方法論記事

生および調理済み鶏肉製品中の サルモネラ菌 を定量するための修正最確数アッセイ

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DOI：

10.3791/67910

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2025年1月31日

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1Characterization and Interventions for Foodborne Pathogens, Eastern Regional Research Center, Agricultural Research Service (ARS), United States Department of Agriculture (USDA)

この記事について

サマリー

家禽中の サルモネラ 菌を低レベルで正確に定量することは、現在の産業および規制上の課題です。このプロトコルは、生および調理済み家禽製品中の サルモネラ 菌の定量を可能にするMPNアッセイについて説明しています。この方法は迅速で感度が高く、FSISガイドラインに準拠しているため、食品の安全性が向上し、公衆衛生の取り組みがサポートされます。

要約

サルモネラ菌 は、米国、特に家禽製品における食中毒の主な原因です。 従来のサルモネラ 菌検出法は、定量化よりも有病率に重点を置いているため、汚染レベルやリスクの評価における有用性は限られています。この研究では、チキンコルドンブルーなどの調理済み家禽製品中の サルモネラ菌 を定量するために設計された新しい最確数(MPN)アッセイを紹介します。この方法では、家禽サンプルを洗浄し、遠心分離によってリンスを濃縮し、48ウェルブロックで連続希釈します。MPNアッセイは、ループ媒介等温増幅(LAMP)法と統合されており、既存の食品安全検査サービス(FSIS)プロトコルと同じ時間枠内で サルモネラ 菌汚染の高感度、正確、迅速な定量を提供します。結果は、MPN-LAMP測定値と理論上の接種レベル(R² = 0.933)との間に強い線形相関があることを示しています。しかし、低濃度でのばらつきは、これらのレベルで サルモネラ菌 を正確に検出することの難しさを浮き彫りにしており、実際の検出下限は約300 CFU/gと推定されています。プロトコールの適用性を向上させるための潜在的な改良には、検出限界をさらに改善するためのサンプリング量の増加、濃縮培地の組成の最適化、および複数の サルモネラ 血清を標的とする分子検出の拡大が含まれます。全体として、この研究は食品業界にとって実用的なツールであり、家禽製品中の サルモネラ 菌汚染の信頼性の高い定量化を可能にし、食品の安全性と公衆衛生の向上に貢献しています。

概要

サル モネラ 菌は、米国における食中毒、入院、死亡の主な原因として、公衆衛生と経済に大きな影響を与えています。2013年だけでも、この病原体の推定経済的負担は36億7000万ドルでした1。最近の規制イニシアチブは、2030年までにサルモネラ症を25%削減することを目指していますが2、現在の検出および緩和戦略のギャップは依然として明らかであり、特に処理プラントの監視を公衆衛生上の成果 と一致させる点では3 。

冷凍調理済みの家禽製品は、複数のサルモネラ菌の発生に関与しており、公衆衛生にとって重大な懸念事項です。これを受けて、食品安全検査局(FSIS)は、サルモネラ菌をこれらの製品の混入物として分類しました。現在、FSIS Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 4.15は、家禽製品4におけるサルモネラ菌の有病率の決定にのみ焦点を当てています。このガイドラインでは、収集したサンプルを18〜24時間濃縮した後、サルモネラ菌の有無を特定する分子検出システム(MDS)を使用してスクリーニングしますが、汚染レベルに関する洞察は提供しません。このアプローチは、病原体の存在を検出するには価値がありますが、食品加工業者が汚染リスクをより正確に評価し、的を絞った是正措置を講じるのに役立つ定量的な情報を提供することはできません。

本研究では、微生物病原体の有病率から定量まで検出を増強する方法を開発しました。これは、現在のFSISプロトコルの中断を最小限に抑えて家禽製品中のサルモネラ菌を検出するための既存のプロセスにシームレスに統合するために設計されました。この方法は、単にバルクサンプルを濃縮する代わりに、現在のFSIS法と一致する培地を使用して家禽製品を洗浄することから始まります。その後、リンスは深さ 48 のウェルブロックの最初のカラムに分配されます。残りの5つのカラムで段階希釈を行い、MLG 4.15プロトコルに沿ってブロックを18〜24時間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルはサルモネラ菌についてテストされ、その結果を使用して最も可能性の高い数(MPN)5,6が計算されます。このアプローチにより、現在のFSISプロセスと同じ時間枠内で汚染を定量化できるため、業界と規制当局の両方で使用できる実用的なオプションになります。図1は、修正されたMPNアッセイをまとめたブロック図を示しています。この図には、特定のステップで撮影された写真、反復の希釈と成長に利用される48ウェルブロック、および鶏ひき肉に存在する最も可能性の高いサルモネラ菌の数を評価するためのベンチマークとして使用される3つの手法が含まれています。この研究の第 1 段階では、放射線照射されていない鶏のサンプルにプロトコルを適用する前に、背景の微生物叢の影響と確認済みの接種物に対する測定値の不確実性を最小限に抑えるために、照射された鶏ひき肉を利用しました。

