方法論記事

足細胞損傷の調節と糖尿病性腎臓病の治療の予測と検証 by Yinhuo Tang

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DOI：

10.3791/67939

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2025年6月20日

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

この記事について

サマリー

ネットワーク薬理学と実験的検証を使用して、このプロトコルは、糖尿病性腎疾患(DKD)の治療におけるYinhuo Tang(YHT)の作用機序と、YHTがPI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路の阻害を通じてDKDマウスの足細胞の損傷をどのように軽減するかを明らかにします。

要約

糖尿病性腎疾患(DKD)は、大量のタンパク尿と糸球体濾過率の低下を特徴とする慢性腎臓病です。DKDの主な病理学的特徴は腎微小血管障害であり、糖尿病患者の~40%がDKDを発症します。足細胞関連タンパク質CD2APおよびWT-1は、足細胞の正常な機能と糸球体ろ過バリアの完全性を維持する上で重要な役割を果たします。炎症、酸化ストレス、またはその他の病理学的障害により足細胞の構造または機能が破壊されると、スリット横隔膜とアクチン細胞骨格が損傷し、糸球体濾過バリアの透過性が増加し、タンパク尿を引き起こします。Yinhuo Tang(YHT)は、タンパク尿を減らし、腎機能の低下を遅らせる機能を持つ伝統的な漢方薬の処方箋です。しかし、DKDの治療におけるYHTのメカニズムは明らかではありません。本論文では、ネットワーク薬理学と動物実験に基づき、yhTを8週間投与したdb/dbマウスの血糖値、肝機能、腎機能、血中脂質、腎病態、足細胞マーカータンパク質CD2APおよびWT-1の発現レベル、およびPI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路を検討しました。私たちの結果は、YHTがPI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路を阻害することにより炎症因子の発現レベルを低下させ、DKDの進行を遅らせる役割を果たす足細胞の損傷を軽減することを示しています。

概要

糖尿病性腎疾患(DKD)は、糖尿病の蔓延する重篤な合併症であり、依然として世界的に末期腎不全の主な原因となっています1。この疾患は、糸球体肥大、メサンギウム拡大、尿細管間質性線維症、細胞外マトリックス成分の過剰な蓄積など、一連の複雑な病理学的過程を経て進行します2,3。糖尿病管理の改善にもかかわらず、現在の治療法は主に血糖値と血圧を制御することを目的としており、DKDの根本的な病理学的変化を逆転させるのではなく、DKDの進行を遅らせるだけです。このことは、より包括的で効果的な治療選択肢が急務であることを強調しています4,5。

伝統的な中国医学(TCM)は、DKD6,7,8などの慢性疾患の治療における有望な代替療法として浮上しています。TCMは、DKDの複雑でマルチターゲットな性質に対処できるホリスティックな治療アプローチを強調しています。さまざまなTCM製剤の中で、Yinhuo Tang(YHT)は、陰に栄養を与える(血液量を補う)、腎臓を引き締める(腎機能を強化する)、熱を澄ます(炎症を抑制する)、陽を抑える(血圧を下げる)など、複数の生理学的機能を持っていることが示されています9,10,11。しかし、YHTがDKDを緩和するメカニズムの包括的な理解はまだ不足しています。

足細胞関連タンパク質CD2APは、足細胞の重要なタンパク質であり、ろ過バリアの完全性を維持するために重要ですが、WT-1は腎臓の発達と線維化に重要な役割を果たします12,13,14,15,16。したがって、これら2つのタンパク質の正常な機能は、正常な糸球体濾過機能にとって不可欠です。既存の文献では、これらの標的がDKDの進行に関与していることが示唆されており、YHTの活性成分がこれらの標的と相互作用して治療効果を発揮する可能性があると仮定しています。この研究は、これらの相互作用を確認し、YHT が DKD の疾患経路をどのように調節するかについてより深い洞察を提供することを目的としています。

この研究では、ネットワーク薬理学と動物実験を組み合わせて、DKDにおけるYHTの治療メカニズムを探ります。ネットワーク薬理学は、バイオインフォマティクスツールを統合して活性化合物と生物学的標的との間の複雑な相互作用を分析することで、YHTの作用のマルチターゲット、マルチパスウェイの性質を探求することができます17,18,19。従来の創薬手法では、単一標的の介入が重視されることがよくあります。対照的に、ネットワーク薬理学は、潜在的な経路や分子標的を特定するのに役立つ予測ツールとして機能し、複雑な治療法の可能な作用機序に関する予備的な洞察を提供します。ネットワーク薬理学は、医薬品開発に必要な厳格な実験および規制手順に取って代わるものではありませんが、仮説生成を導き、初期段階の研究を合理化することができます20。

最終的に、この研究は、伝統医学と現代医学の間のギャップを埋めることを目的としており、TCMをDKDの治療に統合するための科学的証拠を提供します。この研究の結果は、DKDのより効果的で安全な治療戦略の開発に役立ち、副作用によって制限されがちな標準治療に代わるものを提供する可能性があります。YHTの分子メカニズムを解明し、その治療可能性を検証することで、DKDの治療におけるTCMの幅広い適用性を実証したいと考えています。

プロトコル

本研究には、同じ遺伝的背景を持つ6週齢の雄型2型自発糖尿病(C57BL/Ksj db/db)マウスと非糖尿病対照マウス(db/m)の雄6匹を選抜した。マウスは、長春伝統中国医学大学動物実験センター(ライセンス番号:SYXK(JI)2023-0014)の無菌SPFグレードの環境に2週間収容されました。この期間中、彼らは定期的な維持食と滅菌水を提供しました。空腹時血糖値は、2週間の期間の開始時と終了時にdb/dbマウスで測定され、両方の試験で11.1mmol/Lを超える結果が出たマウスのみが実験に含まれました。この研究は、長春中国伝統医学大学の倫理委員会によって承認されました(ID番号:2024147)。

