Method Article

反復漂白に最適化されたワークフローにより、高自家蛍光の臨床サンプルのマルチプレキシティイメージングが拡張されます

DOI:

10.3791/67980

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July 11th, 2025

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1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

手動IBEX法による低コストで汎用性の高い光照射技術の実装により、有意な天然自家蛍光でヒト組織の最適なイメージングが可能になります。このプロトコルでは、倒立顕微鏡、広く利用可能な試薬、および画像のアライメントと処理のためのオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからマルチプレックス化されたホールスライド画像を取得する方法を詳しく説明しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非結核性抗酸菌(NTM)による肺疾患の有病率は、世界的に増加しています。NTM誘発性肺疾患は、気管支拡張症、肺結節、空洞疾患を呈することが多いですが、これらの明確な肺損傷パターンに関連する宿主反応は、 その場で十分に特徴付けられていません。私たちは、NTM症患者の肺組織中の免疫細胞集団の詳細な表現型解析を行うことにより、肉芽腫性炎症、結核性肺疾患のゴールドスタンダードと比較することにより、NTM誘発性の病態を評価することを目指しました。

播種性NTM、肺NTM、または肺結核疾患の患者から採取したホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)肺ブロックを、反復漂白拡張マルチプレキシティ(IBEX)イメージング法の修正版に従って切片化し、染色しました。IBEX法の最適化は、FFPEの保存とFFPEブロックの年齢によって悪化する肺組織固有のコラーゲン、エラスチン、赤血球の高密度による肺切片の有意な内因性蛍光に対処するために最初に必要でした。このプロトコルでは、臨床的にアーカイブされたサンプルの自家蛍光を低減する光照射プロトコルと改変抗原賦活化法について詳しく説明します。

さらに、交差反応性、光照射後のエピトープ損失、隣接する蛍光色素間のスペクトルオーバーラップ、特定のターゲットの低S/N比などの一般的な課題を含む、抗体パネル設計に関するガイダンスを提供します。肺組織切片の効率的なイメージングを容易にするために、スライドは広視野顕微鏡で画像化され、オープンソースソフトウェアで後処理されて画像品質が向上しました。このワークフローは、広く利用可能な機器や試薬を使用して、困難なサンプルから高度に多重化された高解像度の全スライド画像を取得する方法を文書化することにより、重要なニーズに対応します。臨床サンプルの定量的イメージングにとどまらず、これらの手法は多様なサンプルタイプに適用でき、内因性および外因性の蛍光源を克服することができます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

結核(TB)は主要な死因の1つであり、毎年約130万人が結核感染症で亡くなっています1。結核ほど致死的ではありませんが、近年、非結核性抗酸菌(NTM)によって引き起こされる肺感染症とその後の疾患が大幅に増加しています2。組織レベルでは、肺 結核菌 (Mtb)感染に対する宿主の免疫応答は十分に研究されており、肉芽腫、リンパ球の不均一な凝集体、樹状細胞、マクロファージ、および好中球の形成が含まれます3。肉芽腫性炎症は、NTM感染に対する宿主免疫の基本的な特徴でもありますが、免疫細胞集団とこの応答の空間的特性については、まだ十分に研究されていません。免疫病理学と創傷治癒の組織成分を詳細に理解することは、治療法(例:宿主指向療法)および予防的(すなわちワクチン)治療戦略の開発にとって重要です。

この研究では、私たちのチームは、MtbまたはNTM感染患者の肺切除または剖検中に取得した希少なアーカイブ臨床サンプルにアクセスできました。これらのサンプルの大部分は10年以上前のもので、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルとして保存されていたため、組織学的アッセイでの使用に限定されていました。従来の免疫組織化学(IHC)および免疫蛍光(IF)イメージングの....

