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方法論記事

腎臓間質性線維症を調査するための片側尿管閉塞モデル

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DOI:

10.3791/67897

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2025年4月25日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing Medical University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、マウスで片側尿管閉塞(UUO)を誘発する方法を説明しています 閉塞性腎症における組織線維症の進行を研究するため。これには、外科的処置、術後ケア、および線維症評価の方法が含まれます。

要約

腎線維症は、進行性慢性腎臓病(CKD)の最終的な病理学的転帰です。片側尿管閉塞(UUO)モデルは、腎臓間質性線維症の根底にある分子および細胞メカニズムを解明し、潜在的な治療標的を特定するために広く使用されています。このモデルは、片側尿管の外科的結紮を通じてマウスで確立されていますが、この手順は比較的簡単で簡単に実行できます。しかし、UUOマウスモデルは、マウスの系統、年齢、性別、麻酔の種類、手術期間、手術中の体温、手術者の手術技術、摂食条件、マウスの全体的な健康状態などの要因に影響され、有意なばらつきと不整合を示すことが知られています。外科的技術、縫合糸の配置、および閉塞の期間のばらつきは、転帰のばらつきの一因となります。さらに、閉塞した腎臓のサンプリングに一貫性がないと、腎線維症の評価のばらつきがさらに大きくなります。本研究では、UUOマウスモデルの開発プロセスと間質性線維症の評価プロセスの概要を説明し、モデルの予測不可能性の技術的課題について議論し、考えられる解決策を提案する。これらの洞察は、腎線維症を調査するためのより標準化され、普遍的に適用可能なアプローチを確立することを目的としています。

概要

慢性腎臓病(CKD)は、世界人口の10%以上が罹患しており、その有病率は増加しています1。先天性解剖学的異常、腎結石症、前立腺肥大症、膀胱腫瘍など、さまざまな尿路疾患が尿管閉塞を引き起こす可能性があります²。その結果、片側尿管閉塞(UUO)マウスモデルは、腎臓間質性線維症の新たなメカニズムを特定し、疾患の進行を理解し、潜在的な治療戦略を評価するための重要なツールとなっています。これは、筋線維芽細胞、(筋)線維芽細胞亜クラスター、管状細胞代謝、細胞周期停止、部分上皮間葉転換、およびその他の関連プロセス3,4,5,6,7,8の起源を調査するために広く使用されています。

UUO誘発性腎間質性線維症に加えて、腎臓間質性線維症の他の一般的に使用されるげっ歯類モデルには、アリストロキア酸、葉酸、アデニンを使用するものなどの毒素誘発モデル、および5/6腎摘出術や虚血再灌流障害(IRI)などの外科的誘導モデルが含まれます。UUOモデルには、代替の腎線維症モデルに比べていくつかの利点があります。例えば、毒素誘発性腎線維症は、比較的長いモデリング期間(約1〜2ヶ月)を必要とし、他の臓器に対するその毒性副作用は、線維化メカニズムの研究を複雑にする可能性があります9,10,11。5/6腎摘出術などの外科的に誘発されたモデルは、重大な腎出血や感染症を引き起こし、術後死亡のリスクを高める可能性があります。さらに、誘発された間質性線維症の程度は、切除された腎臓組織の量と直接相関しているため、各マウスで同程度の線維症を一貫して再現することは困難である12。

腎IRIモデルは、CKDに対する急性腎障害を誘発するための主要な方法であり、臨床的に重要な関連性があります。線維症の重症度は、虚血時間と体温を調整することで調節できます。ただし、UUOモデルと比較すると、外科的に複雑であり、間質性線維症の誘発にはより長い期間が必要です13。これらのモデルと比較して、UUOモデルには、モデリング期間が短い、ばらつきが最小限、再現性、比較的簡単な外科手術など、いくつかの利点があります。UUOマウスモデルは、毒素を含まず、1つの尿管を結紮することで作製され、2週間以内に閉塞性腎症を発症します。これにより、水腎症、尿細管拡張、および間質性線維症が起こり、ヒトで観察される病理学的過程と非常によく似ています14。線維症の重症度(軽度、中等度、または重度)は、実験の期間を調整することで制御できます。

UUOマウスモデルは、CKDを調査するための他の傷害誘発モデルよりも簡単に実行できますが、いくつかの要因がその安定性に大きな影響を与える可能性があります。これらの要因には、マウスの系統、年齢、性別、麻酔の種類、手術時間、手術中の体温、操作者の手術技術、およびマウスの摂食条件および健康状態が含まれる15,16。

