手動IBEX法による低コストで汎用性の高い光照射技術の実装により、有意な天然自家蛍光でヒト組織の最適なイメージングが可能になります。このプロトコルでは、倒立顕微鏡、広く利用可能な試薬、および画像のアライメントと処理のためのオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからマルチプレックス化されたホールスライド画像を取得する方法を詳しく説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
非結核性抗酸菌(NTM)による肺疾患の有病率は、世界的に増加しています。NTM誘発性肺疾患は、気管支拡張症、肺結節、空洞疾患を呈することが多いですが、これらの明確な肺損傷パターンに関連する宿主反応は、 その場で十分に特徴付けられていません。私たちは、NTM症患者の肺組織中の免疫細胞集団の詳細な表現型解析を行うことにより、肉芽腫性炎症、結核性肺疾患のゴールドスタンダードと比較することにより、NTM誘発性の病態を評価することを目指しました。
播種性NTM、肺NTM、または肺結核疾患の患者から採取したホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)肺ブロックを、反復漂白拡張マルチプレキシティ(IBEX)イメージング法の修正版に従って切片化し、染色しました。IBEX法の最適化は、FFPEの保存とFFPEブロックの年齢によって悪化する肺組織固有のコラーゲン、エラスチン、赤血球の高密度による肺切片の有意な内因性蛍光に対処するために最初に必要でした。このプロトコルでは、臨床的にアーカイブされたサンプルの自家蛍光を低減する光照射プロトコルと改変抗原賦活化法について詳しく説明します。
さらに、交差反応性、光照射後のエピトープ損失、隣接する蛍光色素間のスペクトルオーバーラップ、特定のターゲットの低S/N比などの一般的な課題を含む、抗体パネル設計に関するガイダンスを提供します。肺組織切片の効率的なイメージングを容易にするために、スライドは広視野顕微鏡で画像化され、オープンソースソフトウェアで後処理されて画像品質が向上しました。このワークフローは、広く利用可能な機器や試薬を使用して、困難なサンプルから高度に多重化された高解像度の全スライド画像を取得する方法を文書化することにより、重要なニーズに対応します。臨床サンプルの定量的イメージングにとどまらず、これらの手法は多様なサンプルタイプに適用でき、内因性および外因性の蛍光源を克服することができます。
概要
結核(TB)は主要な死因の1つであり、毎年約130万人が結核感染症で亡くなっています1。結核ほど致死的ではありませんが、近年、非結核性抗酸菌(NTM)によって引き起こされる肺感染症とその後の疾患が大幅に増加しています2。組織レベルでは、肺 結核菌 (Mtb)感染に対する宿主の免疫応答は十分に研究されており、肉芽腫、リンパ球の不均一な凝集体、樹状細胞、マクロファージ、および好中球の形成が含まれます3。肉芽腫性炎症は、NTM感染に対する宿主免疫の基本的な特徴でもありますが、免疫細胞集団とこの応答の空間的特性については、まだ十分に研究されていません。免疫病理学と創傷治癒の組織成分を詳細に理解することは、治療法(例:宿主指向療法)および予防的(すなわちワクチン)治療戦略の開発にとって重要です。
この研究では、私たちのチームは、MtbまたはNTM感染患者の肺切除または剖検中に取得した希少なアーカイブ臨床サンプルにアクセスできました。これらのサンプルの大部分は10年以上前のもので、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルとして保存されていたため、組織学的アッセイでの使用に限定されていました。従来の免疫組織化学(IHC)および免疫蛍光(IF)イメージングのマーカーの限界を克服するために、オープンソースの高度に多重化されたイメージング法である反復漂白拡張マルチプレXity(IBEX)法を利用しました4,5。IBEX法をヒト肺FFPEサンプルに拡張するには、高レベルの内因性蛍光のために大幅な最適化が必要であり、これはマルチプレックス抗体ベースのイメージングの障害としてよく説明されています6。
ここでは、肺FFPE組織切片7,8に最適化された光照射法を使用して自家蛍光を低減するための詳細なプロトコルを提供します。重要なことは、ここで説明する方法は、安価で広く利用可能なライトボックスを利用しており、これを高い自家蛍光を持つ他のサンプル調製物に拡張できることです。画像取得前に自家蛍光を低減するだけでなく、低存在量マーカーと明るい蛍光色素標識の組み合わせ、光照射が抗体標識に与える影響の評価、内因性蛍光の高いチャネルでの二次抗体による増幅など、抗体パネル設計に関するガイダンスを提供します。平均して、1つの組織切片に対応する5枚のスライドを加工し、それぞれが37〜114mm2の範囲でした。最後に、広視野装置を使用して全体のスライド画像を取得する方法を示します。要約すると、このプロトコルでは、アーカイブされた臨床サンプルへのIBEXの採用について説明し、さらに、高自己蛍光サンプルのイメージングで一般的に遭遇する問題のトラブルシューティング方法に関するガイダンスを提供します。
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プロトコル
