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方法論記事

コンピュータビジョンライブラリを使用して核の定量を効率化

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DOI:

10.3791/67945

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2025年6月6日

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1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

この記事について

サマリー

この記事では、さまざまな細胞密度で検証されたオープンソースの実行可能プログラムを使用して、画像ベースの核定量を自動化する方法を段階的に説明します。このプログラムは、コスト、技術的なスキルセットが限られているユーザーのアクセシビリティ、および既存のテクノロジーの有用性を制限する可能性のあるアプリケーション固有の検証に関連する障壁に対処する代替手段を提供します。

要約

生細胞アッセイや画像ベースの細胞解析では、正確な解釈のためにデータの正規化が必要です。一般的に使用される方法は、核を染色して定量し、その後、データを核数に正規化することです。この核数は、多くの場合、単核細胞の細胞数として表されます。手動による定量化は面倒で時間がかかる場合がありますが、利用可能な自動化方法はすべてのユーザーに好まれるわけではなく、この特定のアプリケーションに対する検証が不足している場合や、コストがかかりすぎる場合があります。ここでは、蛍光DNA染色で染色された核の定量化可能な画像をキャプチャし、Pythonコンピュータビジョンライブラリを使用して開発された自動オブジェクトカウントソフトウェアプログラムを使用して核を定量するためのステップバイステップの手順を説明します。また、このプログラムは、さまざまな細胞密度で検証されています。プログラムの実行の正確な時間は、画像の数とコンピューターハードウェアによって異なりますが、このプログラムは、核を数える作業時間をプログラムの実行時間を秒数に統合します。このプロトコールは、固定された染色細胞の画像を使用して開発されましたが、生細胞の染色された核の画像や免疫蛍光アプリケーションも、このプログラムを使用して定量化できます。最終的に、このプログラムは、高度な技術スキルを必要としないオプションを提供し、細胞生物学者や分子生物学者がワークフローを合理化し、面倒で時間のかかる核定量化のタスクを自動化するための検証済みのオープンソースの代替手段です。

概要

機能的および画像ベースの実験は、実験的処理が全細胞の生化学および生理学に及ぼす影響を理解するために重要です。細胞生物学実験のデータの有効な解釈は、データの標準化を含む実験プロトコルの精度と再現性に依存します。例えば、ベースライン時および特定の薬物による治療後の生細胞内の酸素消費量と細胞外酸性化速度の分析により、エネルギー代謝のさまざまな側面の評価が可能になります1,2。細胞培養の上清中の乳酸デヒドロゲナーゼなどの酵素の活性を測定することは、細胞膜の完全性を定量化するのに役立ちます3。培養細胞を固定前にアネキシンVとヨウ化プロピジウムで染色すると、アポトーシス細胞と壊死細胞の評価が可能になります4。ただし、ウェル間の細胞密度の違いは、これらの各アッセイの結果に影響を与えます。播種密度のみに依存すると、播種用の細胞数計数の誤り、プレーティング中の培地中の細胞密度のばらつき、または実験中のサンプル間または処理間で細胞増殖速度が異なるため、誤解を招く結果をもたらす可能性があります。そのため、実験結果の正規化が必要です。

