げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

サマリー

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。

要約

皮質電図検査(ECoG)は、基本的な神経科学と、健康や疾患における人間の脳機能の理解との間の方法論的な架け橋です。ECoGは、皮質組織の広い領域にわたってミリ秒の時間分解能と柱状空間分解能で皮質表面から直接神経生理学的信号を記録するため、局所的および分散的な皮質計算を研究するための独自の位置を占めています。ここでは、カスタムの高密度micro-ECoG(μECoG)デバイスの設計と、2つの手順での使用方法について説明します。これらのグリッドには、電極間に穿孔のある透明なポリマー基板上に製造された200μm間隔の128個の低インピーダンス電極があります。これらの機能により、μECoG記録と層流ポリトロード記録および光遺伝学的操作を同時に行うことができます。まず、マウスのウィスカー体性感覚皮質上で硬膜外μECoG記録を組み合わせ、特定の遺伝的に定義された皮質細胞タイプの光遺伝学的操作を行うためのプロトコルを提示します。これにより、さまざまなニューロン集団の感覚処理への明確な寄与を因果関係で解剖すると同時に、μECoG信号におけるそれらの特定のシグネチャをモニタリングすることができます。次に、μECoGグリッドと層流ポリトロードを使用してラット聴覚皮質からの神経活動を記録するための急性実験のプロトコルを提示します。これにより、皮質表面全体の感覚誘発神経応答の詳細な地形マッピングが可能になり、同時に皮質深部に分布する複数の神経ユニットからの記録が可能になります。これらのプロトコルは、分布した皮質活動を特徴付ける実験を可能にし、多様な神経障害の理解と最終的な介入に貢献する可能性があります。

概要

感覚、認知、および行動の根底にある脳機能は、単一のニューロンのスパイクから、皮質柱内のニューロンの集団によって生成される電場、脳領域全体の列の地形的組織化(例:体性感覚皮質の体性体性、一次聴覚皮質のトノトピー)に至るまで、広大な空間的および時間的スケールにわたって組織化され、分布しています。脳の機能を理解するには、これらの空間スケール全体で電気信号を感知する必要があります¹。神経科学は現在、脳の活動を監視するために広く使用されている多くの方法を持っています。電気生理学的には、層流ポリトロード(ニューロピクセルなど)は、通常は一握りの離れた列内の単一ニューロンの適度な数(~300)を高い時間分解能(≥ kHz)でモニタリングできます。Ca²⁺イメージングは、遺伝的および解剖学的に同定された単一ニューロンの数々を、~1-2mmの空間範囲内で、より低い(~10Hz)時間分解能^でモニタリングすることができます2。fMRIは、脳全体の多数のニューロン(36mm3体積の~1Mニューロン)の代謝状態を非常に低い時間分解能(~0.2Hz)でモニタリングすることを可能にします。EEG/MEGは、適度な時間分解能(<100Hz)と非常に低い空間分解能(センチメートル)³で、皮質表面/脳全体からの電気的活動のモニタリングを可能にします。これらの方法論はそれぞれ、脳機能に対する基本的で相乗的な洞察を提供してきましたが、皮質の広範な空間領域にわたる正確な解剖学的位置から高い時間分解能で電気生理学的信号を直接検出できる方法は初期段階にあります。広範な空間的カバレッジの必要性は、脳内では、ニューロンの^{機能が深さ4}と比較して表面全体ではるかに劇的に変化するという事実によって強調されています。

皮質電気検査(ECoG)は、低インピーダンス電極のグリッドを脳の表面に埋め込み、皮質^1,5の記録または刺激を可能にする方法です。ECoGは通常、薬理学的に難治性てんかんを治療するための臨床精密検査の一部として、人間の脳神経外科の環境で展開されます。しかし、それはまた、音声および感覚地形マッピング^6,7のような、ヒトにおける分布した皮質処理に関する独自の洞察も提供する。これらの能力は、サル、ラット、およびマウス5,8,9,10,11を含む動物モデルでの使用を動機付けている。げっ歯類では、micro-ECoG (μECoG) が、柱状空間分解能 (~200 μm) と広範な空間カバレッジ (数ミリメートル) で、ニューロン集団の高時間分解能 (~100 Hz) を直接電気的に監視できることが示されています。μECoGは、研究者が動物モデル^12,13の複雑な感覚処理、認知機能、および運動行動に関連する分布神経ダイナミクスを調査することを可能にします。近年の進歩により、μECoGはオプトジェネティクスおよび層流ポリトロード記録14,15,16,17,18,19,20と統合され、皮質ネットワークのマルチスケール研究が可能になり、ミクロスケールのニューロン活動とマクロスケールの皮質ダイナミクスとの間のギャップを埋めることができる^{ようになった21,22}.重要なことに、μECoGシグナルはヒトと非ヒト動物モデルで非常に類似しているため、μECoGを使用すると、動物モデルからヒトへの結果と知見の変換がはるかに直接的になる²³。このように、統合的アプローチは、神経回路の理解を深めるために重要であり、神経障害に対する新しい治療介入を開発することが期待されています^5,24,25。