アーカイブされた剖検および外科的切除肺組織切片は、プロトコル09-H-0172(NCT00943514)「気管支拡張症の自然史」に基づいて、国立衛生研究所臨床センター病理学研究所で収集されました。このプロトコルはIRBによって承認され、参加者はインフォームドコンセントを提供しました。
1. 抗原賦活化の自動化
注:脱パラフィンおよび抗原賦活化は、自動研究染色プラットホームを用いて行いました(図1)。これまでの研究では、クエン酸ベースのpH 6エピトープ賦活化溶液(ER1)で30分、次にEDTAベースのpH 9エピトープ賦活化液(ER2)で30分からなる二重抗原賦活化アプローチが、FFPE組織9に対して最良の免疫標識結果をもたらしたと判断されました。同等の結果は、IBEXイメージングコミュニティ10,11によって提供される他の説明された方法とサポートを使用して、手動脱ロウおよび二重抗原賦活化を使用して取得できます。
- スライドと自動抗原賦活化用品(スライドカバー、研究検出システム、クエン酸ベースのpH 6エピトープ賦活化溶液(ER1)、EDTAベースのpH 9エピトープ賦活化液(ER2)など)を集めます。
- 装置の電源を入れ、20分間初期化し、研究検出アームを装置に配置し、試薬容器を装置の底に挿入します。
- ソフトウェアを開き、[ スライド設定 ]をクリックして[ スタディの追加]を選択し、スタディの新しい名前を作成します。
- [ スライドの追加 ] を選択し、必要に応じてスライドにラベルを付けます。
- このプロトコルに従うには、30分のER1と30分のER2で構成されるHIERプロトコルを使用して、ベークアンドデワックスプロトコルを実行します。
- ラベルを印刷し、スライドの上に置きます。黒いスライドラックを装置から取り外し、目的のスライドをラックに置きます。各スライドに透明なスライドカバーを取り付け、スライドラックを装置に戻し、ラックの下のボタンを押して、スライドのバーコードスキャンを実行するように装置に促します。
- 「play | ok」を選択し、約3時間後に自動抗原検索を開始する。
2. 光照射前の抗体標識
- 抗原賦活化が完了したら、スライドをPBSに浸します。
注:特定のエピトープは光照射に敏感で、LEDに一晩さらされると劣化します。感度の高いエピトープは経験的に決定する必要があり、発見された場合、これらのエピトープの免疫標識はこのステップで行われるべきです。抗原賦活化後、スライドが常に濡れたままであることを確認してください。 - PBSから1つのスライドを取り外し、糸くずの出ないワイプを使用してスライド上の余分なPBSをすべて乾かします。ティッシュに触れないように注意してください。疎水性ペンで組織の周りに境界線を描きます。残りのすべてのスライドについて、このプロセスを繰り返します。疎水性バリアを10分間乾燥させます。
- 各ウェルの底に少量の水を入れて、スライドモイスチャーチャンバーを準備します。スライドをスライドモイスチャーチャンバーに入れます。組織標本に直接触れることなく、PBSを組織から吸い取ります。
- 各スライドに200 μLのブロッキングバッファー(材料表)を加えます。スライドモイスチャーチャンバーを、一定の温度を維持するためのメカニズムを備えた非加熱の科学用マイクロ波に入れます。
- 2-1-2-1-2-1-2-1-2-2-2-2プログラム(「2」は100Wで2分、「1」は0Wで1分)を実行することにより、非特異的抗体の標識をブロックします。上記のプログラムを一度実行してブロッキングします。この装置が利用できない場合は、前述の5に従って、組織切片(5〜10μm)を37°Cで1時間ブロックします。
- ブロッキングバッファーインキュベーション中に一次抗体染色液#1(サイクル1)(材料表)を作成します。抗体ミックスは 、材料表に従って調製します。抗体カクテルを穏やかに混合し、2,680 × g のミニ遠心分離機で抗体ミックスを30秒間スピンダウンします。
注:この染色液には、2サイクル実験の期間中、1:5000に希釈したHoechstが含まれています。ユーザーは、組織やイメージング構成に最適な結果を得るために、Hoechstやその他の抗体を滴定する必要がある場合があります。 - サイクルが完了したら、スライドモイスチャーチャンバーを電子レンジから取り外し、各組織からブロッキング緩衝液を吸い取ります。各スライドに200 μLの一次抗体染色液#1 (Cycle 1) (材料表) を加えます。スライドを取り付けたチャンバーをマイクロ波に戻し、一次抗体プログラムを約30分間実行します:一次抗体の標識のために2-1-2-1-2-1-2-2プログラムを2回実行します。
注:ここでは、一次抗体溶液200μLが目安です。組織切片の表面全体を覆うのに十分な量の溶液を使用してください。. - 一次抗体の標識ステップが完了したら、スライドを垂直に傾け、PBSを組織にピペッティングして、PBSを1,000 μLのPBSで洗浄し、PBSを流し出します。この手順を3〜5回繰り返します。
- 余分なPBSを吸い取り、スライドを1%パラホルムアルデヒド(PFA)で1%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で10分間湿度チャンバー内で固定します。