機能的および画像ベースの細胞データに対する現在の正規化方法には、タンパク質濃度5、核または細胞数6などがあります。データをタンパク質濃度に正規化するには、アッセイの実行後にプロテアーゼ阻害剤を含む等量の溶解バッファーで細胞を抽出し、タンパク質定量のために追加のアッセイ(ビシンコニン酸アッセイ、ブラッドフォードアッセイなど)を実施する必要があります。この方法の精度は、完全な細胞抽出に依存しています。タンパク質を放置すると、定量ミスの一因となります。核または細胞のカウントは、細胞が成長する表面から細胞を除去する必要がない代替手段を提供します。代わりに、生細胞または固定細胞を比色染色または蛍光染色を使用して染色または対比染色し、細胞全体または核のみの画像に基づいてカウントを行うことができます。核の定量化は、蛍光顕微鏡のアプリケーションや、融合細胞(筋管など)や組織のデータの標準化に、全細胞よりも好まれます。蛍光アプローチを用いた核の定量には、蛍光DNA色素(例えば、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩化物(DAPI)、Hoechst 33342、Hoechst 33358、DRAQ5など)を生細胞または固定細胞に適用し、蛍光顕微鏡を用いてイメージングします。DAPI、Hoechst、およびDRAQ5は、DNA7,8,9のアデニン-チミンに富む領域に優先的に結合し、核を検出する手段を提供します。色素濃度の最適化により、オフターゲット結合(すなわち、ミトコンドリアDNAへの結合、点状細胞質蛍光)10が防止されます。最適化プロセスは、固定細胞用のDAPIを含む市販の封入剤(例:VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI)および生細胞用の公表された濃度の染色剤(例:Hoechst)6,11,12を使用することで合理化できます。染色後、生細胞または固定細胞の核を適切な励起フィルター(紫外線[DAPIおよびHoechst]または遠赤[DRAQ5]など)を使用して視覚化します。DAPI、Hoechst、およびDRAQ5の励起最大値は、蛍光顕微鏡のスペクトルの両端にあります。この特性に加えて、これらの色素のDNA特異性および最適な濃度での使用により、オフターゲット蛍光が最小限に抑えられます。得られた画像は、黒い背景に対して明るい核を示しており、これらの核は単核細胞の細胞数の尺度として定量化されます。組織学的染色や明視野顕微鏡13を使用した核定量化の正確な染色ベースの方法は他にもありますが、これらのアプローチを使用した自動化は可能ですが、より困難です。

手動による核の定量化は依然としてゴールドスタンダードですが、手間と時間がかかり、長時間の計数による人為的ミスの影響を受けやすくなります。自動細胞計数プログラムは存在しますが、すべてのユーザーに好まれるわけではなく、法外な費用がかかる場合があり、特定のアプリケーションに対するバリデーションは最小限で済む場合があります。Pythonは、近年、生物学者にとって貴重でアクセス可能なリソースになっています。Pythonコンピュータビジョンライブラリは、画像分析14に特に役立ちます。ここでは、Pythonコードを使用して開発された実行可能プログラムを使用して、蛍光色素で染色された核を定量化し、蛍光顕微鏡でイメージングするための手順を段階的に説明します。ここで説明するプログラムを使用するために、コーディングスキルは必要ありません。このワークフローは、蛍光DNA色素が適用された細胞または組織に特異的です。明視野画像での使用は意図されていません。セクション1では、蛍光顕微鏡を使用して収集した画像を、このワークフローと互換性のある方法でキャプチャおよび保存する方法について説明します。セクション2では、核定量化プログラムを実行可能プログラムとして実行し、出力を取得する手順について説明します。実行可能プログラムは、提供された.exeファイルから直接実行でき、高品質の画像で核を定量化するための変更は必要ありません。この実行可能ファイルには、Windows ベースの PC が必要です。セクション 3 では、プログラムを実行ファイルではなく Python スクリプトとして実行するための手順を提供し (Mac または Linux ベースのシステムでは必須、Windows ベースのシステムではオプション)、必要に応じてコードをチューニングできます。セクション 4 では、正規化に結果を使用する方法について説明します。これらのプロトコルの後には、当研究室からの検証データを含む代表的な結果が発表されます。

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プロトコル

注:補足ファイルは次のリンクにあります https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. 蛍光顕微鏡による画像取得・保存

