コンピュータビジョンライブラリを使用して核の定量を効率化

Summary

この記事では、さまざまな細胞密度で検証されたオープンソースの実行可能プログラムを使用して、画像ベースの核定量を自動化する方法を段階的に説明します。このプログラムは、コスト、技術的なスキルセットが限られているユーザーのアクセシビリティ、および既存のテクノロジーの有用性を制限する可能性のあるアプリケーション固有の検証に関連する障壁に対処する代替手段を提供します。

Abstract

生細胞アッセイや画像ベースの細胞解析では、正確な解釈のためにデータの正規化が必要です。一般的に使用される方法は、核を染色して定量し、その後、データを核数に正規化することです。この核数は、多くの場合、単核細胞の細胞数として表されます。手動による定量化は面倒で時間がかかる場合がありますが、利用可能な自動化方法はすべてのユーザーに好まれるわけではなく、この特定のアプリケーションに対する検証が不足している場合や、コストがかかりすぎる場合があります。ここでは、蛍光DNA染色で染色された核の定量化可能な画像をキャプチャし、Pythonコンピュータビジョンライブラリを使用して開発された自動オブジェクトカウントソフトウェアプログラムを使用して核を定量するためのステップバイステップの手順を説明します。また、このプログラムは、さまざまな細胞密度で検証されています。プログラムの実行の正確な時間は、画像の数とコンピューターハードウェアによって異なりますが、このプログラムは、核を数える作業時間をプログラムの実行時間を秒数に統合します。このプロトコールは、固定された染色細胞の画像を使用して開発されましたが、生細胞の染色された核の画像や免疫蛍光アプリケーションも、このプログラムを使用して定量化できます。最終的に、このプログラムは、高度な技術スキルを必要としないオプションを提供し、細胞生物学者や分子生物学者がワークフローを合理化し、面倒で時間のかかる核定量化のタスクを自動化するための検証済みのオープンソースの代替手段です。

Introduction

機能的および画像ベースの実験は、実験的処理が全細胞の生化学および生理学に及ぼす影響を理解するために重要です。細胞生物学実験のデータの有効な解釈は、データの標準化を含む実験プロトコルの精度と再現性に依存します。例えば、ベースライン時および特定の薬物による治療後の生細胞内の酸素消費量と細胞外酸性化速度の分析により、エネルギー代謝のさまざまな側面の評価が可能になります^1,2。細胞培養の上清中の乳酸デヒドロゲナーゼなどの酵素の活性を測定することは、細胞膜の完全性を定量化するのに役立ちます³。培養細胞を固定前にアネキシンVとヨウ化プロピジウムで染色すると、アポトーシス細胞と壊死細胞の評価が可能になります⁴。ただし、ウェル間の細胞密度の違いは、これらの各アッセイの結果に影響を与えます。播種密度のみに依存すると、播種用の細胞数計数の誤り、プレーティング中の培地中の細胞密度のばらつき、または実験中のサンプル間または処理間で細胞増殖速度が異なるため、誤解を招く結果をもたらす可能性があります。そのため、実験結果の正規化が必要です。

機能的および画像ベースの細胞データに対する現在の正規化方法には、タンパク質濃度

Protocol

注:補足ファイルは次のリンクにあります https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 蛍光顕微鏡による画像取得・保存

1. イメージングする細胞または組織サンプルを調製し、目的のDNA色素による染色を含めます。ここで使用した画像を得るために、C2C12筋芽細胞(CRL-1772、American Type Culture Collection)を、50 mM EtOH⁶の有無にかかわらず、標準培養条件(5%CO₂、37°C、加湿)で6ウェルプレートで48〜72時間増殖させ、前述の¹³と同様に氷冷メタノールで固定した。固定細胞は、DAPI含有封入剤¹⁵を用いてマウントし、暗所で乾燥させてからイメージングした。
2. 確立された標準操作手順に従って、蛍光顕微鏡とコンピューターのすべてのコンポーネントの電源を入れます。顕微鏡に関連付けられているソフトウェアを開きます。
3. 顕微鏡を視覚化するように設定しますamp接眼レンズを通してファイル。対物レンズを確認します。必要に応じて、ノーズピースを目的の目的に回します。ソフトウェアプログラムに、画像領域を正確に表示するための目的の対....

Results

各バッチ画像実行では、1)同定された核の輪郭を示す輪郭が適用された画像ファイルのセット(図5)、および2)画像ファイル名と関連するカウントをリンクする.csvファイル(スプレッドシート)が生成されます。等高線を表示すると、ユーザーはカウント品質を視覚的に評価できます。具体的には、セクション 1 に従って取得された画像には、すべての (またはほぼすべて) の核が、プログラムによって原子核がカウントされたことを示す緑色の実線で囲まれている必要があります。これらの等高線は、ここでプログラムを調整するために使用されました。

図5:元の画像と対応する輪郭の例。 .......

Discussion

当社の核定量化プログラムには、既存のオプションに比べていくつかの利点があります。最小限の技術スキルしか必要とせず、核定量という特定のタスクに対して検証され、オープンソースであること。後者は、コスト関連の障壁を克服します。最終的に、このプログラムは、細胞生物学者や分子生物学者に、蛍光顕微鏡を使用して撮影された画像中の核を迅速かつ正確に定量するための追加オプションを提供します。現在利用可能な自動核または細胞カウントプログラムは、すべてのユーザーに好まれているわけではなく、中には法外な費用がかかるものもあり、特定のアプリケーションでは検証が最小限であるか、または存在しない可能性があります。BioTek Cytationラインなどの専用機器には、核染色²⁰を使用したin situ細胞カウントの検証を行う技術情報のほか、さまざまな追加アプリケーションが付属しています。バリデーションデータが存在し、Cytation製品ラインは広く使用されていますが、特にSeahorse Extracellular Flux Analyzersとインタ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
方法 2 または 3 の結果ファイルにアクセスできるコンピューター	-		手順 2.6 (方法 2 の場合) または手順 3.3.9 または 3.4.9 (方法 3 の場合) を参照してくださいインターネット
にアクセスできるコンピューター、最新のブラウザ	(		Google Chrome など)
最新のブラウザー、Windows OS	異なります		Mac、Linux、またはその他の OS の場合は、方法 3
キャプチャ用のソフトウェアを備えたコンピューターを使用します	Zeiss	AxioVision	その他のソフトウェアは許容されます。蛍光顕微鏡と互換性がある必要があります
出力用のファイルの場所(結果スプレッドシートと画像の輪郭)	-	-	新しい空のフォルダにすることができます
光顕微鏡	Zeiss	Axiovert 200M	その他の蛍光顕微鏡は許容されます。適切なフィルターキューブ、目的の対物レンズ、およびカメラを装備する必要があります 。
定量化するすべての画像を含むフォルダ	-		ステップ 1.12 を参照
Python バージョン 3.10 以降		-	https://www.python.org/downloads/  で無料でダウンロードおよびインストールできます。
イメージングするサンプル	-	-	固定または生き、染色または蛍光DNA色素で対比
シートソフトウェア	Microsoft	Excel	同様のスプレッドシートソフトウェアも受け入れられます