蛍光によるFEN1ヌクレアーゼ活性の検出と低分子阻害剤のスクリーニング

サマリー

このプロトコルは、FEN1(皮弁エンドヌクレアーゼ1)活性および阻害剤開発を測定するためのゲルシフト生化学的アッセイを説明しています。

要約

FEN1(皮弁エンドヌクレアーゼ1)は、DNAの複製と損傷修復に関与する重要なDNAヌクレアーゼであり、ゲノムの安定性を維持する上で重要な役割を果たしています。FEN1活性の上昇は、さまざまながんの発症と密接に関連しているため、FEN1は肺がん、乳がん、前立腺がんのバイオマーカーおよび薬剤標的として認識されています。従来の放射性同位元素標識法によるFEN1ヌクレアーゼ活性の検出には、利便性と安全性の面で課題がありました。本研究では、フラップ構造を有するDNA断片基質を in vitroで合成しました。この基質は、フラップの5'末端に蛍光色素で標識されており、FEN1ヌクレアーゼが指定された部位を特異的に認識して切断することができます。次に、ゲル電気泳動後の蛍光色素シグナルを検出することにより、FEN1活性を決定しました。この方法により、FEN1ヌクレアーゼ活性の迅速かつ効果的な評価と、その阻害剤のスクリーニングが可能になります。FEN1活性を解析し、低分子阻害剤の有効性を評価するための高感度かつ特異的なアプローチを提供します。さらに、DNA損傷修復やがん発生の研究にも大きく貢献しており、疾患メカニズムの臨床研究や遺伝毒性物質の検出に新たな戦略を提供します。

概要

DNA複製は必ずしも完璧ではなく、内部要因と外部要因の両方によって中断される可能性があります。したがって、DNA複製と損傷修復のメカニズムは、細胞の生存とゲノムの安定性に不可欠です。この過程では、コアDNAヌクレアーゼであるヒト分岐構造特異的エンドヌクレアーゼFEN1(Flap Endonuclease 1)が重要な役割を果たしています^1,2,3。

FEN1は主にDNA複製に関与しており、遅行鎖^4,5上の岡崎フラグメントの成熟に不可欠です。これにより、DNA複製の効率的な進行と損傷したDNAの正確な修復が保証されます。しかし、FEN1レベルの異常な増加は、肺がんや乳がん⁷などのさまざまながん^6,7の発症と密接に関連しています。このように、FEN1はDNAの複製や修復に必須であるだけでなく、がん診断のバイオマーカーや治療標的としても大きな注目を集めています^8,9。FEN1活性の検出は、がんの早期診断や標的療法の研究を進めるために不可欠です。

FEN1の重要性と、がんの早期診断や標的療法の開発のためにFEN1の活性を研究する必要性を考えると、この実験で開発された方法の主な目標は、FEN1ヌクレアーゼ活性を正確かつ効率的に測定することでした。この方法は、FEN1を標的とする低分子阻害剤をスクリーニングするための信頼性の高いプラットフォームを提供することを目的としています。これらの目標を達成することにより、この研究は、がんにおけるFEN1の役割の理解を深め、新しい治療戦略の発見を促進することに貢献することを目指しています。

FEN1ヌクレアーゼ活性を検出するための技術は数多く存在し、それぞれに異なる特性、原理、利点、制限、および適用可能なシナリオがあります。例えば、ゲル電気泳動法やHPLCベースの基質分離法は、直感的な結果が得られますが、煩雑な手順と低スループットを伴います^10,11。蛍光偏光(FP)アッセイは、化合物の自家蛍光や光散乱による干渉により、FPシグナルに影響を与えるFEN1活性の評価に課題があります。カウンタースクリーニング戦略では偽陽性を部分的に排除することができますが、主要な活性化合物の約15%は、技術的な干渉により依然として誤認されています¹²。蛍光ドナー/クエンチャーペア(TAMRA/BHQ-2など)とAlphaScreen化学発光を併用すると、複雑なトリプルフラップ蛍光基質の合成コストが高く、特に大規模なスクリーニングでの有用性が制限されるなどの欠点があります。さらに、基質のデュアルフラップ構造は、FEN1との最適な結合を妨げ、酵素的切断効率を低下させ、検出感度を低下させる可能性があります。さらに、このアプローチは特殊な機器(ViewLux、EnVisionなど)に大きく依存しているため、リソースが限られているラボでの採用が制限されています13,14,15。銀ナノクラスター(DNA-AgNC)で機能化されたデュアルフラップダンベル形状DNAナノプローブに基づく蛍光検出法は、精密なアニーリングとin situ核生成ステップに依存するため、バッチ間のばらつきに悩まされ、再現性とスケーラビリティが妨げられます。高コストと長い手続きは、その実用化をさらに制限します¹⁶。