  1. イメージングする細胞または組織サンプルを調製し、目的のDNA色素による染色を含めます。ここで使用した画像を得るために、C2C12筋芽細胞(CRL-1772、American Type Culture Collection)を、50 mM EtOH6の有無にかかわらず、標準培養条件(5%CO2、37°C、加湿)で6ウェルプレートで48〜72時間増殖させ、前述の13と同様に氷冷メタノールで固定した。固定細胞は、DAPI含有封入剤15を用いてマウントし、暗所で乾燥させてからイメージングした。
  2. 確立された標準操作手順に従って、蛍光顕微鏡とコンピューターのすべてのコンポーネントの電源を入れます。顕微鏡に関連付けられているソフトウェアを開きます。
  3. 顕微鏡を視覚化するように設定しますamp接眼レンズを通してファイル。対物レンズを確認します。必要に応じて、ノーズピースを目的の目的に回します。ソフトウェアプログラムに、画像領域を正確に表示するための目的の対物レンズが選択されていることを確認します。ここでは、10倍の対物レンズを使用して画像を撮影しました。
  4. 照明を消した状態で、サンプル(スライド、プレート、またはディッシュ)をステージに置きます。適切なフィルターでライブイメージングをオンにし、露光時間を事前に決められた時間または自動露光に設定します。ここでは、DAPIフィルターと61〜62ミリ秒の露光時間を使用しました。特にセル密度の高い画像の場合、露光時間の設定に関するガイダンスについては、トラブルシューティングの表を参照してください。
  5. 接眼レンズを使用して、染色された核が見えるまでグロス調整ノブを使用してピントをゆっくりと調整し、次に微調整ノブを使用して、核が鮮明で鮮明に見えるまでピントをゆっくりと調整します。
    注: 適切なイメージの例を 図 1 に示します。
    1. バックグラウンドの染色が過度に見られる場合、または核が非常に暗く見える場合は、露光時間を手動で調整してください。1つの画像では、一部の核の信号強度に目に見える違いがある場合があります。ただし、丸い形状は、信号干渉を最小限に抑えて、すべての原子核から見える必要があります。
      注意: ダウンストリームアプリケーションで使用されるプログラムは、さまざまな強度に対して堅牢です。核定量プログラムの開発と検証に使用される生画像には、さまざまなシグナル強度の画像が含まれ、Open Science Frameworkリポジトリ(上記のリンクを参照)から入手できます。

figure-protocol-1
図1:DAPI染色された核の画像例。 これらの画像は、(A)低、(B)中程度、または(C)高細胞密度の核を最小限の背景で示しています。画像C全体で核の信号強度が異なることに注意してください。これは定量化を妨げませんでした。スケールバー(C)は100μmを示します。スケールバーは、核の定量に使用される画像から省略する必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 接眼レンズを通して核にピントが合ったら、検出モードをカメラに切り替えます。微調整ノブを使用してフォーカスを調整します。
  2. 必要に応じて露出時間を調整します。後続のサンプルや画像で使用するための最終的な露光時間に注意してください。
    注:すべての画像で同じ露光時間を使用することが理想的ですが、蛍光強度はサンプル間で定量化または比較されないため、このアプリケーションでは露光時間の変動が許容されます。
  3. ソフトウェアの適切な画像キャプチャボタンを使用して画像をキャプチャします。サンプルに複数の染色剤が塗布されている場合は、フィルターを切り替えて(例:FITC、TRITC、Cy5)、同じ領域をイメージングしてマージします。
  4. シャッターを適用して、サンプルの光への露出を最小限に抑えます。スケールバーに書き込まず、画像をユニバーサルフィギュアファイル形式(.tif、.png、または.jpg)で専用のフォルダーに保存します。各イメージ ファイル名が適切に説明されていること、またはファイル名に使用されるコーディングに適切なリンクされたドキュメントがあることを確認します。
    注:これは、定量化プログラムの画像ディレクトリになります。マルチカラーイメージングを使用した場合は、原子核の画像のみを別の専用フォルダにコピーしてください。これは、イメージングセッションの終了時にも行うことができます。ほとんどのイメージングソフトウェアでデフォルトのエクスポート設定を使用してエクスポートされた画像は、高品質の画像がキャプチャされている場合、通常、このプログラムで使用するのに十分な解像度です。ただし、エクスポート後に画像を視覚的にチェックして、核の形態が明確であることを確認する必要があります。画像を.jpg形式で保存する場合は、画像が過度に圧縮されないように注意し、品質を維持する必要があります。
  5. シャッターを開き、ライブイメージングに戻り、サンプルを横切って別の場所にスキャンしてイメージングします。必要に応じて、手順1.8〜1.9を繰り返します。10倍の倍率で撮影した6ウェルプレートに播種した細胞の画像の場合、ウェルごとに10〜15枚の画像を撮影します(サンプル領域全体の細胞密度の一貫性によって異なります)。
  6. 1 つのサンプルのすべての画像を取得したら、次のいずれかのオプションを実行します。
    1. 次のサンプルに進み、手順1.4〜1.10を繰り返します。
    2. プロトコルを一時停止し、別の時間に戻ります。サンプルは光から保護されたままにしておく必要があります。このオプションは、生細胞で作業する場合はお勧めしません。
  7. イメージングが完了したら、部屋の照明をオンにする前に、すべてのサンプルが光で保護されていることを確認してください。画像を含むフォルダがローカルに保存されている場合は、サムドライブ、クラウドストレージの場所、または定量化プログラムが実行されるコンピューターからアクセス可能なその他のネットワークドライブにファイルを転送します。専用のフォルダに保存します。
  8. 確立された標準操作手順に従って、顕微鏡とコンピューターのすべての部品をシャットダウンします。
  9. これでイメージングは完了です。セクション2で説明されているように自動定量化プログラムを使用してファイルを分析するか、またはセクション3で説明されているようにプログラムをPythonスクリプトとして実行して分析します。

