このプロトコルは、FEN1(皮弁エンドヌクレアーゼ1)活性および阻害剤開発を測定するためのゲルシフト生化学的アッセイを説明しています。
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方法論記事
蛍光によるFEN1ヌクレアーゼ活性の検出と低分子阻害剤のスクリーニング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
FEN1(皮弁エンドヌクレアーゼ1)は、DNAの複製と損傷修復に関与する重要なDNAヌクレアーゼであり、ゲノムの安定性を維持する上で重要な役割を果たしています。FEN1活性の上昇は、さまざまながんの発症と密接に関連しているため、FEN1は肺がん、乳がん、前立腺がんのバイオマーカーおよび薬剤標的として認識されています。従来の放射性同位元素標識法によるFEN1ヌクレアーゼ活性の検出には、利便性と安全性の面で課題がありました。本研究では、フラップ構造を有するDNA断片基質を in vitroで合成しました。この基質は、フラップの5'末端に蛍光色素で標識されており、FEN1ヌクレアーゼが指定された部位を特異的に認識して切断することができます。次に、ゲル電気泳動後の蛍光色素シグナルを検出することにより、FEN1活性を決定しました。この方法により、FEN1ヌクレアーゼ活性の迅速かつ効果的な評価と、その阻害剤のスクリーニングが可能になります。FEN1活性を解析し、低分子阻害剤の有効性を評価するための高感度かつ特異的なアプローチを提供します。さらに、DNA損傷修復やがん発生の研究にも大きく貢献しており、疾患メカニズムの臨床研究や遺伝毒性物質の検出に新たな戦略を提供します。
概要
DNA複製は必ずしも完璧ではなく、内部要因と外部要因の両方によって中断される可能性があります。したがって、DNA複製と損傷修復のメカニズムは、細胞の生存とゲノムの安定性に不可欠です。この過程では、コアDNAヌクレアーゼであるヒト分岐構造特異的エンドヌクレアーゼFEN1(Flap Endonuclease 1)が重要な役割を果たしています1,2,3。
FEN1は主にDNA複製に関与しており、遅行鎖4,5上の岡崎フラグメントの成熟に不可欠です。これにより、DNA複製の効率的な進行と損傷したDNAの正確な修復が保証されます。しかし、FEN1レベルの異常な増加は、肺がんや乳がん7などのさまざまながん6,7の発症と密接に関連しています。このように、FEN1はDNAの複製や修復に必須であるだけでなく、がん診断のバイオマーカーや治療標的としても大きな注目を集め....
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プロトコル
この研究で使用した試薬と機器は、 材料表に記載されています。
1. FEN1タンパク質発現精製
- タンパク質精製
- ターゲットプラスミドを含む細菌ストック( 材料表を参照)を-80°Cから取り出します。 室温で解凍し、凍結した1.5 mL微量遠心チューブから200 μLを、200 μLピペットチップを使用して、50 μg/mLカナマイシンを含む20 mL LB培地に接種します。
注:菌株は 大腸菌 BL21(DE3)-FEN1です。 - 37°Cでインキュベートし、160rpmで12時間振とうします。
- 細菌懸濁液を、50μg/mLカナマイシンを添加したLB培地を含む200mLの三角フラスコに移します。.160rpmで2〜3時間振とうしながら、37°Cでインキュベーションを続けます。
- 培養物のOD600 が約0.6に達したら、IPTGを2 mL(最終濃度:1 mM)に加えます。25°C、160rpmで10時間インキュベーションを続けます。
- 誘導した培養物を、あらかじめ秤量した50 mLの遠心チューブに移します。4°Cおよび2500 × ....
- ターゲットプラスミドを含む細菌ストック( 材料表を参照)を-80°Cから取り出します。 室温で解凍し、凍結した1.5 mL微量遠心チューブから200 μLを、200 μLピペットチップを使用して、50 μg/mLカナマイシンを含む20 mL LB培地に接種します。
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結果
図2Aに示すように、染色試薬はタンパク質に結合するため、タンパク質はゲル上に青色のバンドとして現れます。最初のレーンには、分子量基準として使用される標識タンパク質が含まれており、BSA標準タンパク質バンドは70 kDaの分子量に対応し、FEN1核酸タンパク質バンドは45 kDaの分子量に対応します。実験結果から、FEN1ヌクレアーゼは約45 kDaのところに明確なバンドとして現れ、誘導されたタンパク質発現の精製に成功したことが示されました。
図2Bに示すように、レーン2のD1は、バンドサイズが59 kDaのフルオレセイン標識一本鎖DNA基質を表しています。レーン 3 の SF は、バンド サイズが 80 kDa の合成フルオレセイン標識二本鎖基質です。レーン2と比較すると、結果はフルオレセイン標識二本鎖DNA基質の合成が成功したことを示しています。
図2C
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ディスカッション
FEN1ヌクレアーゼ活性アッセイと低分子阻害剤スクリーニングは、DNA損傷修復とがん発生に関する研究の中心です。従来の放射性標識技術と比較して、現在の方法は、費用対効果が高く、効率的で、操作が簡単で、より安全な代替手段を提供します。さらに、蛍光バーストベースのFEN1アッセイとは異なり、このアプローチでは基質の切断をより直感的に視覚化できるため、酵素活性をより正確に評価でき、関連研究のためのより信頼性の高いプラットフォームが提供されます14。
結果の信頼性と再現性を確保するためには、いくつかの重要なステップが重要です。まず、原核生物発現系(E. coli BL21)を使用して組換えFEN1タンパク質を産生し、酵素アッセイのための大規模なタンパク質生産を可能にしました。N末端Hisタグでタグ付けされたタンパク質をニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、イミダゾールで溶出しました。タンパク質の純度と同一性は、
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開示事項
著者には、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、江蘇省高等教育機関科学技術革新研究チーム(2021年)、江蘇職業大学工学技術研究センタープログラム(2023年)、蘇州人民生活技術プロジェクトの主要技術プログラム(SYWD2024099)、蘇州大学放射線医学および防護国家重点研究所プロジェクト(GZK12023013)、蘇州職業健康大学のプログラム(SZWZYTD202201年、 SZWZYTD202205)、中国江蘇省の清蘭プロジェクト(2021年、2022年)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1 M トリス-HCL | ビヨタイム | ST774 | |
| 30% Acr-Bis (29:1) | ビヨタイム | ST003-500ミリリットル | |
| 5M Nacl | ビヨタイム | ST347 | |
| ビーヨブループラス | ビヨタイム | P0003S | |
| BL21(DE3)-FEN1 | ヴァザイム | C504-F1 | |
| BSAの | ビヨタイム | P0007 | |
| 脱色シェーカー | キリンベル | TS-100 | |
| DL-ジチオスレイトール | ビヨタイム | ST041 | |
| ドライバスインキュベーター | 瑞城 | DH200 | |
| 電気泳動装置 | 北京 Liuyi Biotechnology | DDY-6D | |
| FEN1-IN-4 | ターゲット商船三井 | T8545 | |
| IPTGの | 高葉 | 9030 | |
| カナマイシンスルフェート | バイオシャープ | BS152 | |
| 研究室用遠心分離機 | 熱 | SL16R型 | |
| LBブロス | ソーラービオ | L8291 | |
| Ni-NTA His Bind 樹脂 | 7SEバイオテック | PANF001-001C | |
| オデッセイFC | オデッセイ | LI-COR | |
| SDS-ページ | ビヨタイム | P0015L | |
| トリション-x-100 | シュユアンイェ | S15022 |
参考文献
- Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
- Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Viro....
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再版と許可
