し、芽を得ました。プレートを、制御された温度(26 ± 2°C)、16 h / 8時間の明暗光周期、500 μmol m-2 s-1 の光強度、および制御された湿度で4週間成長室に入れました35。再生した健康芽をガラス瓶に60 mg/Lの抗生物質を含む発根選択培地(RtSM)で培養し、上記の条件下で成長室に置いた。4〜6週間後、推定形質転換体を滅菌した砂質土壌を含む小さなプラスチック製のポットに移し、上記の条件下で成長室に置いた。カルス選択培地(CSM)での継代培養は、10日を超えて必要ありません。

トランスジェニックサトウキビ植物の分子確認
前述のように、ゲノムDNAは、CTAB抽出法36を用いて、推定トランスジェニックサトウキビ小株の若い葉から単離された。DNAの質と濃度は、NanoDrop分光光度計とアガロースゲル電気泳動を使用して評価されました。選択可能なマーカー遺伝子 nptII (750 bp)および導入遺伝子 DREB1A (651 bp)のPCR増幅は、表1にリストされている遺伝子特異的プライマーを使用して実行されました。各25 μL PCR反応には、1x PCRバッファー、2.5 mM MgCl₂、それぞれ0.2 mM dNTP、各プライマー0.4 μM、1 UのTaq DNAポリメラーゼ、~100 ngのゲノムDNA、および体積までの脱イオン水が含まれていました。反応は、次の条件下でサーモサイクラーで実行されました:95°Cで3分間の初期変性。94°Cで30秒、58°Cで30秒、72°Cで45秒の35サイクル。続いて、72°Cで5分間最終伸長します。PCR産物を1%アガロースゲルで分離し、UV光下で視覚化して増幅を確認しました。次に、PCR陽性(T0)トランスジェニック小苗を大きな土鉢に移し、成熟するまで制御された温室環境で硬化させました。成熟すると、無作為に選択された5つのPCRで確認されたT₁イベントからのサトウキビセグメントを植え、12か月間マイクロプロットに増殖させ、干ばつストレス実験に十分なクローンセットを生成しました。注: nptIIおよび DREB1A 遺伝子が確認されると、追加のPCR増幅は行われませんでした。

DREB1A 発現試験
トランスジェニックおよび非トランスジェニックサトウキビ植物のストレスを受けた葉における DREB1A の相対的な発現は、リアルタイムPCR(qPCR)を使用して定量化されました。全RNAは、メーカーのプロトコルに従って抽出試薬を使用して~100 mgの葉組織から単離されました。RNAの品質は、アガロースゲル電気泳動によって検証され、分光光度計を使用して定量されました。各サンプルについて、2 μgのRNAを、サプライヤーの指示に従ってcDNA合成キットを使用して、オリゴ(dT)プライマーを使用して逆転写しました。

得られたcDNAは、遺伝子特異的プライマー(フォワード5'-ACAGAGGAGTTCGTCGGAGAGA-3'およびリバース5'-GAGTCCAAGCCGAGTCAG-3')を使用して188 bp DREB1Aを増幅するためのテンプレートとして使用されました。各25 μL qPCR反応には、12.5 μLの2x SYBR Green qPCRマスターミックス、0.4 μMの各プライマー、2 μLの希釈cDNA(~100 ngテンプレート)、およびヌクレアーゼフリーの水が含まれ、容量を25 μLにしました。反応は、次のプログラムを使用してサーマルサイクラーで3回実行しました:95°Cで5分間の初期変性、 続いて、95°Cで30秒間、56°Cで30秒間、72°Cで30秒間40サイクル、最後に72°Cで10分間延長します。

qPCR反応の効率と直線性を確認するために、最初に、クローニングされた DREB1A フラグメントを含むプラスミドDNAの10倍の連続希釈を使用して標準曲線を生成しました。ただし、発現分析のために、2−ΔΔCt 法37を使用して相対定量化を行いました。 アクチン 遺伝子は内因性リファレンスとして機能し、各トランスジェニック株における DREB1A の発現レベルは野生型対照の発現レベルに正規化されました。すべての Ct 値は、機器ソフトウェアが推奨する自動ベースラインおよび閾値設定を使用して収集されました。単一の鋭いピークを持つ融解曲線のみが受け入れられ、特異性が確認されました。正確な定量には、高品質で非分解のRNAが不可欠でした。不純または分解されたRNAサンプルは、cDNA合成および下流の遺伝子発現解析の信頼性を損なうことを避けるために除外されました。

サトウキビにおけるDREB1A媒介変化の研究:水ストレス実験20,34
1年後、トランスジェニックおよび非トランスジェニック(野生型)植物の5つのサトウキビセグメント(2つのノード/セグメント)を18 kgの土壌を含む土鉢に深さ5 cmで3回播種しました(ECe




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結果

サトウキビトランスジェニック系統の分子特性評価
rd29A: DREB1A 発現カセットを構築し、植物発現可能なバイナリベクターpGA482(図1)でクローニングし、バイオリスティック媒介形質転換技術を使用してサトウキビゲノムに形質転換し、説明されているようにトランスジェニックサトウキビ小苗の開発に成功しました(図2)。サトウキビ系統における導入遺伝子の存在は、 nptII マーカーと DREB1A 遺伝子にそれぞれ特異的な750 bpおよび651 bpフラグメントを増幅することによって確認されました。これらの断片は、野生型サトウキビ植物には存在しませんでした(図3A、B)。PCRで確認されたトランスジェニックサトウキビ植物(T0)と野生型植物は、成熟するまで温室で栽培されました。選択された5つのトランスジェニッ...

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ディスカッション

世界中で干ばつが発生しやすい地域が拡大し続けているため、植物の耐水ストレス性を養うことは非常に重要です。潜在的に実現可能なバイオテクノロジーアプローチとして、トランスジェニックサトウキビ系統における耐水ストレスにおけるDREB1Aの役割を研究しました。以前の研究では、非生物的ストレスに対する耐性を与える複数の遺伝子の発現を誘導するDREB1A転写因子の役割が報告されています28,38,39,40,41。今後の方法として、トランスジェニックサトウキビ系統における干ばつ耐性の付与におけるシロイヌナズナDREB1A遺伝子の役割を調査しました。

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

プリンセス・ヌーラ・ビント・アブドゥルラフマン大学研究者支援プロジェクト番号(PNURSP2025R39)、プリンセス・ヌーラ・ビント・アブドゥルラフマン大学、リヤド、サウジアラビア。

データの可用性:
すべてのデータはこの論文で提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
クローニングベクター、pTZ57R/TFermentas、ビリニュス、リトアニア
赤外線ガス交換分析装置Bio-Rad、カリフォルニア州、米国
浸透圧計Bio-Rad、カリフォルニア州、米国
PCR装置Bio-Rad、カリフォルニア州、米国
PDS-1000/He バイオリスティックガンThermoFisher Sceintific Inc、米国
リアルタイムPCRThermoFisher Sceintific Inc、米国
RevertAid cDNA合成キットCI-340、CID Bio-Science, Inc.、米国
Scholander型圧力チャンバーSkye instruments、ランドリンドッドウェルズ、バーミンガム、イギリス
TRIzol試薬Wescor-5500、米国ユタ州ローガン

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