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Protocol

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アーカイブされた剖検および外科的切除肺組織切片は、プロトコル09-H-0172(NCT00943514)「気管支拡張症の自然史」に基づいて、国立衛生研究所臨床センター病理学研究所で収集されました。このプロトコルはIRBによって承認され、参加者はインフォームドコンセントを提供しました。

1. 抗原賦活化の自動化

注:脱パラフィンおよび抗原賦活化は、自動研究染色プラットホームを用いて行いました(図1)。これまでの研究では、クエン酸ベースのpH 6エピトープ賦活化溶液(ER1)で30分、次にEDTAベースのpH 9エピトープ賦活化液(ER2)で30分からなる二重抗原賦活化アプローチが、FFPE組織9に対して最良の免疫標識結果をもたらしたと判断されました。同等の結果は、IBEXイメージングコミュニティ10,11によって提供される他の説明された方法とサポートを使用して、手動脱ロウおよび二重抗原賦活化を使用して取得できます。

  1. スライドと自動抗原賦活化用品(スライドカバー、研究検出システム、クエン酸ベースのpH 6....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マルチプレックス抗体ベースのイメージングパネルを設計するには、多大な時間、労力、およびリソースが必要です12。これらの課題は、ここで説明するように、自己蛍光性の高い組織からアーカイブされたFFPEサンプルのパネルを設計する場合に特に顕著になります(図1)。これらの課題を克服するために、まず、当社の色素不活化プロトコルに適合する最も明るい蛍光色素を特定しました(表1)。例えば、Alexa Fluor Plus二次抗体は、Alexa Fluor®の同等品と比較して、免疫蛍光アッセイにおけるS/N比が4倍高いことが報告されています(出典:AF Plus製品データシート)。次に、明るい蛍光色素と発現率の低いマーカーを組み合わせ、可能な限り、一次抗体と二次抗体、またはストレプトアビジン-ビオチンによる間接免疫標識を使用してシグナルを増幅しました(表1)。第三に、光照射後(図3A)およびより長い波長でのイメージング(.......