1.薬剤の調製

  1. YHTの調製(表1)
    1. Rehmannia glutinosa(30 g)、Ophiopogon japonicus(10 g)、Morindae Officinalis Radix(10 g)、Poria cocos(15 g)、およびSchisandra chinensis(6 g)を選択し、ハーブを水ですすぎ、表面の不純物やほこりを取り除きます。次に、生のハーブ71gを蒸留水710mLと混合し、セラミックポットに60分間浸します
    2. 100°Cで沸騰させた後、煎じ薬の温度を80°Cに60分間下げてから、2層の医療用ガーゼでカスをろ過します。液体を4°Cの冷蔵庫に保管します。
    3. 上記のカスに710mLの蒸留水を加え、ステップ1.1.1とステップ1.1.2の浸漬を1回繰り返します。液体を4°Cの冷蔵庫に保管します。
    4. ステップ1.1.2と1.1.3の上記の2つの薬液を混合し、真空凍結乾燥機の材料トレイに置きます。.真空ポンプを始動して凍結乾燥チャンバーから空気を抜き、温度を-40°Cに設定し、6時間維持して薬液中の水を固体状態に凍結します。次に、温度を-20°Cに36時間調整して、水を氷の結晶としてガスに昇華させます。最後に、温度を40°Cに設定し、24時間維持して薬液に残っている水分を取り除き、加熱ポンプと真空ポンプをオフにして、凍結乾燥粉末(YHT粉末)を取り除きます。
    5. 0.4615 g、0.923 g、および1.846 gの凍結乾燥YHT粉末を秤量し、1 mLの生理食塩水に懸濁し、それぞれ0.4615 g / mL、0.923 g / mL、および1.846 g / mLの濃度でYHTの懸 ?? 液を作成します。.
  2. バルサルタンの調製
    1. バルサルタン(10.29mg)をPEG30055mL50に添加し、よく振って完全に溶解させる。
    2. ステップ1.2.1の溶液に50mLの生理食塩水を加え、よく振とうして均質化し、濃度10.29 mg / mLのバルサルタン溶液を得ます。

2. 薬物治療

注:実験は、正常対照群(CON)、モデル群(MOD)、バルサルタン陽性対照群(POS)、YHTの低用量群(YH-L)、YHTの中用量群(YH-M)、およびYHT(YH-H)の高用量群の6つのグループに分けられました。成人は1日あたり71gのYHTを必要とします。実験マウスとヒトの薬物投与量の換算式によると、マウスの1日量は~9.23 g/kgでした。

マウスの等価実験用量 (g/kg) = ヒト用量 (g)/体重 (70 kg) × 9.1

  1. マウスの頭、首、体が一直線になるように、マウスの背部を利き手ではない手でしっかりとつかみ(もがかないように)、1mLの強制針をマウスの食道の生理学的湾曲と同様の角度で適切に配置します。.マウスの口角に強制針を押し込み、舌に押し付けて口蓋に押し当て、胃の中にそっと内側に押し込みます。
  2. 利き手の人差し指で薬剤をゆっくりと押し込み、針を垂直に引き抜くと強制手術が完了します。
    注:薬物の用量は10 mL / kgで、合計4週間でした。.
    1. 10 ml・kg-1・day-1 生理食塩水をCONマウスおよびMODマウスに強制経口投与します。
    2. 10.29 mg・kg-1・day-1 バルサルタン懸濁液をPOS群マウスに強制経口投与します。.
    3. これらのグループに強制経口投与により、次の用量のYHTを投与します:4.615 g・kg-1・day-1 をYH-Lグループに投与します。9.23 g・kg-1・day-1 をYH-Mグループに。18.46 g・kg-1・day-1 をYH-Hグループに。