注:PFA固定はエピトープをマスクし、抗体が意図した標的に結合するのを防ぎます。抗体パネルを初めて作製する場合は、免疫標識前に固定剤の有無にかかわらず処理した組織切片の標識パターンを比較することにより、穏やかな固定(1% PFAで10分間)の影響を評価することをお勧めします。抗体が1% PFA固定に感受性がある場合は、固定後ステップの前にこの抗体を移動させます。 - スライドを1,000μLのPBS 3-5xで広範囲に洗浄します。光照射ステップまでPBSを組織に残します。
3. 組織光照射
- 光照射ボックス(図2)を準備するには、150 W LEDランプ、40 W RGBWフラッドLEDランプ、大型プラスチック容器(20ガロン[75.71 L]容量以上)、新しい1x PBS、およびシャーレを用意します。
- ペトリ皿を150 Wランプの中央に置き、1xPBSを入れます。スライドをPBSに浸すのに十分なボリュームを使用してください。ランプからの発熱を最小限に抑えるために、冷蔵室で光照射プロセスを実行します。
- スライドモイスチャーチャンバーからスライドを取り出し、ペトリ皿に入れて、すべてのスライドがPBSに沈んでいることを確認します。
- 40 W lを置きますamp 光源をスライドに向けて、ペトリ皿の真上に置きます。40 W lを確認してくださいamp 配置する前に 、赤色のライト設定 に設定されています。
- 150 W ランプと 40 W ランプの両方をオンにします。光照射セットアップをプラスチック容器の蓋で覆います。40 W lを維持しますamp 赤色のライト設定に2時間点灯し、残りの16時間、付属のリモコンを介して緑色のライト設定に切り替えます。
注:スライド組織の不要な熱歪みを防ぐために、約4°Cで光照射を行うことが不可欠です。 一時停止ポイント:光照射は一晩中行うことができ、プロトコールは翌朝から再開することができます。
4. 光照射後の抗体標識
- スライドをペトリ皿から取り出し、スライド染色システムのCoplinジャー、50 mLコニカルチューブ、またはバケツの1x PBSに浸します。一次抗体染色液#2(サイクル1)(材料表)を推奨希釈倍率(表1)で調製します。各スライドに200μLの溶液を使用してください。
- 糸くずの出ないワイプで個々のスライドから余分なPBSを吸い取り、ティッシュ自体に触れずにティッシュの周りを乾かします。スライドをスライドモイスチャーチャンバーに入れます。
- 一次抗体染色液#2 (サイクル1) を穏やかにボルテックスし、各スライドに200 μLを加えて、組織全体が覆われるようにします。
- スライドをスライドしたモイスチャーチャンバーを電子レンジに戻し、ステップ2.7で詳述したように、一次抗体プログラムを約30分間実行します
- 一次抗体の標識時には、二次抗体染色液#1(サイクル1)溶液(材料表)を調製します。
- マイクロ波プログラムが完了したら、スライドモイスチャーチャンバーを取り外し、各スライドを1,000μLの1xPBSで3〜5回洗浄します。
- 糸くずの出ないワイプで個々のスライドから余分なPBSを吸い取り、二次抗体染色溶液をボルテックスで抽出し、各スライドに200 μLを加えます。
- スライドモイスチャーチャンバーを電子レンジに置き、二次抗体プログラムを実行します:2-1-2-1-2-1-2-1-2プログラム(「2」は100 Wで2分、「1」は0 Wで1分)です。
- スライドを1 mLの1x PBSで3〜5回広範囲に洗浄し、各スライドから余分なPBSを吸い取ります。
- 直接標識抗体を含む一次抗体染色溶液#3 (サイクル1) を各スライドに添加します。ステップ2.7で概説したように、マイクロ波または代替法(37°Cで1時間)を使用して抗体染色を行います。
- スライドを1 mLの1x PBSで再度3〜5回洗浄し、各スライドから余分なPBSを慎重に吸い取ります。
- 30 μLの封入剤を各組織切片に直接加え、組織切片全体を覆うカバースリップを置きます。スライドに気泡がないか検査し、穏やかな圧力で気泡をスライドの周囲に押し込みます。残りのスライドについても、このプロセスを繰り返します。
- 糸くずの出ないワイプで余分な封入剤を取り除き、光学レンズクリーナーを使用してカバーガラスの表面に残っている残留物を清掃します。顕微鏡で画像取得を行う前に、すべてのスライドを室温で10〜15分間設定します。
5. 顕微鏡のセットアップと画像取得
- 広視野顕微鏡とLED8光源の電源を入れます。ソフトウェアを起動します。対物レンズを選択します(ここでは、20x/0.8ドライ対物レンズ)。設定タブでカメラを16ビットモードにします。抗体パネルに存在する蛍光色素に基づいて、必要なチャネルを選択します(詳細なガイダンスについては、表1を参照してください)。
注:次の手順は、参照された顕微鏡に指定されています。同等の光源と、いくつかの蛍光色素の励起および発光用のフィルターキューブを備えた同等の広視野顕微鏡と、精密ステージを使用することができます。 - イメージングの直前に、レンズクリーナーとレンズペーパーでカバーガラスを清掃してください。カバースリップを目視で検査し、イメージングする前に表面からほこりや糸くずを取り除きます。スライドをステージインサートの左上隅(または同等のもの)にしっかりと配置して、組織がXY平面に一貫して配置されるようにします(サイクリック画像のアライメントに重要です)。