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Discussion

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肺結核による臨床肺の病理は、壊死性肉芽腫性炎症を特徴としています。NTM肺の病理は、主に2つの異なる病理学的パターンを持つ2つの異なる患者集団で発生します:免疫適格な個人の細気管支の閉塞と空洞形成を伴う肉芽腫性炎症を特徴とする孤立した肺損傷、または免疫不全の個人の肺や他の臓器に影響を与えるびまん性結節性疾患13,14,15,16.これら3つの異なる形態のマイコバクテリア肺病理を比較すると、局所炎症の免疫学的細胞組成の違いや類似性、細胞間相互作用の空間的状況、および損傷部位での顕著な炎症性サイトカイン産生と制御性サイトカイン産生の違いや類似性についてはほとんど知られていません。私たちは、まれな歴史的なヒトホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)剖検および外科的切除肺組織ブロックにIBEX技術を採用しました。この技術によ.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.R.はLeica Microsystems, Inc.の社員です。他の著者は、競合する利益を宣言していません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、DIR/NIAID、NCI、およびNHLBIの学内研究プログラムの支援を受けました。 図1 は、NIHとの機関ライセンス契約に基づいてBioRenderを使用して作成されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% トリトン-X-100シグマ・アルドリッチT8787ブロッキングバッファー用溶液
1%BSAシグマ・アルドリッチA4503ブロッキングバッファー用溶液
1% ヒト BD Fc ブロックBDバイオサイエンス564220ブロックバッファに必要な Fc ブロック
150W LEDランプアマゾンB07VH3CVSF組織用LED光源
1x PBS ギブコ10010-023バッファーと洗浄ステップをブロックするためのソリューション
20ガロンの保管容器アマゾンB001B1C4G0光照射プロセス用容器
40 W RGBW フラッド LED ランプ アマゾンB08QFPJSMD組織光照射用RGB光源
Ag85Bアブカムab43019/NAIBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
アルファ平滑筋アクチン DyLight 755ノバスバイオロジカルズNBP2-345221R/NAIBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
アビジン/ビオチンブロッキングキットアブカムAB64212アビジンとビオチンのブロッキングソリューション
BDサイトフィックス/サイトパームBDバイオサイエンス554714固定液
BONDデワックスソリューションライカバイオシステムズNC0221076脱パラフィン溶液
BONDエピトープ検索液1ライカバイオシステムズNC0235529クエン酸ベースのpH 6エピトープ回収溶液(ER1)
BONDエピトープ検索ソリューション2ライカバイオシステムズNC0235530EDTAベースのpH 9エピトープ検索溶液(ER2)
BOND研究検出システムライカバイオシステムズNC0396648自動研究用染色試薬
BOND RXリサーチステイナーライカバイオシステムズNA自動研究用染色プラットフォーム
BONDウォッシュソリューションライカバイオシステムズNC0221077洗浄バッファー
CD15BDバイオサイエンス347420/AB_400298IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
CD20 eフルオア660サーモフィッシャーサイエンティフィック50-0202-82/AB_11150959IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
CD4 アレクサフルオール488R&DシステムFAB8165G/AB_2728839IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
CD45フィコエリトリン(PE)ノバスバイオロジカルズNBP2-34528PE/NAIBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
CD68 iフルオア 594カプリコバイオテクノロジーズ1064135/AB_2892745IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
ロバ用アンチヤギ IgG Alexa Fluor Plus 488サーモフィッシャーサイエンティフィックA32814/AB_2762838IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
ロバ抗マウス IgG Alexa Fluor Plus AF647サーモフィッシャーサイエンティフィックA32787/ AB_2762830IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
ロバ抗マウス IgM Alexa Fluor 488ジャクソン・イムノリサーチ〒715-545-020/AB_2340844IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
ロバ抗ウサギ IgG Alexa Fluor Plus AF555サーモフィッシャーサイエンティフィックA32794/AB_2762834IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
EasyDip 染色システム新規参入者供給5300キットスライド染色システム
フルオロマウント-Gサーモフィッシャーサイエンティフィック00-4958-02取付媒体
ヘクストバイオティウム40046IBEXイメージングのための核染色表 1 を参照してください。
Imaris ファイルコンバーター x64 10.2.0イマリス・オックスフォード・インストゥルメンツ無料のファイルコンバーター
ImarisViewerソフトウェアx64 10.2.0イマリス・オックスフォード・インストゥルメンツ無料の画像処理ソフトウェア
ImmEdgeペンベクター研究所H-4000型疎水性バリアペン
水素化ホウ素リチウム(1グラム)STREMケミカルズ93-0397染料不活化用の化学物質、この化学物質の少量のアリコート(1グラム)を購入してください
ルミカンビオチンR&DシステムBAF2846IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