この記事では、現在の技術的制限に対処し、FEN1活性を研究するためのより安全でユーザーがアクセス可能な方法に対する高まる需要を満たすために、蛍光標識ベースのアッセイを開発します。この技術は、蛍光検出の特異性と高感度、およびFEN1によって認識および切断できる定義された構造を持つDNA基質を設計する能力を利用しています(図1)。この方法は、FEN1ヌクレアーゼ活性の評価において高い精度を維持しながら、実験手順を合理化します。従来のゲル電気泳動やHPLCベースの技術と比較して、操作が簡素化され、ターンアラウンドが短縮されます。蛍光偏光アッセイとは異なり、このアプローチでは化合物の迅速な定性スクリーニングが可能になり、予備的な酵素評価のための効率的な戦略が確立されます。

この方法は、放射性物質へのアクセスが制限されている実験室環境でのFEN1ヌクレアーゼ活性の研究に適しています。また、特に高い感度と特異性が必要な場合に、比較的短時間で多数の低分子阻害剤をスクリーニングするのにも適しています。しかし、非常に高い精度で絶対定量が必要な研究や、基本的な蛍光検出装置や蛍光シグナル解析の専門知識が不足している研究室には適していません。 in vivo アプリケーションに焦点を当てた研究では、FEN1の挙動が現在の in vitro アッセイデザインでは再現されない複雑な生物学的要因によって影響を受ける可能性があるため、さらなる改良または代替方法が必要になる場合があります。

この蛍光アッセイは、高感度で特異性が高く、FEN1活性の研究とその阻害剤の開発に安全で便利で効果的なツールを提供します。

プロトコル

この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. FEN1タンパク質発現精製

1. タンパク質精製
   1. ターゲットプラスミドを含む細菌ストック( 材料表を参照)を-80°Cから取り出します。 室温で解凍し、凍結した1.5 mL微量遠心チューブから200 μLを、200 μLピペットチップを使用して、50 μg/mLカナマイシンを含む20 mL LB培地に接種します。
      注:菌株は 大腸菌 BL21(DE3)-FEN1です。
   2. 37°Cでインキュベートし、160rpmで12時間振とうします。
   3. 細菌懸濁液を、50μg/mLカナマイシンを添加したLB培地を含む200mLの三角フラスコに移します。.160rpmで2〜3時間振とうしながら、37°Cでインキュベーションを続けます。
   4. 培養物のOD₆₀₀ が約0.6に達したら、IPTGを2 mL(最終濃度:1 mM)に加えます。25°C、160rpmで10時間インキュベーションを続けます。
   5. 誘導した培養物を、あらかじめ秤量した50 mLの遠心チューブに移します。4°Cおよび2500 × g で15分間遠心分離します。上清を捨てます。ペレットを含むチューブの重量を量り、空のチューブの重量を差し引いて、ペレットの質量を計算します。
   6. 湿った細胞ペレット1グラムあたり7 mLの溶解バッファーを添加します。ピペットを使用して、ピペッティングを上下にすることでペレットを完全に再懸濁します。
      注:溶解バッファー(合計10 mL)には、20 mMのTris-HCl、250 mMのNaCl、2% Triton X-100、およびddH₂Oが含まれています。
   7. 溶解バッファー中の細菌懸濁液を-80°Cの冷凍庫に移し、一晩凍結します。翌日、懸濁液を4°Cのシェーカーで1時間解凍し、溶解効率を高めます。
   8. 超音波を使用して75%の電力で45分間細胞を溶解します。ライセートを12,000 × g で4°Cで20分間遠心分離し、上清をペレットから分離します。
      注:ライセートが濁ったままの場合は、溶解バッファーの容量を増やすか、凍結融解サイクルを繰り返します。ヌクレアーゼ阻害剤を添加して、タンパク質の完全性を維持し、分解を防ぐこともできます。
   9. 清澄化した上清を、調製したタンパク質精製樹脂が入ったチューブの壁に沿って塗布します。10 mLの溶出バッファーで洗浄し、非特異的に結合したタンパク質を除去します。
      注:溶出バッファーには、20 mMのTris-HCl(pH 7.5)、250 mMのNaCl、2%Triton X-100、200 mMのイミダゾール、および蒸留水が含まれています。
   10. チューブの内壁に沿って5 mLの溶出バッファーを添加して、FEN1タンパク質を溶出します。
2. 迅速なクマシーブリリアントブルー染色による標的タンパク質の同定
   1. FEN1の予想サイズに応じて、12%セパレーティングゲルと5%スタッキングゲルを使用してSDS-PAGEゲルを調製します。
   2. 標的タンパク質サンプルとBSA標準試料を5×サンプルバッファーと1:4の比率で混合します。混合物を95°Cで5分間加熱して、タンパク質を完全に変性させます。
   3. BSA標準試料と変性タンパク質サンプルをそれぞれ20 μLずつSDS-PAGEゲルの別々のウェルにロードします。
   4. 電気泳動装置を接続します。電圧を90Vに設定し、1時間40分運転します。
   5. 電気泳動後、ゲルを染色容器に移します。脱イオン水ですすぎ、タンパク質染色液30 mLを加えて25分間染色します。染色液を回収し、ゲルを20mLの脱イオン水ですすぎ、水平シェーカーで一晩脱色します。
   6. 脱色後、透明なプラスチックプレートにゲルを載せ、白色光の下でタンパク質バンドを観察します。
      注:バンドがかすかに見える場合、またはタンパク質濃度が低い場合は、限外ろ過チューブを使用してサンプルを濃縮します。このステップにより、余分な溶媒と低分子が除去され、タンパク質濃度が向上し、その後の実験で正確な分析が保証されます。