3. YHTの有効性評価

  1. 血液および尿の生化学的指標の検出
    1. 8週間の連続薬物投与後、メタボリックケージを用いてマウスから24時間尿を採取し、採取した尿を7,992 × g で10分間遠心分離し、上清を除去し、尿中タンパク質検査キットを用いて尿タンパク質レベルを測定する。
    2. 利き手でない手でマウスの背面をつかんでマウスを固定し、利き手ではない同じ手の小指と薬指を使用してマウスの尻尾を固定します。マウスの尾の先端をヨウ素蒸気綿球で滅菌します。利き手で採血針を持ってマウスの尾の先端にすばやく穴を開け、マウスの尾の付け根から尾の先端まで絞って、血糖試験紙に血液を落とします。
    3. 利き手ではない手でマウスの尻尾をつかみ、親指と人差し指で肩甲骨の部分を固定し、マウスの腹部が上を向くようにします。利き手で、フェノバルビタールナトリウムで満たされた1mLの注射器を持ちます。.針(深さ3〜5 mm)を腹腔内に30〜45°の角度で挿入し、へそと後肢の間の領域をターゲットにし、針を頭に向けています。シリンジプランジャーをゆっくりと引き出して、血液を確認します。血液が吸引されている場合は、それに応じて針の位置を変えます。
    4. ペントバルビタールナトリウム溶液をゆっくりと注入して均一な投与を確保し、注射が完了したらシリンジを引き出します。.10分待ってから、利き手に鉗子を持って、マウスの後肢のつま先をそっとつまんで反応を確認します。それでも反応が観察される場合は、必要に応じて少量の追加用量(10 mg / kg)を投与します。.
      注:マウスの体重が60 gで、フェノバルビタール溶液が1%w / vであると仮定すると、0.06 mLが反応の場合に投与される追加用量です。.
    5. はさみを使用してマウスの目の周りのひげと毛を切り取り、利き手ではない手で眼球を取り除く目の周りの皮膚を押して眼球が突き出るようにします。眼球周囲の皮膚をエタノールで滅菌し、ピンセットを使用して眼球をすばやく取り出して血液が微量遠心チューブ(1.5〜2mL)に滴下するようにし、チューブを室温で10分間インキュベートし、チューブを7,992 × gで10分間遠心分離し、上清液を抽出します。
    6. キットの指示に従って、血清中の血清クレアチニン(Scr)、血中尿素窒素(BUN)、アルブミン(ALB)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、トリグリセリド(TG)、および総コレステロール(TC)の発現レベルを測定します。
  2. 腎組織の分離
    1. 採血後、マウスを手術用プレートに仰臥位に固定し、マウスの前胸部の毛をクリップし、エタノールを使用して前胸部を滅菌し、腹部の皮膚をハサミで切り、小腸と大腸を脇に押して腎臓を露出させます。
    2. マウスの腎臓組織を取り出し、止血鉗子を使用して骨膜を鈍く分離し、左の腎臓を-80°Cの冷凍庫に入れて保存し、右の腎臓を4%パラホルムアルデヒド溶液を含む20mLのチューブに入れて腎臓を固定します。
    3. 24時間後にホルムアルデヒドから右腎臓を取り出し、蒸留水で5分間短時間すすぎ、無水エタノールの勾配(100%→95%→85%→75%、各5分)を使用して脱水し、グラジエントキシレン(2 x 10分)を使用して透明化し、パラフィンワックスに埋め込み、ワックスブロックを室温で固化させます21。その後、-20°Cの冷凍庫に一晩入れます。
    4. ワックスブロックを取り外し、3μmの厚さでスライスし、水に入れて広げてからスライドで釣り上げ、40°Cの恒温オーブンに入れて30分間焼き、その後の分析のために保管します
  3. 腎臓病理組織学的解析
    1. 右腎臓を摘出し、上記のようにキシレン脱ロウと無水エタノール脱水(ステップ3.2.3)を行い、蒸留水で洗浄します。
    2. ヘマトキシリンおよびエオシン染色剤(H&E)、過ヨウ素酸シフ染色剤(PAS)、およびMasson染色キットの指示に従って染色を行います。
    3. ステップ3.2.3のように、無水エタノールの勾配脱水とキシレンの透明性を再度実行します。
    4. 室温で乾燥させた後、中性ガムを封入剤として、カバースリップで組織切片をスライドにマウントします。スライドを観察し、400倍の倍率の光学顕微鏡で画像化します。
  4. 腎組織の免疫組織化学的解析
    1. ステップ3.2.3で説明したように右腎臓を取り出し、切片を脱ろうおよび脱水し、10 mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)に入れ、抗原修復のために5分間加熱(125°C、103 kPa)します。10分後、切片を取り出し、室温まで冷まし、1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
    2. 切片を3%過酸化水素溶液に10分間入れて内因性ペルオキシダーゼをブロックし、PBSで3 x 5分間洗浄します。
    3. 10%のヤギ血清をセクションに滴下し、ヤギの美容液がセクション全体を均一に覆うことを確認します。切片をウェットボックスに入れ、37°Cで30分間インキュベートし、PBSで3 x 5分間洗浄します。
    4. 一次抗体COI-I(1:200)、α-SMA(1:200)、WT-1(1:200)、CD2AP(1:200)を滴下し( 材料表を参照)、4°Cのウェットボックスで冷蔵庫で一晩インキュベートします。
    5. 切片を取り出し、PBSで3 x 5分間洗浄し、二次抗体(1:3,000)を滴下し、37°Cで60分間インキュベートし、PBSで3 x 5分間洗浄します。
    6. 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)発色液を10分間添加し、発色液を蒸留水で洗い流し、100μLのヘマトキシリンと室温で5分間インキュベートし、蒸留水で5分間すすぎます。
    7. ステップ3.2.3で説明したように脱水、透明化、密封し、光学顕微鏡を使用して画像を収集します。
  5. 定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)アッセイ解析
    1. 10 mL のホモジナイザーチューブに ~100 mg の凍結腎臓組織を取り込み、明らかな組織塊がなくなるまで乳棒で十分に粉砕し、1 mL の RNA 抽出試薬を加えて均質化します。
    2. 250 μLのクロロホルムを加え、ボルテックスミキサーで10秒間振とうし、氷上で5分間インキュベートし、15,984 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上部水相を新しいチューブにピペットで取り出します。
    3. 水相に500 μLのイソプロパノールを加え、ボルテックスミキサーで10秒間十分に混合し、氷上で5分間インキュベートします。その後、15,984 × g で10分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、RNAペレットを75%エタノール1mLで洗浄します。短時間のボルテックス後、再度15,984 × gで10分間遠心分離します。エタノールを捨て、RNAペレットを室温で風乾させます。
    4. 30 μLのジエチルピロカーボネート水を加えてRNAを溶解し、分光光度計を使用して260 nmおよび280 nmでのRNA溶液の吸光度を測定し、RNA濃度を計算します。
      注:RNAの純度は、A260/A280 の比率で評価されます。理想的なA260/A280 比は1.8〜2.0で、RNAの純度が良好であることを示しています。比率が1.8未満の場合、タンパク質またはフェノール汚染の存在を示唆している可能性があり、汚染物質を除去するために追加のフェノール-クロロホルム抽出またはエタノール沈殿を行うなど、さらなる精製が必要です。
    5. total RNA 3 μg、4 μL の 4 gDNA Wiper Mix、および RNase-free ddH2O を最終容量 16 μL まで混合し、1,250 × g で 10 秒間遠心分離し、42 °C で 2 分間インキュベートします。上記の溶液16 μLに4 μLの5倍逆転写酵素を加え、1,250 × gで10秒間遠心分離します。逆転写プログラムを 50 °C (15 分) → 85 °C (5 秒) → 4 °C (10 分) で実行します。合成したcDNAを-20°Cで保存します。
    6. cDNA溶液をフリーザーから取り出し、90°C(10分)で予備変性を行い、続いて94°C(30秒)→60°C(30秒)→72°C(24秒)の40サイクルを行い、最後に95°C(15秒)→60°C(60秒)→95°C(350秒、60°Cは0.1°C/sの速度で95°Cまで徐々に上昇)の順に溶解します。
    7. WT-1、CD2AP、PI3K、AKT、NF-κB、およびIL-1βの相対発現を、Gapdhを内部参照とする各サンプルのCt値(ΔΔCt=標的遺伝子のCt値-内部参照遺伝子のCt値)に基づく2-ΔΔCt法を用いて計算します(表2参照)。
  6. ウェスタンブロット(WB)アッセイ解析
    1. 10 mLのホモジナイザーチューブに~100 mgの凍結腎臓組織を、続いて500 μLの溶解液(プロテアーゼ阻害剤:ホスファターゼ阻害剤:RIPA= 1:1:100)を服用し、明らかな組織塊がなくなるまで乳棒で十分に粉砕します。
    2. チューブを氷上で30分間インキュベートし、15,984 × g で10分間遠心分離し、上清を吸引します。
    3. BCAアッセイを使用して、各サンプルのタンパク質濃度を測定します。測定された濃度に基づいて、各グループから等量の総タンパク質(30 μgなど)を新しいチューブにピペットで注入し、PBSを使用して最終容量を調整して一貫性を確保します。次に、5倍タンパク質ローディングバッファーを添加し、100°Cで10分間煮沸した後、取り出して室温まで冷却します。
    4. 12.5% SDS-PAGEゲル電気泳動を使用してタンパク質を分離します。まず、80Vでサンプルを濃縮ゲルをゆっくりと通過させ、次にサンプルが分離ゲルの底まで流れるまで電圧を120Vに調整し、ユニットの電源を切ります。
    5. 濾紙をメンブレントランスファーバッファーに浸し、ピンセットを使用してPVDFメンブレンの角を保持し、メタノールに浸して活性化します。ゲルを取り外し、プラスチックプレートを使用して濃縮ゲルと分離ゲルの底を切り取り、次に、濾紙/ゲル/ PVDFメンブレン/濾紙のサンドイッチ構造に従ってメンブレントランスファーデバイス(負極としてのゲル、正極としてのPVDFメンブレン)をセットアップし、予冷された転写バッファーで満たされたメンブレントランスファータンクにセットアップを置きます。 角氷で囲んで低温を保ち、200mAの定電流で転写を行います。
      注:タンパク質の分子量に応じて転写時間を決定します(分子量が大きいほど、転写時間が長くなります)。
    6. PVDFメンブレンをブロッキングバッファーに入れ、ブロッキングバッファーを室温で90分間振とうし、TBST(TBST1Lあたり50 mLの20x TBSと0.5 mLのTween-20)で3 x 5分間洗浄します。
    7. WT-1 (1:1,000)、CD2AP (1:1,000)、P-PI3K (1:1,000)、P-AKT (1:1,000)、P-NF-κB (1:1,000)、IL-1β (1:1,000) の希釈一次抗体を用いて、PVDF メンブレンに一次抗体を添加し、4 °C 冷蔵庫のウェットボックスで一晩インキュベートします ( 材料表を参照)。
    8. PVDFメンブレンを4°C冷蔵庫から取り出し、TBSTで3 x 5分間洗浄し、二次抗体希釈液希釈二次抗体(1:10000)を使用して、室温で60分間インキュベートする二次抗体を加え、TBSTで3 x 5分間洗浄し、PVDFメンブレンを化学発光イメージャーに入れ、ECL発光液を滴下(A:B = 1:1)。