2. 自動核定量プログラムを実行ファイルとして実行可能

注: この方法は、プログラムを実行ファイルとして実行し、Windows ベースの PC と互換性があり、Windows OS ユーザーに推奨される方法です。Mac OS またはその他の Windows 以外のユーザーは、プログラムを Python スクリプトとして実行する必要があります (セクション 3 を参照)。

  1. Pythonがコンピューターにインストールされていることを確認します。必要に応じて、python.org/downloads から Python をインストールするか (推奨)、Anaconda または Miniconda を使用してインストールします。公開日現在、このプログラムはPythonバージョン3.10-3.12でテストされています。
  2. ブラウザを開き、[https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases]に移動します。count_nuclei.zip という名前のファイルの最新バージョンをダウンロードします。
  3. [ダウンロード]フォルダから、 Zipファイル を右クリックし、[すべてのファイルをローカルコンピュータ上の目的の場所に抽出]します( 図2Aを参照)。このファイルの場所は開いたままにしておきます。このファイル・パスは、ステップ 2.5 で使用します ( 図 2B を参照)。
    注: Count_nuclei がアプリケーション ファイルとして表示されます。これが実行可能ファイルです。
  4. 検索バーでCMDまたはコマンドプロンプトを検索して、コマンドプロンプトを開きます。cd コマンドを使用して、ディレクトリーを実行可能ファイルのファイル・パス ( 図 2C を参照) に変更し、 Enter キーを押します。コマンドラインの例: C:\Users\janedoe>cd [cd の後のスペース、次にファイルパスをコピーして貼り付ける]
  5. 次のコマンド ラインで、次のように入力して Enter キーを押します。
    count_nuclei.exe - img_dir "path/to/images" - output_dir "path/to/output" - save_images - output_count_filename "results.csv"
    ここで、path/to/images は、分析する画像を含むフォルダへのファイルパスです (ステップ 1.14 を参照)。path/to/output は、.csvファイルを保存するフォルダへのファイルパスです (指定されていない場合は、デフォルトで現在の作業ディレクトリになります)。results.csv は、結果のカウントが保存されるファイル名です (指定しない場合、出力ファイル名はデフォルトで count_results.csv になります)。
    注: コマンドラインには引用符が必要です。ファイル・パスの前に引用符の後にスペースがないことを確認します ( 図 2C を参照)。
  6. 次のコマンド ラインが表示されたら、処理は完了です。これで、等高線と結果スプレッドシートが、手順 2.5 で出力ディレクトリとして指定した場所 (つまり、path/to/output、 図 2C を参照) で使用できるようになりました。
  7. 等高線を目視検査して、カウントの品質を確認します。結果は、セクション 4 で説明されているように、データの正規化に使用できるようになりました。
    注:等高線が核を見逃しているように見える場合(例:核が薄すぎる)、または核のグループが1つのアイテムに集まっている場合(例:露出オーバー、背景が多すぎる、アーティファクト)、ユーザーはトラブルシューティングテーブルを参照する必要があり、セクション4に進む前に、画像取得を最適化するためにセクション1に戻る必要がある場合があります。

figure-protocol-2
図2:セクション2のワークフローの主要部分の例。 (A)Downloadsフォルダからファイルを抽出します。矢印で示されている正しいフォルダをクリックして、ステップ2.3で目的の宛先への抽出(B)を有効にします。(C) ステップ 2.4 と 2.5 のコマンドの例、およびステップ 2.6 の完了を示す次のコマンド ラインの例。手順 2.4 (C) のファイル パスは、手順 2.3 (B) の抽出場所と一致することに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. Pythonスクリプトとしての自動核定量プログラムの実行