2. FEN1 TAMRA標識DNA基質調製

1. TAMRA標識DNA基質調製
   1. FEN1の特異的切断活性に基づいてDNAオリゴヌクレオチド鎖を設計します(公開された方法¹⁷（ 表1を参照）を参照)。D1配列の5'末端は、蛍光TAMRA標識で修飾されます。
   2. 混合一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを10 μLのアニーリングバッファーに添加します:5 μLのD1(10 pmol/μL)、10 μLのT1(10 pmol/μL)、および7.5 μLのU2(10 pmol/μL)。脱イオン水を加えて、総容量を50μLにします。
      注:アニーリングバッファーには、100 mMのTris-HCl(pH 7.5)と10 mMのMgCl₂が含まれています。
   3. 反応混合物を金属浴中で100°Cで1分間加熱し、その後すぐに72°Cで10分間¹⁸に移します。
      注:最終的なDNA基質の長さは80ヌクレオチドです。高い初期温度(100°C)は変性を確実にし、アニール温度(72°C)は正確なストランドのペアリングを促進します。
   4. 熱源をオフにし、溶液を室温まで徐々に冷却して、完全な二本鎖DNA基質を形成します。
2. TAMRA標識DNA基質アッセイ
   1. 4.8 mL の 30% アクリルアミド (29:1)、4.32 mL の 6 M 尿素、2.4 mL の 5× TBE、50 μL の 10% APS、5 μL の TEMED、および 0.48 mL の脱イオン水を混合して、12% 変性ポリアクリルアミドゲルを調製します。よく混ぜてゲルを調製します。
   2. ゲルを37°Cのオーブンに30分間入れて固めます。
   3. 検出には、合成したDNA基質2 μLを蒸留水18 μLにピペットで移し、7.7 μLのStop Bufferを添加します。
   4. 参考までに、2 μL の TAMRA 標識 D1 を 18 μL の蒸留水にピペットで移し、7.7 μL の Stop Buffer を添加します。
   5. 調製した各サンプル20μLをゲルにロードし、SDS-PAGE電気泳動を行ってDNA基質形成を解析します。

3. FEN1ヌクレアーゼ活性アッセイ

1. FEN1酵素活性アッセイ
   1. 反応バッファー中に2 μLのDNA基質とFEN1ヌクレアーゼを組み合わせ、20 μLの反応混合物を調製します。
      注:反応バッファーは、100 mMのTris-HCl(pH 7.5)、200 mMのMgCl₂、2 mMのDTT、0.2 mg/mL BSA、および脱イオン水で構成されています。
   2. 反応混合物を37°Cの金属浴で15分間インキュベートします。
   3. 20 μLの2×ターミネーションバッファーを加えて反応を終了します。
   4. 反応したサンプル20 μLを、あらかじめ調製した12%変性ポリアクリルアミドゲルにロードし、100 Vで60分間電気泳動を行います。
   5. 電気泳動後、蛍光イメージングシステム(600経路)を使用して結果を視覚化します。

4. FEN1ヌクレアーゼの低分子阻害剤のスクリーニング

1. 低分子阻害剤のスクリーニング
   1. ピペットを使用して、2 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
   2. 2 μL の FEN1 ヌクレアーゼと 10 μL の 2× 反応バッファーをチューブに加えます。
   3. 十分に混合し、氷上で10分間インキュベートします。
   4. 2 μLのDNA基質と4 μLの脱イオン水を加え、十分に混合して総反応量を20 μLにします。
   5. DMSO中の1 Mストック溶液を2倍段階希釈して、FEN1ヌクレアーゼ阻害剤であるFEN1-IN-4の希釈液を調製します。
   6. 2 μL の FEN1 ヌクレアーゼ (0.03 μg/μL) と希釈した FEN1-IN-4 阻害剤 2 μL を新しい 1.5 mL 微量遠心チューブにピペットで移します。2×反応バッファー10μLと脱イオン水4μLを添加します。穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートして、阻害剤と酵素との間の十分な相互作用を確保します。
   7. 2 μL の DNA 基質をチューブに添加して、最終的な 20 μL の反応混合物を形成します。
   8. 反応液を37°Cの金属浴で15分間インキュベートします。
   9. 20 μLの2×ターミネーションバッファーを加えて反応を終了します。