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プロトコル

注:このプロトコルに関連するすべての作業は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)ラボ内で実施する必要があります。適切な場合、このプロトコルは生物学的安全キャビネット(BSC)内で実施し、無菌状態を維持し、サンプル汚染や微生物病原体へのオペレーターの曝露のリスクを最小限に抑える必要があります。BSCの外部にサンプルを移す場合は、密閉容器を使用してサンプルの完全性を維持し、誤って落下した場合のこぼれを防ぎます。好ましくは、クロスコンタミネーションの可能性を軽減するために、手順全体を通して使い捨てコンポーネントを使用する必要があります。使い捨てが不可能な場合は、使用前にすべての機器と材料が無菌であることを確認してください。適切な廃棄物管理は非常に重要です。使用済みの使い捨て部品はすべてバイオハザード廃棄物として廃棄する必要があります。再利用する前に再利用可能な材料をオートクレーブにして、潜在的に危険な材料の適切な滅菌と封じ込めを確保します。これらの予防措置を順守することで、サンプルの完全性を保護するだけでなく、オペレーターが微生物病原体にさらされるリスクも最小限に抑えることができます。

1.肉サンプルの調製

  1. 食肉サンプルの採取と加工
    1. 新鮮な肉
      1. 地元の小売店の生肉売り場から鶏ひき肉を入手してください。すべてのサンプルを4°Cで保管し、受領後24時間以内に処理します。肉を無菌的に25gのサンプルに分割します。
      2. サンプルを真空シールして照射します。ここでは、テキサスA&Mアグリライフ国立電子ビーム研究センターが、~25kGyの線量を照射した肉を照射した。
        注:この研究では、背景微生物叢の除去を確実にするための制御手段として照射が使用されましたが、次のセクションで使用される非照射の調理済み調理済み製品が示すように、実際のアプリケーションでのプロトコルの前提条件ではありません。現場では、選択培地や分子診断の特異性などの代替方法により、非標的微生物からの潜在的な干渉に対処できます。
    2. 調理済みチキン製品
      1. 地元の小売店の冷凍食品セクションから調理済みの鶏肉製品を入手してください。無菌的に25gのサンプルに分割します。
      2. 個々のピースの中央からサンプルを採取し、すべての材料(パン粉やチーズなど)が含まれていることを確認します。
  2. メディアの準備
    1. 緩衝ペプトン水(BPW)は、BPW粉末25gをナノピュアH2O1Lに溶解して調製します。
    2. 脳心点滴(BHI)プレートを準備します。これを行うには、37 gのBHI粉末を1 LのナノピュアH2Oに溶解し、15 gの寒天をBHI溶液に加えます。すべての培地を121°Cで15分間オートクレーブ滅菌します。20〜25 mLの培地を透明な蓋付きのシャーレ(100 mm x 15 mm)に注ぎます。
      注:無菌状態を維持するために、生物学的安全キャビネット内にプレートを注ぐのが最善です。

2. 細胞培養

  1. Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028をBHI寒天プレート上にストリーキングして初期培養物を調製し、37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 25 mLのBHIブロスに、新たに栽培した サルモネラ菌 のコロニー1つを接種して、一晩培養します。100 rpmで振とうしながら、37°Cで一晩中培養します。