  1. Pythonがコンピューターにインストールされていることを確認します。必要に応じて、python.org/downloads から Python をインストールするか (推奨)、Anaconda または Miniconda を使用してインストールします。公開日現在、このプログラムはPythonバージョン3.10-3.12でテストされています。
  2. ブラウザを開き、[https://github.com/rbudnar/nuclei_counter]に移動します。「Green Code 」ボタンをクリックし、「 Download ZIP 」をクリックしてコードリポジトリをダウンロードします( 図3Aを参照)。
  3. Windows OSの場合は、次の手順を使用します。Mac OS ベースのマシンについては、手順 3.4 を参照してください。
    1. [ダウンロード]フォルダから、[ファイル]を右クリックして[すべて抽出]を選択し、ファイルをローカルコンピュータに抽出します(図3B-Cを参照)。
    2. 抽出したファイルの場所で、nuclei_counter-main という名前のフォルダーを開きます。これがコード リポジトリです。
      注:これは、このプログラムを初めて使用するときにのみダウンロードする必要があります。抽出したファイルをアクセス可能なネットワーク上の場所に移動し、その場所をメモするだけです。
    3. 検索バーでCMDまたはコマンドプロンプトを検索して、コマンドプロンプトを開きます。Python が Anaconda または Miniconda によってインストールされている場合は、標準のコマンド プロンプトの代わりに Anaconda プロンプトを開きます。これは、検索バーに「Anaconda Prompt」と入力することで見つけることができます。
    4. cd コマンドを使用して、ディレクトリーをコード・リポジトリーに変更し、 Enter キーを押します。以下のコード行を参照してください。この行では、大文字と小文字が区別されます。ファイルパスをコピーするときは、nuclei_counter-mainという名前のフォルダが開いていることを確認してください。pyproject または pyproject.toml という名前のファイルが表示されます ( 図 3D を参照)。コマンドラインの例: C:\Users\janedoe>cd [cd の後のスペース、次にファイルパスをコピーして貼り付ける]
    5. 次のコマンド・ラインで、スペースとピリオドを含めて次のように入力します ( 図 3D を参照)。
      pip install -e .
      注: 手順 3.3.5 と 3.3.6 は、このプログラムを任意のコンピューターで初めて実行するときにのみ完了する必要があります。これがすでに完了している場合は、手順 3.3.7 に進みます。インストール プロセスの初期化には、少し時間がかかる場合があります。
    6. Enter キーを押します。このコマンドを実行すると、このスクリプトを実行するために必要なライブラリがインストールされ、イベントコードの調整が必要なときにリポジトリを編集可能モードでインストールします (図 3D を参照)。
    7. 次のコマンド・ラインに次のように入力して、ディレクトリーをメイン・ソース・コード・ディレクトリーに変更します ( 図 3E を参照)。
      CD「nuclei_counter」
    8. 次のコマンド行で、次のように入力して Enter キーを押します ( 図 3E を参照)。
      python count_nuclei.py --img_dir "path/to/images" --output_dir "path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      ここで、path/to/images は、分析する画像を含むフォルダーへのファイルパスです (ステップ 1.14)。path/to/output は、.csvファイルを保存するフォルダへのファイルパスです (指定されていない場合は、デフォルトで現在の作業ディレクトリになります)。results.csv は、結果のカウントが保存されるファイル名です (指定しない場合、出力ファイル名はデフォルトで count_results.csv になります)。
      注: コマンドラインには引用符が必要です。ファイルパスの前に引用符の後にスペースがないことを確認してください。Pythonスクリプトは、指定されたファイルパス内のファイルを読み取り、ディレクトリ内のすべての画像に対して核カウントプログラムを実行します( 図3Eを参照)。結果のカウントは、指定した場所の結果.csvファイルに保存されます。
    9. 次のコマンド行が表示されたら、処理は完了しています ( 図 3E を参照)。これで、等高線と結果スプレッドシートが、手順 3.3.8 で出力ディレクトリとして指定した場所 (つまり、path/to/output) で使用できるようになりました。