- 抗体パネルに含まれる各蛍光色素に対応する チャネル を作成して、取得設定を行います。各蛍光色素に対応する フィルターキューブ と LED を選択します。各LEDの強度と各チャンネルの露光時間を調整します。ここで使用するイメージ設定の一覧については、 表 1 を参照してください。
- 画像を取得する前に、 Hoechstチャネル を選択し、 リンクされたシェーディングをオンにします。リンク シェーディング ウィザードを使用して、選択したオブジェクトに対してこれを設定します。
注:このプロトコルでは、大きなタイルスキャンの取り込みを通じてスライド全体の画像を実行する方法を詳しく説明しています。リンクされたシェーディングまたはシェーディング補正は、タイル化された画像間の不均一な照明を克服するために必要です。 - ソフトウェアで、 ライブ ボタンをクリックして、Hoechstチャネルを視覚化します。粗いフォーカスノブを使用して、ティッシュセクションにピントを合わせます。
- 各蛍光チャンネルを選択し、サイクル中の蛍光標識されたすべての抗体について予想される染色パターンについて組織切片を評価します。
- ソフトウェアでNavigatorを選択します。NavigatorのHoechstチャンネルとスパイラル機能を使用して、イメージングする組織切片全体または関心領域をマッピングします。スライドごとに複数の組織切片を画像化する場合は、この手順を繰り返して、Navigatorを使用して組織のマップを作成します。
- Navigator のポリゴン、マジックワンド、またはその他の ROI 選択ツールを使用して、画像化する ROI を特定します。組織のアウトラインを慎重に描画して、目的のROIをカバーするために必要な最小のタイルをキャプチャします。余分なタイルを削除して、合計取得時間を短縮します。
- ROIが作成されたら、チャンネル設定を確認して調整し、飽和ピクセルを最小限に抑え、信号対雑音比を最適化します。画像表示ウィンドウでヒートマップルックアップテーブルを選択します。色はピクセルの塗りつぶしレベルを示し、赤、オレンジ、黄色、白は強度の見やすい変化を示します。青いピクセルは、飽和したピクセルを示します。情報の損失や画質の低下を防ぐには、露光時間を短縮して、飽和(青)ピクセルの数を最小限に抑えます。
- Navigator で、[フォーカス マップ] ツールを使用して、組織の地形マップを作成します。大きなタイルや不均一なサンプルに対して、3〜4 FOVごとにフォーカスマップポイントを設定します。
注:この手順は、スライド全体のイメージングに必要な大きなタイルスキャンにとって重要です。一般に、画像の品質は、選択したフォーカスマップポイントの数に比例します。ただし、このプロセスは、特に大規模なタイルスキャンの場合、非常に時間がかかる場合があります。- フォーカスマップポイントは、顕微鏡でスキャンされる順序で作成します。参照先のマイクロスコープのタイルスキャン順序に合わせるには、マイクロスコープが使用するパスと一致する曲がりくねったパスに沿ったフォーカスマップポイントを選択します。
- マニュアルフォーカスを使用して最初のフォーカスマップポイントを設定します。残りのフォーカスマップポイントにはオートフォーカスを使用します。座って、各フォーカスマップポイントに最適なフォーカスが選択されていることを確認します。必要に応じて、フォーカスマップポイントを手動で調整します。不均一な組織や大きな組織の各フォーカスマップポイントを見つけるために使用する範囲を広げます。
- 次のパラメータを使用して処理を設定します:封入媒体(ここでは1.4)に一致するように設定された屈折率(RI)を持つSmall Volume Computational Clearing(SVCC)。強度は98%に設定され、フィーチャーサイズはメンブレンマーカーの場合は2,000 nm、核マーカーの場合は3,000 nmに設定されています。画像取得中に計算クリアリング プロトコルを実行します。
- タイルのスキャンを開始します。タイル番号を書き留め、すべてのサイクルでROIを一定に保ちます。
- 画像取得後、計算でクリアされた画像を [処理] タブにある [モザイク マージ] とマージし、[スムーズ] オプションを選択します。各画像のステッチエラーを目視で確認し、タイリングエラーがある場合は新しいパラメータでモザイクマージを繰り返します。
注: 画像の位置合わせが不十分な場合、繰り返し取得された画像の登録が妨げられます。 - 必要に応じて、 Dye Separationモジュール を使用して、前述の5と同様にチャンネル間のスペクトルスピルオーバーを補正します。
6. 色素の不活化、抗体標識、画像取得のサイクル
- 画像取得が完了したら、カバーガラスが剥がれるまで、スライドを滅菌1x PBSの50 mLコニカルチューブに浸します。カバーガラスが落ちない場合は、PBSをスライドの真上に動かすか、ピンセットを使用してカバーガラスをそっと取り外します。
- 水素化ホウ素リチウム(LiBH4)溶液を調製するには、3〜5 mgの粉末をプラスチック製の計量ボートに計量します。diH2Oを1:1の比率で粉末に直接添加し(例:LiBH4 3.2 mg、diH2O3.2 mL)、ピペットで溶液をホモジナイズします。シリンジを使用して、溶液を0.2 μmフィルターに通し、50 mLのコニカルチューブに流し込み、濃度と溶液が作成された正確な時間を記録します。溶液全体に大きな気泡が見られるまで、溶液を室温で3〜5分間インキュベートします。