3.家禽サンプルの接種

  1. 培養希釈とプレーティング
    1. BPWで一晩培養した一連の10倍希釈液を調製し、最終濃度が約1 x 108 から1 x 101 CFU/mLになるようにします。 サルモネラ 菌の一晩培養液の濃度が 1 x 109 CFU/mL であると仮定します。
    2. 0.5 mLの一晩培養液を4.5 mLのBPWに移し、混合し、さらに希釈するごとに0.5 mLの希釈液を4.5 mLのBPWに移します。
      1. 希釈した1 x 103 CFU/mLをBHI寒天プレートに10 μLを3回に分けて広げ、細胞計数を行い、一晩の培養濃度を計算します。
  2. 食肉サンプルの接種
    1. 照射した鶏ひき肉25gを滅菌ストマッカーバッグに二重に無菌に移します。バッグは7.5 x 12インチで、1.63Lとラベル付けされています。袋には穴径330μmのフィルター仕切りが入っており、1平方cmあたり285個あります。
    2. 各サンプルに目標濃度希釈液1 mLを接種します。例えば、1 x 10³ CFU/mL希釈液から1 mLの培養液を添加すると、約1,000細胞/鶏肉25 gの汚染レベルが得られます。滅菌細胞スプレッダーを使用して、液体接種物をニワトリサンプルの表面に穏やかに分配し、4°Cで1時間放置します。
    3. ネガティブコントロールサンプルを調製するには、滅菌BPW1 mLを添加します。

4. サンプル処理

  1. 各サンプルに225 mLのBPWを加えます。メディアに対するボリュームの比率は、FSIS MLG 4.154 に合わせて選択されました。
  2. Stomacher7 を使用して、通常の速度と 120 秒の持続時間でサンプルを均質化します。
  3. 遠心分離と再懸濁
    1. 50 mLピペットを使用して、バッグのろ過面から液体を慎重に取り出します。液体を2つの滅菌遠心分離ボトルに分割します。
    2. ボトルを滅菌BPWでバランスを取り、重量が等しくなるようにします。サンプルを10,000 x g で10分間遠心分離します。上清を捨てます。滅菌スパチュラで細胞ペレットを3 mLのBPWブロスに再懸濁します。
    3. さらに27mLのBPWブロスを加え、へらで攪拌してよく混ぜます。両方の遠心分離ボトルの内容物を各サンプルごとに1つのボトルに組み合わせます。

5. MPNブロックのセットアップ

注: 表1 は、48ウェルブロックでの希釈液の概略図を示しています。

  1. 再懸濁したサンプルを 3 mL を 48 ウェルブロックのカラム 1 の各ウェルに加えます(8 回繰り返し)。
  2. 8チャンネルピペットを使用して、ブロック内のカラム1〜6に10倍希釈液を一連の調製します。
  3. 0.3 mLのサンプルを2.7 mLのBPWピペットに加えて混合します。希釈ごとに繰り返します。ブロックを 37 °C で一晩 (~18 時間) インキュベートし、~100 rpm で振とうします。

6. めっきと列挙

  1. 変更されたドロップ プレート列挙
    1. マルチチャンネルピペットを使用して、寒天プレート上の4 x 6グリッドで各希釈液の一晩成長したサンプル7 μLをプレートします(図2)。2つのプレートに4 x 6グリッドを使用すると、一般的な6 x 6グリッドの液滴8とは対照的に、8つのサンプルをより適切に収容できます。
    2. プレートを10分間風乾させてからインキュベーションします。寒天プレートを37°Cで一晩(~18-24時間)インキュベートします。 インキュベーション後、各プレート上のコロニーの数を数えます。

7. サルモネラ菌のqPCR検出

  1. 市販のキットを使用したDNA抽出
    1. 48ウェルブロックで培養物を数回ピペッティングして混合します。各培養物200μLを96ウェルPCRプレートにピペットで移します。
    2. プレートを密封し、6,600 x g で10分間遠心分離します。上清を取り除き、20 μLのキット試薬をペレットに加えます。
    3. ピペッティングを上下させてペレットを再懸濁します。プレートを密封して99°Cで10分間加熱した後、20°Cまで冷却します。
    4. 再度、6,600 x g で10分間遠心分離します。qPCR分析には2μLの上清を使用してください。
  2. プレートのセットアップ
    1. 確立されたプロトコル9 に従って、次のようにqPCR反応混合物を調製します:10μLの2xマスターミックス;各プライマーおよびプローブの0.4 μL(10 μM使用溶液):invAフォワード:5'-GTTGAGGATGTATTCGCAAAGG-3'、invAリバース:5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'、invAプローブ:5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3'、Cal Fluor Orange 560フルオレン色素で標識。0.2 μL の内部増幅制御 (IAC) テンプレート (6 x 104 コピー/μL)9;各IACプライマーおよびプローブ(10μM)の0.4μL:IACフォワード:5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'、IACリバース:5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'、IACプローブ:5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3'をTAMRA色素で標識。ddH2Oで合計20μLまで容量を調整します。
    2. 次のサイクリング条件9でリアルタイムPCRを実行します:95°Cで10分間(DNAの初期変性およびホットスタートポリメラーゼの活性化)、95°Cで15秒間の40サイクル、および60°Cで1分間、デフォルトのCt設定を使用して結果を分析用にエクスポートします。