5. FEN1--IN-4低分子阻害剤の阻害力評価

1. マイクロピペットを使用して10 μLの2×反応バッファーを取り込み、1.5 mLの微量遠心チューブに加えます。
2. 0.03 μg/μLの濃度で2 μLのFEN1ヌクレアーゼと、異なる濃度のFEN1阻害剤FEN1-IN-4 2 μLを添加します。
   注:実験要件に応じて、複数の濃度勾配を確立する必要があります。
3. 4 μLの脱イオン水を加え、溶液を完全に混合します。1.5 mLの微量遠心チューブを氷上に置き、10分間インキュベートします。
4. 2 μL の二本鎖 DNA 基質をチューブに添加して、20 μL の反応システムを形成します。
5. EPチューブを37°Cの金属浴に15分間入れます。
6. 反応終了後、反応混合物に20μLの2×ストップバッファーを加えて反応を終了します。
7. 蛍光イメージングデバイスを使用して結果を観察し、_IC50曲線¹⁹をプロットする。
   注:蛍光強度の定量化は、Fiji/ImageJ²⁰を用いて行い、続いて、統計分析およびグラフ作成および分析ソフトウェア²¹による可視化を行った。

結果

図2Aに示すように、染色試薬はタンパク質に結合するため、タンパク質はゲル上に青色のバンドとして現れます。最初のレーンには、分子量基準として使用される標識タンパク質が含まれており、BSA標準タンパク質バンドは70 kDaの分子量に対応し、FEN1核酸タンパク質バンドは45 kDaの分子量に対応します。実験結果から、FEN1ヌクレアーゼは約45 kDaのところに明確なバンドとして現れ、誘導されたタンパク質発現の精製に成功したことが示されました。

図2Bに示すように、レーン2のD1は、バンドサイズが59 kDaのフルオレセイン標識一本鎖DNA基質を表しています。レーン 3 の SF は、バンド サイズが 80 kDa の合成フルオレセイン標識二本鎖基質です。レーン2と比較すると、結果はフルオレセイン標識二本鎖DNA基質の合成が成功したことを示しています。

図2C

ディスカッション

FEN1ヌクレアーゼ活性アッセイと低分子阻害剤スクリーニングは、DNA損傷修復とがん発生に関する研究の中心です。従来の放射性標識技術と比較して、現在の方法は、費用対効果が高く、効率的で、操作が簡単で、より安全な代替手段を提供します。さらに、蛍光バーストベースのFEN1アッセイとは異なり、このアプローチでは基質の切断をより直感的に視覚化できるため、酵素活性をより正確に評価でき、関連研究のためのより信頼性の高いプラットフォームが提供されます¹⁴。

結果の信頼性と再現性を確保するためには、いくつかの重要なステップが重要です。まず、原核生物発現系(E. coli BL21)を使用して組換えFEN1タンパク質を産生し、酵素アッセイのための大規模なタンパク質生産を可能にしました。N末端Hisタグでタグ付けされたタンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、イミダゾールで溶出しました。タンパク質の純度と同一性は、

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 M トリス-HCL	ビヨタイム	ST774
30% Acr-Bis (29:1)	ビヨタイム	ST003-500ミリリットル
5M Nacl	ビヨタイム	ST347
ビーヨブループラス	ビヨタイム	P0003S
BL21(DE3)-FEN1	ヴァザイム	C504-F1
BSAの	ビヨタイム	P0007
脱色シェーカー	キリンベル	TS-100
DL-ジチオスレイトール	ビヨタイム	ST041
ドライバスインキュベーター	瑞城	DH200
電気泳動装置	北京 Liuyi Biotechnology	DDY-6D
FEN1-IN-4	ターゲット商船三井	T8545
IPTGの	高葉	9030
カナマイシンスルフェート	バイオシャープ	BS152
研究室用遠心分離機	熱	SL16R型
LBブロス	ソーラービオ	L8291
Ni-NTA His Bind 樹脂	7SEバイオテック	PANF001-001C
オデッセイFC	オデッセイ	LI-COR
SDS-ページ	ビヨタイム	P0015L
トリション-x-100	シュユアンイェ	S15022