注:調製後4時間以内に染料不活化溶液を使用することをお勧めします。注意: 化学薬品ドラフトで次の手順を実行し、適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。この反応により、引火性の高い水素ガスが生成されます。常に少量のLiBH4(<10mg)を扱うことが重要です。詳細については、IBEX Knowledge-Base10,11 で LiBH4 を安全に準備する方法に関するチュートリアル ビデオをご覧ください。
LiBH4 バイアルは、空気に繰り返しさらされると漂白効果が低下するため、4週間の使用後に交換してください。LiBH4 (1グラム)の小さなアリコートを購入することをお勧めします。 - 1x PBSソークから各スライドを取り出し、糸くずの出ないワイプで余分なPBSを吸い取り、スライドの水分チャンバーに入れます。
- カバースリップされていない各スライドをLiBH4で30分間処理し、溶液を組織を覆うのに十分な容量のスライドに直接ピペッティングします。各スライドから古いLiBH4溶液を取り出し、同じLiBH4ストック溶液から10分後および20分後に新しいLiBH4溶液でリフレッシュします。
- スライドを1xPBSで3〜5倍広範囲に洗浄します。PBSのクイック交換を使用し、スライドを1回の洗浄で1分間浸します。
- バックグラウンド減算用の画像を取得するには、ステップ4.12〜4.13で説明したように各スライドに新しいカバースリップを配置し、色素不活性化後の組織の画像を取得します。背景減算画像の新しいプロジェクトを作成し、手順 5.2 から 5.14 を繰り返して画像を取得します。サイクル 1 の画像に対して設定された同じ数のタイル、チャネル、チャネル設定、および FOV を使用した画像。フォーカスマップポイントを同じFOVに保ちますが、オートフォーカスを使用して、この新しい画像の各フォーカスマップポイントを調整します。
注意: 繰り返される基準マーカー(Hoechst)を含むチャネルを使用して、「ライブ」画像(背景減算画像など)と前の画像(サイクル1)に存在する固有の構造(核形状)を特定します。 - 第2抗体サイクルにおけるビオチン化抗体からの非特異的蛍光シグナルを最小限に抑えるには、アビジンおよびビオチンブロッキングを行います。
- 余分なPBSを吸い取り、アビジンブロッキング溶液を室温で15分間各スライドに塗布します。
- スライドを1xPBSで3〜5回洗い、洗浄が完了したら余分なPBSを吸い取ります。
- ビオチンブロッキング溶液を各スライドに室温で15分間塗布し、ステップ6.7.2と同様にスライドを1x PBSで3〜5回洗浄します。
- 新しいBSAフリーブロッキングバッファー(サイクル2)(材料表)を準備します
一次抗体染色液#4(サイクル2)および二次抗体染色液#2(サイクル2)。
注:BSAはアビジン/ビオチンブロッキングステップを損なう可能性があるため、これらの溶液はウシ血清アルブミンを必要としません。 - 一次抗体をメーカー推奨濃度で希釈し、一次抗体染色溶液#4(サイクル2)で調製してください。この溶液を穏やかにボルテックスし、湿度チャンバー内の各スライドに加え、組織が一次抗体溶液で完全に覆われていることを確認します。スライドをスライドしたモイスチャーチャンバーをマイクロ波にセットし、ステップ2.7-2.8で詳述したように、一次抗体プログラムを約30分間実行します。
- ステップ4.6-4.9で詳述されているように、Secondary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 2) で二次抗体の標識を行います。染色が完了したら、ステップ4.12-4.13で前述したように、各スライドに新しいカバースリップを置きます。スライドを顕微鏡ステージに戻し、スライドを前の画像と同じXY平面に再配置します。
注意: 繰り返される基準マーカー(Hoechst)を含むチャネルを使用して、「ライブ」画像(サイクル2など)と前の画像(サイクル1)に存在する固有の構造(核形状)を特定します。 - サイクル 2 イメージの新しいプロジェクトを作成し、手順 5.2 から 5.14 を繰り返してサイクル 2 イメージを取得します。サイクル 1 の画像に対して設定された同じ数のタイル、チャネル、チャネル設定、および FOV を使用した画像。フォーカスマップポイントを同じFOVに保ちますが、オートフォーカスを使用して、この新しい画像の各フォーカスマップポイントを調整します。サイクル2の画像を取得したら、画像のアライメントに進むか、直接標識抗体を使用した追加のサイクルについてセクション6の手順を繰り返します。注意: 繰り返される基準マーカー(Hoechst)を含むチャネルを使用して、「ライブ」画像(サイクル2の画像など)と前の画像(サイクル1)に存在する固有の構造(核形状)を特定します。追加のサイクルには、IBEXが抗体をストリッピングしないため、直接標識された抗体が必要です。
7.画像の位置合わせ
- 顕微鏡出力の.lifファイルからの生の画像を、無料のFile Converterとオープンソースソフトウェアによる画像処理で.imsファイルに変換することができます。これは、前述の5で、IBEX Knowledge-Base10,11のビデオで詳しく説明されています。