麻酔下で安定的かつ組織的に手術を行いながら、外科的ストレスと感染を最小限に抑えることは、再現性のあるUUOマウスモデルを作成するために不可欠です。さらに、CKDのメカニズムや潜在的な治療標的に関する研究は、経験の浅いオペレーターによって損なわれ、マウスの損失が増加し、モデルの不均一性が大きくなる可能性があります。これらの課題に対処するために、手術プロセスの主要な技術的側面(手術前、手術中、手術後)が概説され、注意が必要な重要な問題が浮き彫りになります。さらに、UUOマウスモデルの評価方法は詳細に説明されており、研究者に一貫性のある信頼性の高いアプローチを提供します。

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プロトコル

すべての動物処置は、機関のガイドラインに従って実施され、南京医科大学の動物倫理委員会によって承認されています。性差と系統の違いを排除し、結果の比較可能性を確保するために、8〜10週齢、体重22〜25gの雄CD1マウスのみを使用します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. 動物と器具の準備

  1. 手術前にすべての手術器具をオートクレーブします。
  2. マウスの体重を量り、麻酔をかけます(施設で承認されたプロトコルに従います)。吸入麻酔装置を適切に接続し、2%イソフルランと酸素を混合したマウスを1〜2 L / minで誘導チャンバーに入れます。次に、マウスの鼻をノーズコーンに置き、常に麻酔をかけます。つま先をつまむことに対する反応の欠如を評価することにより、適切な鎮静レベルを確認します。
    注:マウスのペダル反射を使用して、定期的に呼吸数をチェックし、麻酔のレベルを評価します。必要に応じてイソフルランを調整します。.
  3. マウスを仰臥位の電子ヒートパッドに置き、頭と首を伸ばして気道を開いたままにします。粘着力の低いテープで足を固定します。
  4. 温度計を使用して周囲温度を監視し、37〜38°Cに維持します。 直腸プローブを挿入し、処置中はマウスの深部体温を約36.5〜37°Cに保ちます。
  5. 角膜乾燥症の損傷を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗布します。.
  6. 手術部位の毛を脱毛クリームで剃り、ベタジン溶液で3回消毒します。

2.外科的処置

注:体温が設定値で安定し、つま先のつま先つまみ反射がなくなったら、次の外科的処置を開始します。

  1. 手術用ブレードを使用して、膀胱から肋骨の左下端まで約1〜1.5センチメートルの垂直手術切開を行い、腹腔を露出させます。
  2. 滅菌生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して腸を腹腔の右側に移動し、脾臓の後ろの下、脊椎に隣接する左腎臓を露出させます。
  3. 湾曲した虹彩鉗子を使用して、左尿管を囲む脂肪と結合組織を取り除きます。穏やかに分離した後、3/0シルク編組縫合糸を使用して、腎臓の下極の近くに左尿管を結紮します。第1の結紮と膀胱との間の左尿管の第2の結紮を行う。
    注:マウス間のばらつきを最小限に抑えるために、ライゲーション位置がすべての被験者で一貫していることを確認してください。左側の鉗子を使用して、縫合糸を右側の鉗子の先端に配置し、縫合糸を尿管17の下にスライドさせます。結紮に余分な脂肪や結合組織を含めると、不完全な腎臓閉塞につながる可能性があるため、避けてください。これを達成するには、乾いた綿棒で尿管をやさしくなでます。
  4. 腸を慎重に腹腔に再配置します。3/0シルク編み込み縫合糸を使用して、筋肉層と皮膚層を別々に縫合します。
    注:皮膚と筋肉の層を一緒に縫合すると、縫合創の破裂や腹部内臓の損傷を引き起こす可能性があります。
  5. 複数のマウスで手術を行う場合は、次のマウスに進む前に、流水と75%エタノールで手術器具を洗浄してください。

3. 術後のケアとモニタリング

  1. 脱水症を防ぐために、0.5 mLの温かい生理食塩水を腹腔内に注入します。.
  2. マウスが完全に意識を取り戻すまで、マウスをきれいなケージに戻します。
  3. ブプレノルフィン(50μg/kg)を皮下注射で3日間投与します。マウスのグルーミング不足、食事の減少、異常な姿勢の兆候がないか、毎日監視してください。