マイクロカバーグラスVWRの48393-241スライドガラスカバー
汎サイトケラチン Alexa Fluor 750ノバスバイオロジカルズNBP2-33200AF750/AB_2868569IBEXイメージング用抗体表 1 を参照してください。
PELCO BioWave Pro マイクロ波システムテッド・ペラ株式会社36500-230非加熱科学用マイクロ波
ペルコ ステディテンプ プロテッド・ペラ株式会社50062科学用マイクロ波の全自動温度制御
シンプルイットオープンソースソフトウェア登録およびチャネル処理ソフトウェア
ストレプトアビジン Alexa Fluor 594サーモフィッシャーサイエンティフィックS11227IBEXイメージング用標識試薬表 1 を参照してください。
広視野顕微鏡ライカマイクロシステムズNALED8光源とLAS Xソフトウェア(3.7.1.21655)を備えたライカマイクロシステムズのTHUNDERイメージャー。蛍光イメージングでは、外部フィルターホイール(PN:11536075)と2つの追加のシングルバンドフィルター(PN:8118215)を備えたカスタムクアッドバンドフィルターを使用して、パスごとに7つの色素チャネルを画像化しました。フィルター励起線、二色性線、および発光線は、(1)クアッドバンドキューブ:391/32、479/33、554/24、638/31の二色性、励起または発光フィルターなし。(2)外部フィルターホイール位置1:434/32、位置2:520/40、位置3:585/20、位置4:720/60、位置5:パススルー。(3)シングルバンド1—585/22励起、594二色性、625/30発光。(4)シングルバンド2—635/20励起、647二色性、667/30発光。
ツァイス光学レンズクリーナーアマゾンB00GPVQVCO顕微鏡対物レンズクリーナー
抗体
Ag85BアブカムAB43019ポリクローナルウサギIgG、サイクル1
アルファ平滑筋アクチン DyLight 755ノバスバイオロジカルズNBP2-345221R1A4/asm-1、サイクル1
CD4 アレクサフルオール488R&DシステムFAB8165GポリクローナルヤギIgG、サイクル1
CD8 アレクサ フルオア 647バイオレジェンド372906C8/144B、サイクル1
CD68 iフルオア 594カプリコバイオテクノロジーズ1064135KP1、サイクル 1
ロバ用アンチヤギ IgG Alexa Fluor Plus 488サーモフィッシャーサイエンティフィックA32814ポリクローナルロバ、サイクル1
ロバ抗マウス IgG Alexa Fluor Plus AF647サーモフィッシャーサイエンティフィックA32787ポリクローナルロバ、サイクル1
ロバ抗ウサギ IgG Alexa Fluor Plus AF555サーモフィッシャーサイエンティフィックA32794ポリクローナルロバ、サイクル1
ヘクストバイオティウム40046核ラベル、サイクル1
CD15BDバイオサイエンス347420MMA、サイクル2
CD20 eフルオア660サーモフィッシャーサイエンティフィック50-0202-82L26、サイクル 2
CD45フィコエリトリン(PE)ノバスバイオロジカルズNBP2-34528PE2B11 + PD7/26、サイクル2
ロバ抗マウス IgM Alexa Fluor 488ジャクソン・イムノリサーチ715-545-020ポリクローナルロバ、サイクル2
ルミカンビオチンR&DシステムBAF2846ポリクローナルヤギIgG、サイクル2
汎サイトケラチン Alexa Fluor 750ノバスバイオロジカルズNBP2-33200AF750AE-1/AE-3、サイクル2
ストレプトアビジン Alexa Fluor 594サーモフィッシャーサイエンティフィックS11227N/A、サイクル 2
ヘクストバイオティウム40046サイクル 2
ソリューション
ブロッキングバッファ(サイクル1)
トリトン-X-100シグマ・アルドリッチT87870.3%(体積%)
BSAのシグマ・アルドリッチA4503体積で1%
ヒトBD FcブロックBDバイオサイエンス564220体積で1%
1x PBS ギブコ10010-02397.7%(数量ベース)
<強力>一次抗体染色液 #1 (サイクル 1)
ブロッキングバッファ(サイクル1)上記参照抗体を追加した後のボリュームまで補充
ヘクストバイオティウム400461:5000
CD8 AF647バイオレジェンド3729061:10
<強力>一次抗体染色液 #2 (サイクル 1)
ブロッキングバッファ(サイクル1)上記参照抗体を追加した後のボリュームまで補充
CD4 AF488R&DシステムFAB8165G1:10
Ag85Bアブカムab43019/NA1:100
<強い>二次抗体染色液 #1 (サイクル 1)
ブロッキングバッファ(サイクル1)上記参照抗体を追加した後のボリュームまで補充
ロバアンチゴート AF Plus 488サーモフィッシャーサイエンティフィックA32814/AB_27628381:100
ロバアンチウサギAFプラス555サーモフィッシャーサイエンティフィックA32794/AB_27628341:100
ロバアンチマウスAFプラス647サーモフィッシャーサイエンティフィックA32787/AB_27628301:50
<強力>一次抗体染色液 #3 (サイクル 1)
ブロッキングバッファ(サイクル1)上記参照抗体を追加した後のボリュームまで補充
CD68 iF594カプリコバイオテクノロジーズ10641351:10
a-SMA DL755ノバスバイオロジカルズNBP2-345221R/NA1:30
BSAフリーブロッキングバッファー(サイクル2) 
トリトン-X-100シグマ・アルドリッチT87870.3%(体積%)
ヒトBD FcブロックBDバイオサイエンス564220体積で1%
1x PBS ギブコ10010-02398.7%(数量ベース)
<強力>一次抗体染色液 #4 (サイクル 2)
BSAフリーブロッキングバッファ(サイクル2)上記参照抗体を追加した後のボリュームまで補充
CD15BDバイオサイエンス3474201:30
ルミカンビオチンR&DシステムBAF28461:100
CD45 PEノバスバイオロジカルズNBP2-34528PE1:20
CD20 eフルオア660サーモフィッシャーサイエンティフィック50-0202-821:10
パンサイトケラチンAF750ノバスバイオロジカルズNBP2-33200AF7501:10
二次抗体染色液 #2 (サイクル 2)
BSAフリーブロッキングバッファ(サイクル2)上記参照抗体を追加した後のボリュームまで補充
ロバ抗マウスIgM AF488ジャクソン・イムノリサーチ〒715-545-020/AB_23408441:100
ストレパビジンAF594サーモフィッシャーサイエンティフィックS112271:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2....

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