- イメージングサイクルごとに、ファイルを編集し、必要な処理手順(チャンネル命名、チャンネル疑似色付けなど)を適用します。
- SimpleITK 用に作成されたチャネル演算関数を使用してバックグラウンド減算とチャネルしきい値処理を実行し、自家蛍光シグナル (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html) を減少させます。
注:これらの手順は、1つの合成画像に整列する前に、各画像(サイクル1、サイクル2など)で実行します。これは、大きな結合された画像よりも、小さな個々の画像で作業する方が簡単だからです。
- SimpleITK 用に作成されたチャネル演算関数を使用してバックグラウンド減算とチャネルしきい値処理を実行し、自家蛍光シグナル (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html) を減少させます。
- 登録ソフトウェアを使用するための一貫した命名戦略を考案します。接頭辞区切り文字の後置(例:「Cycle1 CD8_AF647」)でチャネルに名前を付け、最初のサイクルで抗CD8 AF647抗体が使用されたチャネルを示すために区切り文字としてスペースを使用します。
注:詳細については、ヘルプファイル拡張子を参照してください:https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html。 - すべてのチャネルに適切な名前を付けたら、登録ソフトウェアを起動し、[Imaris Extensions |シンプルITK |アフィン。
- 各サイクルの .ims ファイルをアップロードするには、[ファイル名] の横にある 参照 ボタンを使用します。 チャネル名のプレフィックス区切り文字を入力します。上記の例に従う場合は、スペースを 1 つ入力し、[ 次へ] をクリックします。
- サイクル間の共通の基準マーカーとして使用する レジストレーションチャネル を選択します(例:Hoechst)。
- 他の画像を登録する画像である 固定画像を選択します。
注: 反復イメージのサイクル 2 に登録することをお勧めします。 - 「出力ファイル」のディレクトリを選択します。[ Start registration at resolution ] オプションは、可能な限り最適な登録を可能にするために、デフォルトでは最大解像度に設定されます。計算能力が限られている場合は、このパラメーターを小さくします。
注: ここで説明するデータ (画像あたり 12 から 15 GB) では、最大解像度 5 を使用しました。 - 「登録」をクリックして開始します。登録が完了したら、[Resample and Save Combined Image] ボタンが表示されるのを待ってクリックし、プログレス バーが完了するのを待ちます。
- 完成した出力ファイルを処理ソフトウェアで開きます。すべてのサイクルとチャンネル情報を含む登録イメージが利用可能になり、分析または公開の準備が整います。
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結果
マルチプレックス抗体ベースのイメージングパネルを設計するには、多大な時間、労力、およびリソースが必要です12。これらの課題は、ここで説明するように、自己蛍光性の高い組織からアーカイブされたFFPEサンプルのパネルを設計する場合に特に顕著になります(図1)。これらの課題を克服するために、まず、当社の色素不活化プロトコルに適合する最も明るい蛍光色素を特定しました(表1)。例えば、Alexa Fluor Plus二次抗体は、Alexa Fluor®の同等品と比較して、免疫蛍光アッセイにおけるS/N比が4倍高いことが報告されています(出典:AF Plus製品データシート)。次に、明るい蛍光色素と発現率の低いマーカーを組み合わせ、可能な限り、一次抗体と二次抗体、またはストレプトアビジン-ビオチンによる間接免疫標識を使用してシグナルを増幅しました(表1)。第三に、光照射後(図3A)およびより長い波長でのイメージング(...
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ディスカッション
肺結核による臨床肺の病理は、壊死性肉芽腫性炎症を特徴としています。NTM肺の病理は、主に2つの異なる病理学的パターンを持つ2つの異なる患者集団で発生します:免疫適格な個人の細気管支の閉塞と空洞形成を伴う肉芽腫性炎症を特徴とする孤立した肺損傷、または免疫不全の個人の肺や他の臓器に影響を与えるびまん性結節性疾患13,14,15,16.これら3つの異なる形態のマイコバクテリア肺病理を比較すると、局所炎症の免疫学的細胞組成の違いや類似性、細胞間相互作用の空間的状況、および損傷部位での顕著な炎症性サイトカイン産生と制御性サイトカイン産生の違いや類似性についてはほとんど知られていません。私たちは、まれな歴史的なヒトホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)剖検および外科的切除肺組織ブロックにIBEX技術を採用しました。この技術によ...