4. DKD治療のためのYHTのネットワーク薬理学的解析

  1. YHTの有効成分とターゲットのスクリーニング
    1. TCMSPデータベース(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)を使用して Radix Rehmanniae Praeparata、 Morindae Officinalis Radix、 Poria、 およびSchisandra Chinensis の有効成分を決定し、BATMAN-TCMデータベース(http://bionet.ncpsb.org/batmantcm)からMaitake の有効成分を決定します。有効成分を特定するためのスクリーニング基準として、経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30% 、 薬物類似性(DL)≥0.18 を設定します。
    2. TCMSPデータベース(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)で、上記のTCMから有効成分の作用目標を検索してください。
    3. 上記の有効成分のターゲットを強調しず、それらをリストに追加してさらに分析します。Uniprotタンパク質データベース(https://www.uniprot.org)を使用してターゲットの名前を標準化します。
  2. YHTの有効成分のターゲットネットワークの構築
    1. 有効成分とそれに対応するターゲットをソフトウェアにインポートします: 「ファイル|インポート |ネットワーク を構築し、関連データをロードします。
    2. ネットワーク トポロジ解析を実行するには、[ ツール] |ネットワーク解析 |Analyze Network は、医薬品、有効成分、標的、疾患間の関係を可視化します。ネットワークの視覚化では、ノードは 有効成分を表し、 エッジ は 有効成分とターゲット間の相互作用を表します。
  3. DKD関連ターゲットのスクリーニング
    1. Diabetic Kidney Diseaseを検索語として使用し、種をHumanとして設定し、次のデータベースからDKD関連のターゲットをスクリーニングします https://www.genecards.org。OMIMデータベース(http://www.omim.org);TTDデータベース(https://www.ttd.cn);DrugBankデータベース(http://www.drugbank.ca);DisGeNETデータベース(http://www.disgenet.org)。
    2. 5 つのデータベースから結果を取得したら、それらをスプレッドシートにマージし、「データ」メニューの「重複の削除」機能を使用して重複を削除します。これにより、DKD 関連ターゲットの一意の名前のみが保持されます。
  4. PPI(タンパク質間相互作用)の構築とコアターゲットのスクリーニング
    1. スプレッドシートソフトウェアを使用して、1つの列にYHTターゲットのリストを入力し、別の列にDKDターゲットのリストを入力して、YHTとDKDの交差ターゲットを特定します。条件付き書式を適用して、両方の列に共通のエントリを強調表示し、交差ターゲットを識別します。
    2. 文字列データベースのWebサイト(https://cn.string-db.org/)を開き、[入力]を選択します。貼り付け/アップロード してデータをバッチインポートし、 しきい値を次数 ≥ 1 に設定して、ネットワーク内の空きターゲット (インタラクションのないターゲット) を除外します。
    3. [ファイル] |インポート |[ネットワーク] に移動し、フィルター処理された交差ターゲットをソフトウェアにインポートして、最終的な視覚化を作成します。
    4. [ネットワーク解析] |ネットワークを分析し、次数の値に基づいてYHT-DKDのコアターゲットをフィルタリングします。
  5. Gene ontology(GO)機能解析と京都遺伝子・ゲノム事典(KEGG)パスウェイエンリッチメント解析
    1. http://metascape.org/gp/index.html にアクセスしてMetascapeプラットフォームを開き、Start Analysisを選択して開始し、Custom Analysisセクションの入力ボックスにYHTとDKDのターゲットのリストを貼り付け、ドロップダウンメニューから種をHomo sapiensに設定し、Custom Analysisを選択し、P値の閾値を<0.01に設定し、Submitをクリックして解析を実行します。
    2. Metascapeから結果が返されたら、http://www.bioinformatics.com.cn/ に移動し、[ツール] | [エンリッチメントGO用語]を選択し、結果からGO用語を貼り付け、[ 送信 ]をクリックしてバブルチャートを生成します。上位 10 個の GO 用語を P 値に基づいて並べ替えて視覚化します。
    3. Metascape解析結果からのP値に基づいてKEGG経路をソートします。同じ微生物学のウェブサイト(http://www.bioinformatics.com.cn/)にアクセスし、「go kegg pathway enrichment」を選択し、選択した上位10本のKEGG経路を貼り付け、「 Submit 」をクリックしてKEGGバブルダイアグラムを視覚化します。