その結果、高密度μECoGアレイを層流記録および光遺伝学的ツールと統合して、皮質処理の包括的なマルチスケール研究を可能にするプロトコル^{の必要性が高まっています8,26}。このギャップを埋めるために、電極間に穿孔のある柔軟で透明なポリマー基板(パリレンCおよびポリイミド)上に、電極径40μm、電極間間隔20μmの低インピーダンス電極を128個備えたカスタム設計のμECoGデバイスを開発し、オプトジェネティックマニピュレーションによるμECoGと層流ポリトロードの同時記録を可能にしました^13,22.この実験プロトコルの主な側面には、(i)高密度μECoGアレイによる列状空間分解能と皮質活動の大規模なカバレッジが含まれます。(ii)μECoGグリッドを介して挿入された層状ポリトロードを使用して、複数の皮質層から記録する能力。(iii)特定のニューロン集団を選択的に活性化または阻害するための光遺伝学的技術の組み込みにより、神経回路の因果関係の解剖が可能になる27,28,29。高密度構成は、高空間分解能の記録を可能にし、以前の研究がμECoG信号がげっ歯類の皮質柱の直径(~20μm)に匹敵する空間スケールで活動を解決できることが示されているように、皮質活動の「柱状ビュー」を効果的に提供します¹¹。この統合された方法論により、神経活動のマルチスケールモニタリングと操作を同時に行うことができ、μECoG信号のニューロン源や分布した皮質処理を特定するための因果実験が可能になる可能性があります。これらの目的を達成するために、この原稿では、高密度μECoGアレイを2つの組み合わせで使用するための詳細なプロトコルを提供します。

まず、マウスの一次体性感覚皮質(S1)における第5層(L5)錐体細胞の操作と組み合わせたμECoGについて述べる。マウスでは、μECoGアレイを硬膜外に配置(マウスの硬膜切開術の外科的難治性のため)。光ファイバーは、グリッド上に配置されるか、レンズと組み合わせて、皮質表面の小さなターゲット領域に光遺伝光を集中させます。光遺伝学的戦略は、ここでは第5層興奮性ニューロンの阻害について説明するが、対応する集団特異的なCre発現マウス系統を持つニューロンの任意の集団に容易に適応させることができる。次に、μECoGとシリコン層流ポリトロードを組み合わせて使用することで、ラット聴覚皮質(A1)の皮質層を横切る複数のニューロンからの皮質表面電位(CSEP)と単一ユニットのスパイク活動を同時に記録する方法について説明します。アレイには電極間に穿孔があり、グリッドを介してマルチチャネルの層状ポリトロードを挿入して、さまざまな皮質層にわたるニューロンの活動を記録することができます。開頭術では、μECoGアレイを聴覚皮質の上に硬膜下に配置し、層流多片を穿孔を通して挿入します。μECoGプローブと層流プローブからの神経信号は同時に記録され、デジタル信号プロセッサに光学的に接続されたアンプシステムを使用して、それぞれ6kHzと24kHzでサンプリングされます。

プロトコル

どちらのプロトコルも同じ主要な手順(麻酔、固定、開頭術、μECoG記録)に従いますが、顕著な違いがあります。次の説明では、共有ステップがマージされ、各プロトコルの特異性に注釈が付けられています。以下の手順は、オプトジェネティクスによるμECoG記録(Mouse)または層流プローブによるμECoG記録(Rat)に対応しています。ここに記載されているすべての手順は、地域の倫理当局または法律当局(IACUCまたは倫理委員会)に準拠して実施されました。使用される薬は、承認された倫理プロトコルによって異なる場合があります。