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開示事項
A.J.R.はLeica Microsystems, Inc.の社員です。他の著者は、競合する利益を宣言していません。
謝辞
この研究は、DIR/NIAID、NCI、およびNHLBIの学内研究プログラムの支援を受けました。 図1 は、NIHとの機関ライセンス契約に基づいてBioRenderを使用して作成されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.3% トリトン-X-100 | シグマ・アルドリッチ | T8787 | ブロッキングバッファー用溶液 |
| 1%BSA | シグマ・アルドリッチ | A4503 | ブロッキングバッファー用溶液 |
| 1% ヒト BD Fc ブロック | BDバイオサイエンス | 564220 | ブロックバッファに必要な Fc ブロック |
| 150W LEDランプ | アマゾン | B07VH3CVSF | 組織用LED光源 |
| 1x PBS | ギブコ | 10010-023 | バッファーと洗浄ステップをブロックするためのソリューション |
| 20ガロンの保管容器 | アマゾン | B001B1C4G0 | 光照射プロセス用容器 |
| 40 W RGBW フラッド LED ランプ | アマゾン | B08QFPJSMD | 組織光照射用RGB光源 |
| Ag85B | アブカム | ab43019/NA | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| アルファ平滑筋アクチン DyLight 755 | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-345221R/NA | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| アビジン/ビオチンブロッキングキット | アブカム | AB64212 | アビジンとビオチンのブロッキングソリューション |
| BDサイトフィックス/サイトパーム | BDバイオサイエンス | 554714 | 固定液 |
| BONDデワックスソリューション | ライカバイオシステムズ | NC0221076 | 脱パラフィン溶液 |
| BONDエピトープ検索液1 | ライカバイオシステムズ | NC0235529 | クエン酸ベースのpH 6エピトープ回収溶液(ER1) |
| BONDエピトープ検索ソリューション2 | ライカバイオシステムズ | NC0235530 | EDTAベースのpH 9エピトープ検索溶液(ER2) |
| BOND研究検出システム | ライカバイオシステムズ | NC0396648 | 自動研究用染色試薬 |
| BOND RXリサーチステイナー | ライカバイオシステムズ | NA | 自動研究用染色プラットフォーム |
| BONDウォッシュソリューション | ライカバイオシステムズ | NC0221077 | 洗浄バッファー |
| CD15 | BDバイオサイエンス | 347420/AB_400298 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| CD20 eフルオア660 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 50-0202-82/AB_11150959 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| CD4 アレクサフルオール488 | R&Dシステム | FAB8165G/AB_2728839 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| CD45フィコエリトリン(PE) | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-34528PE/NA | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| CD68 iフルオア 594 | カプリコバイオテクノロジーズ | 1064135/AB_2892745 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| ロバ用アンチヤギ IgG Alexa Fluor Plus 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32814/AB_2762838 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| ロバ抗マウス IgG Alexa Fluor Plus AF647 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32787/ AB_2762830 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| ロバ抗マウス IgM Alexa Fluor 488 | ジャクソン・イムノリサーチ | 〒715-545-020/AB_2340844 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| ロバ抗ウサギ IgG Alexa Fluor Plus AF555 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32794/AB_2762834 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| EasyDip 染色システム | 新規参入者供給 | 5300キット | スライド染色システム |
| フルオロマウント-G | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 00-4958-02 | 取付媒体 |
| ヘクスト | バイオティウム | 40046 | IBEXイメージングのための核染色表 1 を参照してください。 |
| Imaris ファイルコンバーター x64 10.2.0 | イマリス・オックスフォード・インストゥルメンツ | 無料のファイルコンバーター | |
| ImarisViewerソフトウェアx64 10.2.0 | イマリス・オックスフォード・インストゥルメンツ | 無料の画像処理ソフトウェア | |
| ImmEdgeペン | ベクター研究所 | H-4000型 | 疎水性バリアペン |
| 水素化ホウ素リチウム(1グラム) | STREMケミカルズ | 93-0397 | 染料不活化用の化学物質、この化学物質の少量のアリコート(1グラム)を購入してください |
| ルミカンビオチン | R&Dシステム | BAF2846 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| マイクロカバーグラス | VWRの | 48393-241 | スライドガラスカバー |
| 汎サイトケラチン Alexa Fluor 750 | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。 |
| PELCO BioWave Pro マイクロ波システム | テッド・ペラ株式会社 | 36500-230 | 非加熱科学用マイクロ波 |
| ペルコ ステディテンプ プロ | テッド・ペラ株式会社 | 50062 | 科学用マイクロ波の全自動温度制御 |
| シンプルイット | オープンソースソフトウェア | 登録およびチャネル処理ソフトウェア | |
| ストレプトアビジン Alexa Fluor 594 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S11227 | IBEXイメージング用標識試薬表 1 を参照してください。 |
| 広視野顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | NA | LED8光源とLAS Xソフトウェア(3.7.1.21655)を備えたライカマイクロシステムズのTHUNDERイメージャー。蛍光イメージングでは、外部フィルターホイール(PN:11536075)と2つの追加のシングルバンドフィルター(PN:8118215)を備えたカスタムクアッドバンドフィルターを使用して、パスごとに7つの色素チャネルを画像化しました。フィルター励起線、二色性線、および発光線は、(1)クアッドバンドキューブ:391/32、479/33、554/24、638/31の二色性、励起または発光フィルターなし。(2)外部フィルターホイール位置1:434/32、位置2:520/40、位置3:585/20、位置4:720/60、位置5:パススルー。(3)シングルバンド1—585/22励起、594二色性、625/30発光。(4)シングルバンド2—635/20励起、647二色性、667/30発光。 |
| ツァイス光学レンズクリーナー | アマゾン | B00GPVQVCO | 顕微鏡対物レンズクリーナー |
| 抗体 | |||
| Ag85B | アブカム | AB43019 | ポリクローナルウサギIgG、サイクル1 |
| アルファ平滑筋アクチン DyLight 755 | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-345221R | 1A4/asm-1、サイクル1 |
| CD4 アレクサフルオール488 | R&Dシステム | FAB8165G | ポリクローナルヤギIgG、サイクル1 |
| CD8 アレクサ フルオア 647 | バイオレジェンド | 372906 | C8/144B、サイクル1 |
| CD68 iフルオア 594 | カプリコバイオテクノロジーズ | 1064135 | KP1、サイクル 1 |
| ロバ用アンチヤギ IgG Alexa Fluor Plus 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32814 | ポリクローナルロバ、サイクル1 |
| ロバ抗マウス IgG Alexa Fluor Plus AF647 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32787 | ポリクローナルロバ、サイクル1 |
| ロバ抗ウサギ IgG Alexa Fluor Plus AF555 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32794 | ポリクローナルロバ、サイクル1 |
| ヘクスト | バイオティウム | 40046 | 核ラベル、サイクル1 |
| CD15 | BDバイオサイエンス | 347420 | MMA、サイクル2 |