5. 統計分析

  1. データが正規分布に従い、分散が等質な場合は、一元配置分散分析を使用します。分散が均一でない場合は、ダネットのT3検定または独立標本 のt検定を使用します。
  2. 正規分布に従わないデータの場合は、ノンパラメトリック法の順位和検定を使用します。
  3. P < 0.05 を統計的に有意であると考えます。

結果

DKDマウスの血糖値、肝機能、腎機能、脂質代謝障害の改善
投与の8週間後、異なる用量のYHTは、ランダム血糖値、24時間UTP、Scr、およびBUNのレベルを有意に低下させ、腎機能を改善しました(図1A-D)。ALBのレベルを上げました。ALTとASTのレベルを下げました。肝機能の強化(図1E-G);TCとTGのレベルを下げました。脂質代謝の調節を改善しました(図1H、I)。以上の結果から、YHTは血糖値、肝臓・腎臓機能、脂質調節に対する保護効果があることが示されました。

DKDマウスにおける腎病理組織学的損傷の改善
YHTがDKDマウスの腎障害を改善できるかどうかを検証するために、H&E、PAS、およびMasson染色、およびIHCを使用して、腎組織の病理学的損傷の程度を調べました。H&EおよびPAS染色により、糸球体萎縮、アルブギニア内膜領域の拡大、尿細管上皮細胞の腫脹と剥離、間質性炎症細胞の浸潤、およびMODグループでの明らかな糸球体グリコーゲン沈着が明らかになりました(図2A、B)。Masson染色では、CON群と比較して、MOD群の腎臓における青色コラーゲン線維の有意な増加が示されました(図2C、D)。IHCは、COI-Iおよびα-SMAに陽性の地域の割合が、CONグループよりもMODグループで有意に高いことを示しました(図2E-G)。対照的に、YHTおよびPOSの使用後、糸球体萎縮、つながれたゾーンの拡大、尿細管上皮細胞の腫脹および脱落、間質性炎症性細胞浸潤の程度、および糸球体グリコーゲン沈着は有意に軽減されました。青いコラーゲン繊維の面積は大幅に減少しました。また、COI-Iおよびα-SMAに陽性の地域の割合は大幅に減少しました。以上の結果から、YHTはDKDマウスの腎病理学的損傷および腎線維症を軽減できることが示されました。

DKDマウスにおける足細胞損傷の減弱
DKDマウスの足細胞の損傷は、IHC、PCR、およびWBによって観察されました。IHCの結果から、足細胞の機能マーカータンパク質であるCD2APおよびWT-1の発現量は、MOD群ではCON群に比べて有意に低下し、腎足細胞が損傷を受けていることが示されました。YHT治療により、CD2APとWT-1の発現レベルが上昇し、足の細胞への損傷が減少しました(図3A-C)。PCRおよびWBの結果は、足細胞機能マーカータンパク質であるCD2APおよびWT-1の相対的なmRNAおよびタンパク質発現レベルがCONグループと比較してMODグループで有意に減少し、CD2APおよびWT-1の相対的なmRNAおよびタンパク質発現レベルがYHT処理後に有意に増加したことを示しました(図3D-H)。以上の結果から、YHTはDKDマウスの足細胞損傷を軽減できることが示されました。

ネットワーク薬理学によるDKDに対するYHTの影響に関連する潜在的な標的とシグナル伝達経路の解明
YHT(291)の有効成分は、TCMSPおよびBATMAN-TCMデータベースを通じてスクリーニングされ、そのうち39の有効成分がOB≥30%、DL≥0.18の基準を満たしました。有効成分をデータベースで検索してターゲットを特定し、重複する値をマージして削除した後、合計303のターゲットを取得しました(図4A)。GeneCards、OMIM、TTD、Drugbank、DisGeNETの5つのデータベースの結果を統合し、重複する値を削除した結果、最終的に1,867のDKD関連ターゲットが得られました。次に、http://www.bioinformatics.com.cn/ を使用して、スクリーニングされたYHT有効成分をDKDターゲットと交差させたところ、84のターゲットが交差しました(図4B)。これらの84のターゲットをCytoscapeソフトウェアにインポートしてPPIネットワーク図を描画し、AKT、IL-1 β、CASP3、APOE、およびJUNを含む、DKDのYHT治療の潜在的な主要なターゲットを特定しました(図4C)。GO機能濃縮分析では合計1,246項目が得られ、YHTがホルモンへの応答などの生物学的プロセス、タンパク質ホモ二量体化活性や酸化還元酵素活性などの分子機能、さらには膜ラフトや膜マイクロドメインなどの細胞成分を調節することにより、DKDに治療効果を発揮する可能性があることが示されました(図4D).合計263のKEGG濃縮結果が得られましたが、これは主に糖尿病複合体のAGE-RAGEシグナル伝達経路、アルコール性肝疾患、脂質およびアテローム性動脈硬化症経路に関連していました。P値に基づいて、上位10件の結果が選択され、KEGGの可視化バブルチャートが描画されました(図4E)。AGE-RAGE シグナル伝達経路は、糖尿病性複合体に高度に濃縮されており、PI3K、AKT、IL-1β などの PPI の複数のコアターゲットがこの経路に濃縮されています。したがって、このシグナル伝達経路は、その後の検証のために選択されました。