8. 3M MDSアッセイを用いた検出

  1. 分子検出アッセイ サルモネラ キットのプロトコルに従ってください。48ウェルブロックで培養物を数回ピペッティングして混合します。各サンプルの20μLをキット付属の溶解チューブにピペットで移します。
  2. サンプルを100°Cで15分間加熱します。溶液はピンクから黄色に変わります。サンプルを室温で10分間インキュベートします。解決策が黄色からピンクに変わります。
  3. 20 μLのライセートを試薬チューブに移し、試薬チューブをホルダーにロードします。
  4. ホルダーをMDS装置に追加し、キットとサンプルに関する情報を伝達するようにソフトウェアを設定します。この装置では、各ウェルにアッセイのロット番号とサンプル名をラベル付けする必要があります。MDS ソフトウェアを実行し、レポートをエクスポートします。

9. データ分析

  1. 肯定的な結果と否定的な結果の分類。
    1. 4 x 6滴めっきの場合、少なくとも1つのコロニーを持つ寒天プレート上のスポットを陽性と評価し、成長していない寒天プレート上のスポットを陰性として評価します。
    2. qPCR では、Ct が 30 以下のウェルを陽性と評価し、Ct が 30 を超えるウェルを陰性と評価します。
    3. MDS の場合は、MDS システムからの結果 (陽性または陰性として報告された) を使用します。
  2. MPN の計算
    1. 前述の単純な最大確率分解能(SMPR)法6または代替の検証済みMPN計算機を使用して、注釈付きの陽性と陰性を分析します。10名

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結果

照射肉
回帰分析では、傾き 1 は、独立変数 (x 軸) が単位増加するごとに、従属変数 (y 軸) が正確に 1 単位増加することを示します。これは、2 つの変数間の比例関係を示唆しており、従属変数の変化は独立変数の変化を反映していることを意味します。切片が 0 の場合、独立変数が 0 の場合、従属変数も 0 になります。これは、2つの変数間の関係に固定オフセットやバイアスがないことを示唆しています。傾き 1 と切片 0 を合わせると、変数11,12 が一致していることが示唆されます。この理想的なシナリオは、系統的なエラーやバイアスがないことを示しており、測定値が予測と完全に一致する、適切に調整されたシステムで期待される結果になります。

図3A は、ステップ3.1.1のノートで説明したスプレッドプレート分析によって検証された理論上の接種物に対してプロットされたMPN...

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ディスカッション

プロトコルの意義
サルモネラ菌は、食品の安全性、特に家禽製品内で依然として主要な懸念事項であり、食中毒の発生にしばしば関与しています13,14。米国における細菌性食中毒の主な原因として、新鮮な家禽製品と調理済みの家禽製品の両方でサルモネラ菌を検出するための信頼性の高い方法は、食品の安全性を確保するために重要です15。サルモネラ菌を低レベルで定量する能力は、他の方法では検出されない可能性のある汚染を特定するために不可欠です。分析法の感度は、規制遵守や公衆衛生にとって特に重要であり、特に脆弱な集団では、低用量のサルモネラ菌でも病気を引き起こすことがあります。

MPN-LAMPアッセイは、現在FSISがMLG 4.15で使用しているMDSシステム...