1. マウスおよびラットの手技のための準備およびプロトコール

1. マウスとラットのプロトコルの顕著な違い
   1. 手術のセットアップと電気生理学的記録の比較
      1. ラットの場合は、手術と電気生理学的記録の両方で同じセットアップを使用します。
      2. マウスの場合は、最初のセットアップで手術を行い、2番目のセットアップで電気生理学的記録を行います。
   2. 頭部固定
      1. ラットの場合は、手術と電気生理学的記録に同じ鼻クランプを使用します。
      2. マウスの場合は、手術用の鼻クランプを使用し、電気生理学のセットアップで外部金属製のヘッドバーを使用して、軽いイソフルラン麻酔下での固定を可能にします。ヘッドバーにデンタルセメントを頭蓋骨に埋め込みます。
   3. 録音セットアップ:2つの種について、異なる取得電子機器、録音ソフトウェア、および感覚刺激ソフトウェアを使用します。
      1. マウスプロトコルには、SpikeGadgetsシステム(https://spikegadgets.com)とオープンソースのTrodesソフトウェア(https://spikegadgets.com/trodes/)を使用してデータ取得を行います。
      2. ラットプロトコルには、データ取得に記録ソフトウェアSynapse - Neurophysiology Suite(https://www.tdt.com/component/synapse-software/)を利用します。
   4. 注射(ラット)または吸入(マウス)によって麻酔を誘発します。
   5. 収録場所
      1. マウスの体性感覚皮質(S1)で記録を行います。
      2. ラットの一次聴覚皮質(A1)で録音を行います。
         注:この解剖学的局在の違いには、各種ごとに異なる開頭部位が必要です。
2. グリッドの準備とテスト
   1. グリッド(コネクタボードを除く)を希釈した酵素洗剤(50%洗剤、50%蒸留水)に少なくとも1時間浸します。
   2. 純粋な蒸留水の浴に移し、安全で清潔な場所で風乾させます。
   3. プラチナブラック電デポジションは、μECoGデバイスの初期準備の一環として、すべての録音セッションの前ではなく、実施します。
      注:堆積すると、プラチナブラックコーティングは安定した層を形成し、複数の録音に効果的であり続けますが、そのパフォーマンスは定期的なインピーダンステストを通じて監視する必要があります。Platinum Black電着(1kHzで10〜20kΩのターゲット範囲)は、電極インピーダンスを減少させ、神経録音の信号対雑音比を改善します。
   4. 電着を行うには、堆積調整剤として少量の酢酸鉛(約0.005%)を含むクロロプラチン酸溶液(通常は1〜3%クロロプラチン酸[H2PtCl6])を調製します。μECoG電極を3電極電気化学セルの作用電極として接続し、白金対電極とAg/AgCl参照電極を使用します。
   5. インピーダンス値を監視しながら、約-0.5〜2mA /cm²の一定電流密度を10〜30秒間印加します。
   6. グリッド電極のインピーダンスをテストおよび記録します(Nano-Zなど)。
   7. 光源上のグリッドを確認し、術後の記録で使用するためのグリッドを準備します。
3. リファレンスケーブルのはんだ付け
   1. マウスの場合は、銀線(長さ10 mm、30 G)の端を金色のピンにはんだ付けして、記録システムのリファレンスリードに接続します。