4. 術後評価

  1. 組織学
    1. イソフルランの過剰摂取でマウスを安楽死させます(制度的に承認されたプロトコルに従います)。安楽死後、閉塞性および対側の非閉塞性腎臓18 を採取します。
    2. 組織学的検査には、腎臓切片の最大の断面積を使用します。
    3. 腎臓組織を4%パラホルムアルデヒドで固定し、得られたサンプルを4μm切片に切断します。
    4. 過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)、マッソントリクローム染色(MTS)、またはシリウスレッド染色で腎臓切片を染色し、腎尿細管損傷と腎線維症を検出します。
    5. 200×の倍率の光学顕微鏡下で腎臓切片の10個のランダムなフィールドを選択します。
    6. ImageJソフトウェアを使用して、コラーゲン陽性の青色領域の割合を計算します。
  2. ウェスタンブロット
    1. ラジオ免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液18を使用して、UUO腎臓の同じ極から約20mgの腎臓組織を抽出します。
    2. ビシンコニン酸アッセイ19を用いてタンパク質濃度を定量する。
    3. 電気泳動のために、等量のタンパク質サンプルを4%-10% Bis-Trisゲルにロードし、それらをポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンに移します。
    4. Tris-Buffered Saline Tween(TBST)で5%ミルクでPVDFメンブレンをブロッキングし、一次抗体と4°Cで一晩インキュベートします。
    5. PVDFメンブレンをTBSTで洗浄し、二次抗体と室温で1時間インキュベートします。
    6. Enhanced Chemiluminescence(ECL)法を使用してタンパク質レベルを検出し、ImageJソフトウェアを使用して、グローディングコントロールとしてグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を使用して分析します。
  3. 腎機能
    1. 吸入イソフルランでマウスに麻酔をかけます(ステップ1.2を参照)。
    2. 麻酔後、眼窩後から血液サンプルを採取します。
    3. 血液サンプルを3,000 x g で室温で15分間遠心分離します。
    4. 自動ドライケミカルアナライザーを使用して、血清クレアチニンと血中尿素窒素(BUN)を測定し、腎機能を監視します。

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結果

組織学
過ヨウ素酸-シッフ(PAS)染色では、尿細管の拡張、ブラシ境界の喪失、ギプス形成、および尿細管上皮の腫脹が明らかになりました。マッソンのトリクローム染色とシリウスレッド染色は、UUO後に間質性線維症を示したが、これは、偽群で観察された識別可能な内腔を持つ正常なコンパクトな尿細管とは対照的であった。Massonのトリクローム染色の青色の領域とSiriusの赤色染色の赤色の領域で示される腎間質性線維症の程度は、時間依存的に増加しました(図1A)。

ウェスタンブロット
フィブロネクチン(FN)、コラーゲンI(Col-1)、およびα平滑筋アクチン(α-SMA)は、腎臓の線維症を評価するために一般的に使用されるマーカーです。偽群と比較して、これらの線維性タンパク質の発現レベルはUUO後に有意に上昇し、閉塞の持続時間と正の相関がありました(図1B)。

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ディスカッション

腎臓間質性線維症を調査するために広く使用されているアプローチであるUUOモデルを確立するための包括的な手順が提供されています。さらに、腎機能の評価や組織学的変化など、モデルの同定と評価が実証されています。モデルの不均一性に寄与する変数と修正可能な技術的要因について説明します。

UUOに対する感受性は、年齢、性別、およびマウスの系統によって大きく異なります。C57BL/6マウスと比較して、BALB/cマウスはUUO20に対する感受性が低く、耐性さえあります。C57BL/6マウスの雄と雌のマウスを対象とした研究では、UUO23以降、雄マウスはマッソントリクローム染色とスコアリングが大きく、コラーゲンIVの発現も増加しました。さらに、UUOの腎線維症に対する性差の影響は、トランスジェニックマウスモデルとノックアウトマウスモデルで異なる24。年齢は、UUOの結果に影響を与えるもう一...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国国立科学基金会の助成金(82370686/2024YFA1107704)、江蘇省特任教授助成金、南京科学技術イノベーションプロジェクト、江蘇省病院ハイレベル人材育成プログラム(フェーズI)(CZ0121002010037)、江蘇省自然科学基金会(BK20240055)、および江蘇医療イノベーションチームからJRへの支援を受けました。江蘇省病院(南京医科大学との最初の提携病院)臨床能力強化プロジェクト(JSPH-MA-2023-4)、江蘇省高等教育機関(中国)および中国国家自然科学基金会の優先学術プログラム開発(81970639/82151320)からHMへ。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mLシリンジMingankang/
4/0外科用縫合糸Jinhuan MedicalF401
75%エタノールLircon6303060031
麻酔エアポンプRWDライフサイエンスR510-29
酔誘導チャンバーRWDライフサイエンスV102-V
動物バリカンJinke/
ベタジン溶液リルコン6303030036
ブプレノルフィン (鎮痛剤)RWD ライフサイエンス/
湾曲虹彩鉗子ジンケ/
電子ヒートパッドレプティズーAHM23
ファインストレート鉗子ケ/
ガスフィルターキャニスターRWD ライフサイエンスR510-31-6
ゼパッドナーメディカル601-026576
リスハサミケ/
イソフルラン(麻酔薬) RWD ライフ サイエンスR510-22-10
マルチ出力動物麻酔装置RWD ライフ サイエンスR550IE
ニードルホルダーjinke/
眼科用軟膏Dechra NDC 17033-211-38
菌綿棒Winner Medical601-015213
菌生理食塩水ShimenH20066533
麻ジンガーウィアイジン滅滅

参考文献

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