PI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路の阻害による足細胞損傷の減弱
PI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路に関連する遺伝子とタンパク質の発現レベルを、PCRとWBによってさらに調べました。PCRの結果、MOD群のPi3k、Akt、Nf-κb、およびIl-1βの相対的なmRNA発現レベルは、CON群と比較して有意に上昇し、YHTの投与後に有意に減少したことが示されました(図5A-D)。WBの結果は、P-PI3K、P-AKT、P-NF-κB、およびIL-1βの相対的なタンパク質レベルも、CONグループと比較してMODグループで有意に上昇したのに対し、YHTの投与後に有意に減少したことを示しました(図5E-I)。これらの結果はさらに、YHTがDKDマウスの足細胞損傷を弱めることにより、PI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路を阻害できることを示唆しました。

figure-results-1
図1:DKDマウスの血糖値、肝機能、腎機能、脂質代謝障害の改善。 (A)ランダムな血糖値に対するYHTの影響;(B-D)腎機能、24時間尿中タンパク質、血中クレアチニン、尿素窒素を含む。(E−G)血清アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを含む肝機能;(H、I)総コレステロールおよびトリグリセリドを含む脂質代謝調節。データは、空白グループと比較した6つの独立したサンプルの平均±標準偏差として表され、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、モデルグループ#p <0.05、##p < 0.01、###p < 0.001と比較すると、これらの統計表記はすべての図で一貫して使用されます。略語:YHT = yinhuo Tang;DKD = 糖尿病性腎臓病;ALB =アルブミン;ALT =アラニンアミノトランスフェラーゼ;AST =アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ;TC =総コレステロール;TG =トリグリセリド;CON = コントロールグループ;MOD = モデルグループ;POS = バルサルタン陽性対照群;YH-L = YHTの低用量群;YH-M = YHTの中用量群;YH-H = YHTの高用量群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:DKDマウスにおける腎臓の組織病理学的損傷の改善 (A,B) H&EおよびPAS染色による腎組織学 (スケールバー= 20 μm);(C)腎線維症の程度を観察するためのマッソン染色、および(D)ImageJソフトウェアを使用した半定量分析。(E-G)IHCおよびImageJソフトウェア(スケールバー= 20 μm)を使用した腎組織におけるCOI-Iおよびα-SMAの相対発現レベルの半定量的分析。略語:YHT = yinhuo Tang;DKD = 糖尿病性腎臓病;H&E = ヘマトキシリンおよびエオシン染色;PAS = 過ヨウ素酸-シッフ染色;COI-I = I型コラーゲン;α-SMA = α-平滑筋アクチン;CON = コントロールグループ;MOD = モデルグループ;POS = バルサルタン陽性対照群;YH-L = YHTの低用量群;YH-M = YHTの中用量群;YH-H = YHTの高用量群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:DKDマウスにおける足細胞損傷の減衰 (A-C) IHCは、腎組織におけるCD2APとWT-1の相対発現レベルを検出しました(スケールバー= 20 μm)。(D,E)PCRは、腎臓組織における CD2AP および WT-1 の相対的なmRNA発現を検出し、Image Jソフトウェアを使用して半定量分析を行いました。(F-H)WBは、腎臓組織におけるCD2APおよびWT-1の相対的なタンパク質発現レベルを検出し、ImageJソフトウェアを使用して半定量分析を行いました。Image Jソフトウェアを使用した定量分析。略語:YHT = yinhuo Tang;DKD = 糖尿病性腎臓病;IHC = 免疫組織化学;WB = ウェスタンブロッティング;CD2AP = CD2関連タンパク質;WT-1 = ウィルムス腫瘍 1;CON = コントロールグループ;MOD = モデルグループ;POS = バルサルタン陽性対照群;YH-L = YHTの低用量群;YH-M = YHTの中用量群;YH-H = YHTの高用量群。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:DKD治療のためのYHTのネットワーク薬理学的分析(A)DKD治療のためのYHTの有効成分-疾患標的プロット。(B)YHTとDKDの交差するターゲットのベン図。オレンジ色は、DKDに関連するターゲットの数を表します。緑色は、YHT有効成分の治療標的の数を表します。交差部分は、交差するターゲットの数 (DKD に対する YHT のターゲットの数) を表します。(C)YHTとDKDの交差するターゲットのPPIネットワーク図。(D)DKDの治療のためのYHTの10の最も重要なターゲットのGO濃縮分析。(E)DKDのYHT治療のための10の最も重要なターゲットのKEGG濃縮分析。略語:YHT = yinhuo Tang;DKD = 糖尿病性腎臓病;PPI = タンパク質間相互作用;GO = 遺伝子オントロジー;KEGG = 京都遺伝子・ゲノム百科事典;CON = コントロールグループ;MOD = モデルグループ;POS = バルサルタン陽性対照群;YH-L = YHTの低用量群;YH-M = YHTの中用量群;YH-H = YHTの高用量群。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:PI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路の阻害による足細胞損傷の軽減。 (A-D)腎臓組織における Pi3k、 Akt、 Nf-κb、 およびIl-1β の相対的なmRNA発現を検出するためのPCR。(E-I)腎組織におけるP-PI3K、P-AKT、P-NF-κB、およびIL-1βの相対タンパク質発現レベルを検出するためのWBおよびImageJソフトウェアを使用して半定量分析を行いました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:Yinhuo Tangの組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:qRT-PCRプライマーの詳細。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルの重要なステップの1つは、ネットワーク薬理学を使用してYHTの活性成分を特定し、DKD関連ターゲットとの相互作用を予測することです。このステップでは、データベース(TCMSP、DrugBank、GeneCardsなど)などのバイオインフォマティクスツールを使用して大規模な生物学的データを分析して、YHTの影響を受ける分子経路と潜在的な生物学的ネットワークをマッピングします。この予測に続いて、DKDの動物モデルによる実験的検証が行われ、これらの経路に対するYHTの仮説的な効果がテストされました。計算予測とデータの統合は、調査結果の信頼性を高め、理論的な予測と実際の結果との間のギャップを埋めるため、私たちのアプローチの重要な側面です。さらに、動物モデルの使用は、YHTの治療効果を検証するための別の重要なステップです。動物におけるDKDは、ヒトの疾患の進行を密接に模倣しており、糸球体損傷と腎線維症の両方に対するYHTの影響を効果的に評価することができます。Scr、BUN、タンパク尿などの腎機能マーカーの詳細なモニタリングは、組織病理学的評価とともに、YHTの治療効果を評価するために不可欠です。