2. 手術

1. 資料の準備と一般的なモニタリング(動物の世話と記録)
   1. 準備:適切な消毒剤で手術部位を徹底的に洗浄し、消毒します。すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください(通常はオートクレーブを使用して)。
   2. 手術器具の配置:滅菌手術パッドに手術器具を配置します。手術部位には、綿チップのアプリケーターと吸収性コットンの手術用トライアングルをストックします。バイオハザード廃棄物は専用の廃棄袋に捨ててください。
   3. 温度調節:外科的および電気生理学的記録部位内の加熱パッドをオンにします。手術中と録画中、加熱パッドの温度を制御します。
   4. サージカルパッド:温度調節ベッドの上に青いサージカルパッドまたは毛布を置きます。
      注:このパッドは、上を向いた柔らかい綿の白い底を備えている必要があります。
   5. 顕微鏡の位置決め:顕微鏡と取り付けられた照明器(LEDリングなど)を手術部位の片側に準備します。正常に機能していることを確認します。
   6. 外科用ドリル: 開頭術用の外科用ドリルを準備します。
   7. 酸素供給:酸素タンクの流量を1.0 L / min(Rat)または0.5 L / min(マウス)に設定し、酸素マスクをレギュレーションパッドの近くに置きます。動物は麻酔後に継続的な酸素を必要とします。
   8. 輸液補充:手術中は、動物の体重の少なくとも1.5%(マウス)または1時間あたり1mL(ラット)の補充を目指して、体液の損失を交換します。それに応じて等張溶液を準備します。
   9. 動物:承認された手順に従って、動物施設から手術室に動物を連れて行きます。C57Bl6の背景を持つ8〜16週齢の雄または雌のマウスを使用します。同様に、生後7週齢のスプレイグ・ドーリー系統の雄のラットを使用します。
   10. 薬の調製:0.1 gの精度のはかりを使用して動物の体重を量ります。必要に応じて事前に希釈した溶液を使用して、手術に適切な量の薬物を準備します。.
2. 麻酔導入
   1. マウスの麻酔導入
      1. 動物をイソフルラン誘導チャンバー(0.5 L / min O₂中の3〜5%イソフルラン)に入れます。
      2. 深い麻酔が確認されたら(尻尾/つま先のつま先に反射がない)、動物を手術用加熱パッドに置き、頭固定します。
      3. 全身鎮痛のための皮下薬を注射します:メロキシカム:5 mg / kgおよびブプレノルフィン:0.1 mg / kg。
      4. 手順2.2.1.5-2.2.1.6に従ってマウスをヘッドフィックスします。
      5. 鼻を麻酔マスクに入れ、頭をヘッドマウントにゆるく入れます。マウスをバイトバーに配置するには、まず、舌がロッドと口蓋の間ではなく、ロッドの下にあることを確認します。必要に応じて鉗子を使用して舌を動かします。
      6. 動物の切歯をバイトバーのロッドの穴に挿入します。マウス麻酔マスク(0.5 L / min O₂中の1.5-2%イソフルラン)を固定ネジを静かに締めて固定します。.手術中の頭部の安定化は、バイトバーによってのみ保証されます。
      7. 手術中の乾燥を防ぐために、石油ベースの眼軟膏または潤滑剤で動物の目を保護します。
      8. マスクを通るイソフルランの連続的な流れで、手順全体を通して麻酔を維持します。
   2. ラットの麻酔導入
      1. 最初にイソフルランを使用して動物を鎮静させ、導入麻酔の注射を容易にします。.
      2. 麻酔と鎮痛のための薬を投与します。
         メロキシカム:投与量5 mg / kg、濃度10 mg / mL、0.4 mL / kg
         ケタミン:投与量90mg / kg、濃度100mg / mL、0.9mL / kg
         キシラジン:10 mg / kgの投与量、濃度100 mg / mL、0.1 mL / kg
      3. 体重と年齢にもよりますが、動物が15〜30分以内に深い麻酔に達するのを待ちます。
   3. 麻酔モニタリング
      1. 処置中、動物のバイタル(呼吸数)を継続的に監視します。麻酔状態の早期変化の特に有用な兆候として呼吸数を確認し、呼吸数が変化した場合は麻酔レベルを調整します。
      2. 足の離脱反射は、麻酔状態の重要な兆候です。この反射は、手術に十分なレベルの麻酔を確保するため、定期的にテストしてください。
3. 頭部の固定とバイタルサインのモニタリング
   1. 動物のバイタルモニタリング
      1. 動物のバイタルサインを実験シートに確認し、記録します。動物の反射神経(例:.、足の離脱)は完全には消えません。足の離脱)。.
   2. ラットの頭部固定