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開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、米国農務省、農業研究サービス(USDA-ARS)、国家プログラム108、現在の研究情報システム番号8072-42000-093-000-Dおよび8072-42000-094-000-Dによって支援されました。USDAは機会均等の提供者であり、雇用主です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
48ディープウェルブロック4.6mlFisher Scientific International, IncNC1964628
寒天 - 固化剤 (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)281230
分析天びんメトラー・トレドJL602-G/L機器 
分析天びんメトラー・トレドAB54-S装置 
オートクレーブ - Amsco Lab250、実験室用蒸気滅菌器Steris plcLV-250Equipment 
バイオセーフティキャビネット タイプA2 清浄機ロジック+Labconco Corporation302411101Equipment 
Brain Heart Infusion (BHI) BrothBecton, Dickinson and Company (BD)237500
バッファード ペプトン水Bio-Rad Laboratories Inc.
セルスプレッダー - L字型VWR76208-438
遠心分離機 微量遠心分離機 5424エッペンドルフ5424機器
遠心分離機、Avanti J-25Beckman Coulter, Inc. 
装置: DNA 抽出 - PreMan Ultra サンプル調製試薬 サーモフィッシャーサイエンティフィック社 
鶏ひき肉 地元の小売業者
IACフォワード プライマー:5'-GGCGCGCCTAACACACATCT-3'IntegratedDNA Technologies 
IACプローブ:5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC
CACCA-3'を5' TAMRA/3' BHQ-2		Biosearch Technologies
IACリバースプライマー:5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTA-3'IntegratedDNA Technologies 
インキュベーター - Inova 4230インキュベーターシェーカーNew Brunswick Scientific4230Equipment 
接種ループ - Combi Loop  10µLおよび1µL フィッシャーサイエンティフィックインターナショナル株式会社22-363-602
invAフォワードプライマー:5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG
G-3'Integrated		DNA Technologies 
invAプローブ:5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC
CTTCCTC-3'標識、5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1		Biosearch Technologies
、invAリバースプライマー:5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'IntegratedDNA Technologies 
照射治療テキサスA&M Agrilife Research National Center for Electron Beam ResearchService
Luria Bertani (LB) BrothBecton, Dickinson and Company (BD)244620
手動ピペット Pipet-Lite LTS ピペット L-1000XLS+メトラー・トレド17014382装置
手動ピペット Pipet-Lite LTS ピペット L-100XLS+メトラー・トレド17014384装置
手動ピペット Pipet-Lite LTS ピペット L-10XLS+メトラー・トレド17014388機器
手動ピペット Pipet-Lite LTS ピペット L-200XLS+メトラー・トレド17014391機器
手動ピペット Pipet-Lite LTS ピペット L-20XLS+メトラー・トレド17014392機器
手動ピペット Pipet-Lite マルチピペット L8-200XLS+メトラー・トレド17013805装置
マニュアルピペット Pipet-Lite マルチピペット L8-20XLS+メトラー・トレド17013803装置
用メディア収納ボトル -PYREX 1L 角ガラス ボトル、GL45スクリューキャップ付きCorning Inc.1396-1L機器
メディア収納ボトル -PYREX 2L丸型広口ボトル、GLS80スクリューキャップ付きCorning Inc.1397-2L機器
マイクロタイタープレート、96ウェルプレート、平底、ポリスチレン、0.34cm2、滅菌、108/csMilliporeSigmaZ707902
ミキサー - Vortex Genie 2Scientific Industries Inc.SI-0236
装置 分子検出アッセイ 2-サルモネラ菌キットNeogenMDA2SAL96
分子検出装置 ネオジェンMDS100機器 
電動ピペットコントローラーPIPETBOY2 INTEGRA Biosciences Corp.155019機器
PCRマスターミックス2×TaqMan 遺伝子発現 サーモフィッシャーサイエンティフィック社 
ペトリ皿ローテーター -  bioWORLD 接種ターンテーブルフィッシャーサイエンティフィックインターナショナル株式会社3489E20
クリアリッド付きペトリ皿 (100 mm x 15mm)フィッシャーサイエンティフィックインターナショナル株式会社FB0875713
ピペットチップ GP LTS 1000µL S 768A/8メトラー・トレド 
ピペットチップGP LTS 20µL 960A/10メトラー・トレド30389270
ピペットチップ GP LTS 200µL F 960A/10メトラー・トレド30389276
鶏肉製品を調理する準備ができ地元の小売店
試薬リザーバー、マルチチャンネルピペッターで使用される25 mL滅菌リザーバーサーモフィッシャーサイエンティフィック社 8093-11
リアルタイム PCR - 7500 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems, Foster City, CA)2750036476Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック社 170356N
血清ピペット、Nunc 血清ピペット (2 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170372N
血清ピペット、Nunc 血清ピペット (25 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170357N
血清ピペット、Nunc 血清ピペット (50 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170376N
スプレッダー - フィッシャーブランド L 字型セルスプレッダーフィッシャー・サイエンティフィック・インターナショナル社14-665-230
ストマッカーバッグ、Nasco Whirl-Pak ライトオン ホモジナイザー ブレンダー フィルターバッグサーモフィッシャーサイエンティフィック社 01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab BlenderSeward30010019Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)Applied Biosystems535028293Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex Elga LabWaterPF2XXXXM1-USEquipment
Whirlpakバッグ1.63L フォルクスワール11216-777
35646844318930で標識436954230389273ました

参考文献

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