figure-protocol-3
図 3: Windows OS を使用したセクション 3 のワークフローの主要部分の例。 コードにアクセスするには、[ コード ]というラベルの付いた緑色のボタンをクリックし、(A)Zipファイル(矢印で示されています)をダウンロードします。(B)Zipファイル(青色で表示)を右クリックし、(C)目的の宛先を設定して抽出します。(D)コマンドプロンプトを開いた後、手順3.3.4および3.3.5のコマンドの例。ステップ 3.3.5 のコマンドはすべて 1 行にあることに注意してください。次の行に「ファイルを取得しています」で始まるテキストは、Enterキー(ステップ3.3.6、つまりコマンドの実行)後に表示されます。(E) ステップ 3.3.7 と 3.3.8 のコマンドの例、ステップ 3.3.8 の実行後のプログレスバー、ステップ 3.3.9 の完了を示すコマンドラインの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. Mac OS の場合は、次の手順を使用します。
    1. [ダウンロード]フォルダから[ ファイル ]メニューをクリックし、[ 開く] を選択してファイルをローカルコンピュータに抽出します( 図4Aを参照)。
    2. 抽出したファイルの場所で、nuclei_counter-main という名前のフォルダーを開きます。これがコード リポジトリです。
      注:これは、このプログラムを初めて使用するときにのみダウンロードする必要があります。抽出したファイルをアクセス可能なネットワーク上の場所に移動し、その場所をメモするだけです。
    3. スポットライトを開く コマンド+スペースバー を押してターミナルを開きます。次に、「ターミナル」を検索します。
    4. cd コマンドを使用して、ディレクトリーをコード・リポジトリーに変更し、 Enter キーを押します。以下のコード行を参照してください。この行では、大文字と小文字が区別されます。ファイルパスをテキストドキュメントに入力し、ターミナルにコピーします。ファイルパスがcdの直前のテキストで始まっていることを確認します(例: 図4Bの/Users/userid)。コマンドラインの例: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
    5. 次のコマンド行では、ユーザー ID の後にドル記号が表示されます ( 図 4B を参照)。ドル記号の後にスペースがあることを確認し、コマンドの末尾にスペースとピリオドを含めて、次のように入力します。pip の直後に適切な Python バージョンをスペースなしで含めます (pip3 install -e )。
      注: 手順 3.4.5 と 3.4.6 は、このプログラムを任意のコンピューターで初めて実行するときにのみ完了する必要があります。これがすでに完了している場合は、手順 3.4.7 に進みます。インストール プロセスの初期化には、少し時間がかかる場合があります。
    6. Enter キーを押します。このコマンドを実行すると、このスクリプトを実行するために必要なライブラリがインストールされ、イベントコードの調整が必要なときにリポジトリを編集可能モードでインストールします。
    7. 次のコマンド・ラインで、ドル記号の後にスペースがあることを確認してから、次のように入力してディレクトリーをメイン・ソース・コード・ディレクトリーに変更します ( 図 4C を参照)。
      CD「nuclei_counter」
    8. 次のコマンド ラインで、以下のコマンド ラインを入力します。Python の後の番号を、3 以外のバージョンを使用している場合は正しいバージョン番号に置き換えてください。次に、 Enter キーを押します ( 図 4C を参照)。
      python3 count_nuclei.py --img_dir "path/to/images" --output_dir " path/to/output" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      ここで、path/to/images は、分析する画像を含むフォルダへのファイルパスです (ステップ 1.14)。path/to/output は、.csvファイルを保存するフォルダへのファイルパスです (指定されていない場合は、デフォルトで現在の作業ディレクトリになります)。results.csv は、結果のカウントが保存されるファイル名です (指定しない場合、出力ファイル名はデフォルトで count_results.csv になります)。
      注: コマンドラインには引用符が必要です。ファイルパスの前に引用符の後にスペースがないことを確認してください。Pythonスクリプトは、指定されたファイルパス内のファイルを読み取り、ディレクトリ内のすべての画像に対して核カウンティングプログラムを実行します( 図4Cを参照)。結果のカウントは、指定した場所の結果.csvファイルに保存されます。
    9. 次のコマンド行が表示されたら、処理は完了しています ( 図 4C を参照)。これで、等高線と結果スプレッドシートが、手順 3.4.8 で出力ディレクトリとして指定した場所 (つまり、path/to/output) で使用できるようになりました。
  2. 等高線を目視検査して、カウントの品質を確認します。結果は、セクション 4 で説明されているように、データの正規化に使用できるようになりました。
    注:等高線が核を見逃しているように見える場合(例:核が薄すぎるように見える)、または核のグループが1つのアイテムにクラスター化されている場合(例:露出オーバーの画像、背景が多すぎる、アーティファクト)、ユーザーは 表1 を参照する必要があり、セクション4に進む前に、画像取得を最適化するためにセクション1に戻る必要がある場合があります。