私たちのプロトコルは強力な計算方法と実験方法を組み合わせていますが、いくつかの制限があります。まず、ネットワーク薬理学のアプローチは、公開データベースで利用可能なデータに大きく依存しており、YHTまたはDKD関連経路の特定の構成要素に関する情報に偏りや欠落している可能性があります。この問題を軽減するために複数のデータベースを相互参照しましたが、関連する相互作用の一部はまだ見落とされる可能性があります。第二に、この研究は実験動物レベルで足細胞の損傷を軽減するYHTのメカニズムを調査しただけであり、実験結果を検証するには細胞実験と臨床大規模サンプル研究が必要です。最後に、ネットワーク薬理学は、YHTによるDKDの治療が、アルコール性肝疾患、脂質代謝とアテローム性動脈硬化症、および脂肪細胞の脂肪分解の調節にも関連していることを示しました。この研究では、YHTによるPI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路の変調がDKDの進行を遅らせることができるかどうかを検証しただけです。その結果については、さらに調査が必要です。

PI3K/AKT/NF-κBシグナル伝達経路は、細胞増殖、増殖、生存、炎症反応などの様々な生物学的プロセスの制御に関与する重要な細胞内シグナル伝達経路である22。研究によると、小児球損傷の進行に重要な役割を果たしていることが示されています23,24。NF-κBは、PI3K/Akt経路の重要な下流コンポーネントであり、さまざまな細胞内シグナルの伝達や複数の遺伝子の発現に関与しています。PI3K/AKTシグナル伝達経路の阻害は、NF-κB阻害タンパク質IκBの分解につながり、それが今度はNF-κBのリン酸化とその核への侵入につながり、さまざまなケモカインや炎症因子の産生を引き起こし、足細胞の損傷と腎間質性線維症につながります25。いくつかの研究では、PI3K/AKT/NF-κB シグナル伝達経路の活性化を阻害すると、炎症反応と腎線維症を効果的に抑制し、DKD26 の進行を遅らせることができることが示されています。

研究によると、脂質代謝障害はDKDの発症と進行に重要な役割を果たしています27,28。DKD患者は、LDL、TG、脂肪酸の蓄積レベルの上昇など、異常な脂質代謝を示すことがよくあります。これらの異常は、糸球体硬化症や尿細管間質性線維症などの病理学的変化と密接に関連しています29,30。研究によると、脂質代謝障害は、複数のシグナル伝達経路を通じてDKDの進行を促進することができることが示されています31,32。まず、mTORシグナル伝達経路は脂質代謝の調節における重要な経路です。その過剰活性化は、足細胞の損傷とタンパク尿33,34につながります。高脂肪環境は、PI3K/AKT/mTOR軸を通じて脂質の蓄積を促進し、足細胞のアポトーシスを誘導し、最終的には腎機能の低下を悪化させる可能性がある35,36,37。第二に、AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)は、細胞エネルギー代謝の重要な調節因子であり、脂肪酸酸化を促進し、脂質合成を阻害し、脂肪毒性を低下させることにより、腎臓を代謝障害から保護する38,39,40。AMPKの不活性化は、DKDの進行における重要なメカニズムと考えられています。メトホルミンなどのAMPK活性化剤は、有意な腎保護効果を示しており、DKD41の有望な治療標的となっています。

最後に、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α/γ(PPARα/γ)が脂質代謝とDKD42,43の調節に重要な役割を果たすことが研究で実証されています。PPARαの活性化は脂肪酸の酸化を促進し、腎臓での脂質蓄積を減少させ、一方、PPARγはインスリン感受性を改善し、抗炎症効果を発揮する44,45。フィブラートなどのPPARアゴニストは、DKD患者のタンパク尿を減少させる潜在的な臨床的利益を示しています46。結論として、脂質代謝障害は、複数のシグナル伝達経路を介してDKDの病理学的進行に影響を与えます。これらの経路間の相互作用は、複雑な病理学的ネットワークを形成します。脂質代謝を標的とすることで、DKDの新たな治療戦略が見つかる可能性があります。

カスパーゼ(CASP)ファミリーは、システイン特異的プロテアーゼのファミリーであり、細胞に広く見られ、主にアポトーシスおよび炎症反応の調節に関与しているプロテアーゼのグループである47,48。CASPファミリーのメンバーは構造的類似性を共有し、通常は酵素剤として存在し、これは一連の反応を通じて活性化され、したがってアポトーシス、ピロトーシス、および他のプログラムされた細胞死プロセスを引き起こす49。その中でも、CASP3は、通常はザイモーゲンとして存在する保存された構造を持つカスパーゼ(CASP)ファミリーのメンバーであり、特定の細胞タンパク質の切断を触媒するアポトーシスの実行段階における重要なプロテアーゼであり、それにより正常な細胞増殖の調節と内部恒常性の維持に重要な役割を果たしています50,51.Caspase-8は、アポトーシスカスケードの開始剤として作用し、細胞増殖の調節における重要な要素であるNPKの活性化を通じて炎症反応の調節に関与します。カスパーゼ-8は、アポトーシスカスケードの開始者として作用し、NLRP1およびNLRP3などの炎症小胞を活性化することにより炎症反応の調節にも関与し、それにより細胞性ピロトーシスを誘発する52。有茎細胞におけるアポトーシスとピロトーシスの媒介におけるCASPシグナル伝達経路の重要な役割に基づいて、YHT、CASP3 / 8、有価細胞、およびDKDとの関係についてさらに詳細な調査が将来必要になります。

従来の創薬アプローチでは、規制の明確さと予測可能性のために明確に定義された単一ターゲットメカニズムが強調されていましたが、当社のネットワーク薬理学に基づく戦略により、YHTのようなTCM製剤に内在するマルチターゲット相互作用を体系的に探索することができます。この複雑さは、TCMの全体的な性質とその潜在的な治療範囲を反映していますが、慎重な検証と解釈を必要とする意図しないオフターゲット効果の課題も強調しています。YHTの作用のマルチターゲットおよびマルチパスウェイの性質を考慮することにより、DKDの治療におけるその治療効果についてより全体的な理解を提供します。さらに、ネットワーク薬理学は、潜在的な薬物相互作用と副作用の予測を可能にし、これは多成分療法の安全性と有効性を確保するために重要です。現在のDKD治療は、根本的な疾患のメカニズムに対処するのではなく、症状の管理や進行の遅延に大きく焦点を当てています。この研究は、最新のバイオインフォマティクスツールと実験的検証を統合することにより、特にDKDのような慢性疾患におけるTCMの有効性を改善するためのシステムバイオロジーの重要性を強調しています。