| CD20 eフルオア660 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 50-0202-82 | L26、サイクル 2 |
| CD45フィコエリトリン(PE) | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26、サイクル2 |
| ロバ抗マウス IgM Alexa Fluor 488 | ジャクソン・イムノリサーチ | 715-545-020 | ポリクローナルロバ、サイクル2 |
| ルミカンビオチン | R&Dシステム | BAF2846 | ポリクローナルヤギIgG、サイクル2 |
| 汎サイトケラチン Alexa Fluor 750 | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3、サイクル2 |
| ストレプトアビジン Alexa Fluor 594 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S11227 | N/A、サイクル 2 |
| ヘクスト | バイオティウム | 40046 | サイクル 2 |
| ソリューション | |||
| ブロッキングバッファ(サイクル1) | |||
| トリトン-X-100 | シグマ・アルドリッチ | T8787 | 0.3%(体積%) |
| BSAの | シグマ・アルドリッチ | A4503 | 体積で1% |
| ヒトBD Fcブロック | BDバイオサイエンス | 564220 | 体積で1% |
| 1x PBS | ギブコ | 10010-023 | 97.7%(数量ベース) |
| <強力>一次抗体染色液 #1 (サイクル 1) | |||
| ブロッキングバッファ(サイクル1) | 上記参照 | 抗体を追加した後のボリュームまで補充 | |
| ヘクスト | バイオティウム | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | バイオレジェンド | 372906 | 1:10 |
| <強力>一次抗体染色液 #2 (サイクル 1) | |||
| ブロッキングバッファ(サイクル1) | 上記参照 | 抗体を追加した後のボリュームまで補充 | |
| CD4 AF488 | R&Dシステム | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | アブカム | ab43019/NA | 1:100 |
| <強い>二次抗体染色液 #1 (サイクル 1) | |||
| ブロッキングバッファ(サイクル1) | 上記参照 | 抗体を追加した後のボリュームまで補充 | |
| ロバアンチゴート AF Plus 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| ロバアンチウサギAFプラス555 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| ロバアンチマウスAFプラス647 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| <強力>一次抗体染色液 #3 (サイクル 1) | |||
| ブロッキングバッファ(サイクル1) | 上記参照 | 抗体を追加した後のボリュームまで補充 | |
| CD68 iF594 | カプリコバイオテクノロジーズ | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| BSAフリーブロッキングバッファー(サイクル2) | |||
| トリトン-X-100 | シグマ・アルドリッチ | T8787 | 0.3%(体積%) |
| ヒトBD Fcブロック | BDバイオサイエンス | 564220 | 体積で1% |
| 1x PBS | ギブコ | 10010-023 | 98.7%(数量ベース) |
| <強力>一次抗体染色液 #4 (サイクル 2) | |||
| BSAフリーブロッキングバッファ(サイクル2) | 上記参照 | 抗体を追加した後のボリュームまで補充 | |
| CD15 | BDバイオサイエンス | 347420 | 1:30 |
| ルミカンビオチン | R&Dシステム | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eフルオア660 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 50-0202-82 | 1:10 |
| パンサイトケラチンAF750 | ノバスバイオロジカルズ | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| 二次抗体染色液 #2 (サイクル 2) | |||
| BSAフリーブロッキングバッファ(サイクル2) | 上記参照 | 抗体を追加した後のボリュームまで補充 | |
| ロバ抗マウスIgM AF488 | ジャクソン・イムノリサーチ | 〒715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| ストレパビジンAF594 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S11227 | 1:200 |
参考文献
- Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
- Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).
- Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. Heterogeneity in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).
- Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Hickey, J. W., et al. Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging. Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).
- Duong, H., Han, M. A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue. J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).
- Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology. J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).
- Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
- Radtke, A. J., et al. The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
- Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. ArXiv. , (2024).
- Quardokus, E. M., et al. Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging. Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).
- Mcshane, P. J., Glassroth, J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights. Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).
- Hsu, A. P., et al. Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome. Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).
- Vinh, D. C., et al. Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses. Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).
- Filipe-Santos, O., et al. X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production. J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).
- Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues. Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).
- Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry. J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).
- Harman, D. Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system. Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).
- Brunk, U. T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function. Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).
- Jung, T., Bader, N., Grune, T. Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences. Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).
- Sherratt, M. J. Tissue elasticity and the ageing elastic fibre. Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).
- Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
- Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).
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