figure-protocol-4
図 4: Mac OS を使用したセクション 3 のワークフローの主要部分の例。 コードをダウンロードした後( 図3Aを参照)、(A) Zip をクリックして抽出します file (青で表示)そして目的の目的地を設定します。(B)ターミナルを開いた後、手順3.4.4(ディレクトリをコードリポジトリに変更)および3.4.5(pipのインストール)のコマンドの例。(C) ステップ 3.4.7 と 3.4.8 のコマンド、ステップ 3.4.8 の実行後のプログレスバー、ステップ 3.4.9 の完了を示すコマンドラインの例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 実験データを正規化するためのカウントの使用

  1. 自動プログラムを使用して決定された核定量化で各画像をリンクするresults.csvファイルを開きます。
  2. 正規化の方法を決定します:1)画像ごとに(例:マルチカラー蛍光顕微鏡の場合)、2)サンプルあたりの平均核数と参照サンプル(または条件)の比率としてデータを正規化し、3)サンプルあたりの核数に正規化します(例:サンプル面積に全核数を外挿します)。正規化の方法に関する推奨事項は、「ディスカッション」セクションにあります。
    1. 正規化を画像ごとに行う場合は、各画像の実験データをその画像の核数で割るだけです。
    2. データを比率として正規化するには、以下で説明する手順に従います。
      1. 1回の複製で複数の画像が収集されたサンプル(例:6ウェルプレートの1つのウェルから10〜15枚の画像を取得)については、画像あたりの平均核数を計算します。これらの核数は、単核細胞または多核細胞(筋管など)で融合した多数の細胞を想定した細胞数と見なされます。
      2. 参照サンプルまたは参照条件(例:コントロール条件のすべてのサンプルの平均カウント)を選択し、カウントをメモします。
      3. すべてのサンプルのカウントをその参照カウントで除算し、正規化値を求めます。参照サンプルを使用した場合は、参照サンプルの正規化値を 1 として使用します。
        注: 参照条件を使用した場合、条件全体の平均正規化値は 1 になります。参照よりも核数が少ない(つまり、密度が低い)サンプルは、正規化値が1未満になり、参照よりも核が多い(つまり、密度が高い)サンプルは、正規化値が1より大きくなります。
      4. 各ウェルの実験データを、対応する計算された正規化値で除算します。
    3. サンプルあたりの核数にデータを正規化するには、以下で説明する手順に従います。
      1. 1回の複製で複数の画像が収集されたサンプル(例:6ウェルプレートの1つのウェルから10〜15枚の画像を取得)については、画像あたりの平均核数を計算します。これらの核数は、単核細胞、または多核細胞(筋管など)で融合した細胞の数を想定した細胞数と見なされます。
      2. データの派生元であるスライド(カバースリップ)、ウェル、またはディッシュの表面積を特定します。この情報は、製品 Web サイトの仕様セクションに記載されています。
      3. キャプチャされた各画像の領域を決定します。この情報は、多くの場合、イメージングソフトウェアまたは解析ソフトウェアでメタデータとして利用できます。
      4. サンプルの表面積と画像領域が同じ単位(mm2など)で表されていることを確認してください。そうでない場合は、目的の単位に変換します。
      5. 次の式を使用して、各サンプルの合計カウントを計算します。
        TC = AC • (SA/IA)
        ここで、TC は総カウント、AC は平均カウント、SA は表面積、IA は画像領域です。
      6. 実験データをサンプルの対応するTCで除算します。
  3. 実験データを正規化し、必要に応じて統計解析に利用します。