今後、この手法は、TCM研究、特にDKDのような複雑な疾患の治療におけるネットワーク薬理学の範囲を拡大するために大きな期待を寄せています。私たちのアプローチは、腎臓病、心血管疾患、代謝障害の治療における治療の可能性について、他のTCM処方または個々のハーブを探索するために適用できます。さらに、この方法論は、DKD治療における既存の薬物の新たな用途を特定することにより、薬物再利用を調査するために拡張することができます。私たちのアプローチのもう一つの潜在的な応用は、個別化医療です。患者固有のデータを組み込むことにより、ネットワーク薬理学を使用して、個々の分子プロファイルに基づいてTCM治療戦略を調整し、治療効果を高め、副作用を最小限に抑えることができます。

開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

本研究は、吉林省自然科学基金会(No.20210101201JC)の支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
無水エタノール中国国家製薬集団化学試薬有限公司10009218
動物実験センター長春伝統中国医学大学SYXK (JI) 2023-0014
BATMAN-TCM データベースhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
BCA Protein Assay KitSolarbioPC0020
ブロッキングバッファーBeyotimeP0023B
セラミックポットMideaMD-DG30E103
化学発光イメージングシステム杭州申花技術有限公司SH-523
ロホルム中国国立製薬グループ化学試薬有限公司10006818
Cytoscape 3.8.0ソフトウェア----
DAB試薬キットServicebioG1212-200T
db/db マウス南京 Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL substrate solutionaffinityKF8003
電気恒温水浴槽Fisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
電気泳動装置電源北京龍坊テクノロジー株式会社LF-600S
ガラスホモジナイザーSolarbioYA0852
ガラススライド南通 Meiweide ライフサイエンス株式会社PC2-301
ヤギ抗ウサギ IgG HRP(二次抗体)アフィニティS00011:3000 IHC、1:10000 WB
ヘマトキシリン武漢リンシバイオテクノロジー株式会社G1140
高速冷蔵遠心分離機 湖南Kechengの器械装置Co.、株式会社H1-16KR
HiScript II Q RT qPCRのためのSuperMix (+gDNAのワイパー)VAZYMER223-01
のシェーカー江蘇Haimen 麒麟の麒麟の器械の製造Co.、株式会社TS-1
イメージ投射システムNikonNikon DS-U3
理性的なデジタル磁気暖房のスターラー杭州Miouの器械Co.、LtdTP-350E+
イソプロパノール中国国家製薬グループ化学試薬有限公司80109218
マーカー(20-120KD)GenScriptM00521
Masson染色キットBASOBA4079B
Medical ガーゼJianerkang Medical--
Metascapeプラットフォームhttp://metascape.org/gp/index.html--
メタノールサーモ67-56-1
微生物学のウェブサイトhttp://www.bioinformatics.com.cn/--
顕微鏡コンECLIPSE Ci
電子レンジランツ電子レンジ電化製品有限公司P70D20TL-P4
マルチサンプルティッシュグラインダー上海Jingxin工業Development Co., LtdTissuelyser-24L
多機能分析電子天秤常州ラッキー電子機器ゲーム会社FA1204
中性樹脂武漢 Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
ノーマルヤギ血清SolarbioSL038
オーブンShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
手のひら遠心分離機Wuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
PAS染色キットBASOBA4114B
病理学スライサーShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR機器Hangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
ピペットガンDragonKE0003087/KA0056573
一次抗体希釈バッファーBeyotimeP0023A
タンパク質ホスファターゼ阻害剤複合体MeilunbioMB12707-1
PVDF膜(0.22 μm)SolarbioISEQ00010
Quick 一次/二次抗体希釈剤SolarbioA1811
Rabbit anti-CD2APAffinityDF22981:200 for IHC, 1:1000 for WB
Rabbit anti-COI-IAffinityDF12149:200 for IHC, 1:1000 for WB
Rabbit anti-IL-1&β;アフィニティAF51031:1000 WB
ウサギ anti-P-AKTアフィニティAF00161:1000 WB
ウサギ anti-P-NF-ΚbWB
anti-P-PI3KアフィニティAF32421:1000 WB
ウサギ anti-WT-1アフィニティDF63311:200 IHC、1:1000 WB
ウサギ anti-α-SMAアフィニティAF10321:200 IHC、1:1000 WB
anti-&β;-ActinAffinityAF70181:1000
リアルタイムPCRシステムABIQuantStudio 6
RIPA Lysis BufferMeilunbioMA0151
RNase-free ddH2OSolarbioR1600
Secondary Antibody Dilution BufferBeyotimeP0023D
スライドガラスとカバーガラス江蘇省泰実験装置有限公司10212432C
SPSS 26.0ソフトウェア----
文字列データベースウェブサイト https://cn.string-db.org/--
超純水装置Zhiang Instrument(Shanghai)Co.、LtdClever-S15
Taq Plus DNAポリメラーゼTIANGENET105-02
TCMSPデータベース https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php--
ティッシュグラインダー美しい壁MB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20中国国家製薬グループ化学試薬Co.、株式会社30189328
超マイクロ紫外線可視分光光度計杭州Miouの器械Co.、株式会社ND-100
ユニプロット タンパクデータベースhttps://www.uniprot.org--
正立光学顕微鏡ニコンニコン エクリプス CI
尿タンパク検査キット南京建城バイオエンジニアリング研究所C035-2
真空凍結乾燥機寧波新志バイオテクノロジーA01-1-NA0959
型電気泳動タンク北京61計器工場DYCZ-24DN
ボルテックスミキサー武漢Lingsiバイオテクノロジー株式会社MX-F
西部ブロッキングバッファーSolarbioSW3010
キシレン中国国立製薬グループ化学試薬有限公司10023418
Yihong武漢Lingsiバイオテクノロジー株式会社E8090
クロ横ニガ 1 ウサギ ウサギ WB縦

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