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結果

各バッチ画像実行では、1)同定された核の輪郭を示す輪郭が適用された画像ファイルのセット(図5)、および2)画像ファイル名と関連するカウントをリンクする.csvファイル(スプレッドシート)が生成されます。等高線を表示すると、ユーザーはカウント品質を視覚的に評価できます。具体的には、セクション 1 に従って取得された画像には、すべての (またはほぼすべて) の核が、プログラムによって原子核がカウントされたことを示す緑色の実線で囲まれている必要があります。これらの等高線は、ここでプログラムを調整するために使用されました。

figure-results-1
図5:元の画像と対応する輪郭の例。 ...

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ディスカッション

当社の核定量化プログラムには、既存のオプションに比べていくつかの利点があります。最小限の技術スキルしか必要とせず、核定量という特定のタスクに対して検証され、オープンソースであること。後者は、コスト関連の障壁を克服します。最終的に、このプログラムは、細胞生物学者や分子生物学者に、蛍光顕微鏡を使用して撮影された画像中の核を迅速かつ正確に定量するための追加オプションを提供します。現在利用可能な自動核または細胞カウントプログラムは、すべてのユーザーに好まれているわけではなく、中には法外な費用がかかるものもあり、特定のアプリケーションでは検証が最小限であるか、または存在しない可能性があります。BioTek Cytationラインなどの専用機器には、核染色20を使用したin situ細胞カウントの検証を行う技術情報のほか、さまざまな追加アプリケーションが付属しています。バリデーションデータが存在し、Cytation製品ラインは広く使用されていますが、特にSeahorse Extracellular Flux Analyzersとインタ...

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開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究の資金は、国立衛生研究所/国立老化研究所(R01AG084597;DELおよびHYL)とテキサス工科大学(DEL)からのスタートアップファンドによる。著者は、この研究に貢献した学部研究者(REH、MRD、CJM、AKW)に財政的支援を提供してくれたテキサス工科大学の学部研究員とTrUE奨学生プログラムに感謝します。また、Lauren S. Gollahon博士とMichael P. Massett博士には、研究室のスペースと機器を快く共有していただいたことに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
方法 2 または 3 の結果ファイルにアクセスできるコンピューター-手順 2.6 (方法 2 の場合) または手順 3.3.9 または 3.4.9 (方法 3 の場合) を参照してくださいインターネット
にアクセスできるコンピューター、最新のブラウザ(Google Chrome など)
最新のブラウザー、Windows OS異なりますMac、Linux、またはその他の OS の場合は、方法 3
キャプチャ用のソフトウェアを備えたコンピューターを使用しますZeissAxioVisionその他のソフトウェアは許容されます。蛍光顕微鏡と互換性がある必要があります
出力用のファイルの場所(結果スプレッドシートと画像の輪郭)--新しい空のフォルダにすることができます
光顕微鏡ZeissAxiovert 200Mその他の蛍光顕微鏡は許容されます。適切なフィルターキューブ、目的の対物レンズ、およびカメラを装備する必要があります 。
定量化するすべての画像を含むフォルダ-ステップ 1.12 を参照
Python バージョン 3.10 以降-https://www.python.org/downloads/  で無料でダウンロードおよびインストールできます。
イメージングするサンプル--固定または生き、染色または蛍光DNA色素で対比
シートソフトウェアMicrosoftExcel同様のスプレッドシートソフトウェアも受け入れられます
ー インターネットにアクセスできるコンピューター、 は 画像蛍 Python 染色 スプレッド

参考文献

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