      1. ラットが完全に麻酔をかけられたら(足や尾の反射がない)、動物の切歯をヘッドマウントのロッドの穴に挿入します。
      2. 手術中に頭を固定するために、取り付けアームの先端を鼻の隆起部に慎重に挿入し、目と接触しないようにします。
      3. 動物の口の屋根がロッドにしっかりと押し付けられるまで、腕の角度を調整します。頭蓋骨が圧力下で動かないようにします。
      4. マウントの両アームを六角レンチでネジを締めて固定します。
   3. ラット用の酸素セットアップ
      1. 酸素タンクからのプラスチックチューブを動物の銃口と鼻に固定し、サージカルテープで固定します。空気の流れを妨げる可能性のあるチューブの折り目を避けてください。酸素ボンベの流量を1L/minにセットします。
         注:心拍数や呼吸数などの動物のバイタルは、手順全体を通して15〜30分間隔でチェックする必要があります。
4. 頭皮切開
   1. シェービングと準備
      1. 鼻の上部から後頭部まで、片方の目からもう片方の目へ、そして耳の周りに伸びる領域を剃ります。はさみまたは電動クリッパーで毛の大部分を取り除き、脱毛クリームを塗ります。
   2. 消毒
      1. ベタジンに浸した綿棒で消毒し、70%エタノールに浸した綿棒ですすいでください。このプロセスを3回繰り返し、最後にベタジンを塗布して、その領域が無菌であることを確認します。
   3. 局所麻酔薬注射
      1. 局所麻酔薬のリドカイン(1%、マウスの場合は0.1 mL、ラットの場合は0.4 mL / kgあたり)を動物の頭皮の正中線に皮下注射します。.頭皮を優しくマッサージしてリドカインを広げ、麻酔薬が効くまで5分間待ちます。
   4. 切開
      1. マウスの場合は、ピンセットで皮膚のポイントを持ち上げ、手術用ハサミを使用して皮膚の小さな部分(直径約1 cm)を切除します。
      2. ラットの場合は、メスを使用して、頭皮の前面、鼻のすぐ上、正中線で正確な切開を行います。皮膚をそっと引き戻し、目の間から頭蓋骨の付け根までまっすぐに切開します。頭皮を慎重に持ち上げ、結合組織を切り取り、頭蓋骨を完全に露出させます。
      3. 手順2.4.4.4-2.4.4.5に従って開頭術部位を公開します。
      4. スクレーパーで、頭蓋骨の上部にある結合組織と骨膜を取り除きます。生理食塩水を洗い流し、吸引または外科用スポンジを使用して部位を清掃します。
      5. 開頭術が行われる頭蓋骨領域の明確な露出を促進するために、皮膚の縁に外科用クリップを使用します。
5. 開頭術
   1. 一般的な穴あけ加工
      1. 外科用ドリルの速度を5000rpmまたは経験豊富な外科医の場合は7000rpmの低設定に設定します。すべての穴あけは、顕微鏡で視覚化しながら行います。
      2. ドリルを頭蓋骨の表面と平行に持ち、表面にそっと寄ります。
      3. ペダルを軽く踏んで、1か所で穴あけを開始します。短い間隔(5〜10秒)で穴あけを行い、骨の色の変化を頻繁にチェックします。
         注:骨は不透明な白から始まり、穴が深くなると半透明になり、ピンク色がかっています。
      4. 穴あけが脳に近づいたら、速度を落とし、穴に水分が浸透している兆候を探します。穴が濃いピンク色になり、わずかに光ったら、穴あけを止めます。短い30Gの針を使用して、残りの骨の層にそっと穴を開けます。透明な液体が新しい穴から湧き出るはずです。
   2. マウスの穴あけ手順
      1. 生理学的記録用の参照電極を配置するには、記録された領域に対して半球同側の前部にバリ穴を開けます。
      2. 開頭術の周囲に浅い溝を開けることにより、開頭術の輪郭を定義します。中外側軸では、外側の骨の隆起を基準として開始し、4 mmのウィンドウをトレースします。
      3. 前後軸に、後骨隆起の~1mm前方から3mmの窓を開けます。最終的な開頭開頭術のサイズは、約4 x 3 mmの窓です。
   3. ラットの穴あけ手順
      1. 2つの穴を開けます:1つは左の後部象限に、もう1つは右前方象限に。
      2. 2回目のリドカイン(10 mg / mLで0.4 mL / kg)を咬筋に注入し、カットを行う場所に均等に分配します。.
      3. 開頭術領域を露出させるのに必要な最小限の筋肉のセットのみを切除します。
      4. 新しい#10メスの刃を使用して、動物の顎の上の筋肉の束(右側)に横方向の背腹の切り込みを作成します。グリップ力のある鉗子で切り口の後端を持ち、頬骨の骨の隆起に沿って切り込みながら頭蓋骨から剥がします。このようにして、筋肉を最小限の出血で骨から切り離すことができます。
      5. 頭蓋骨の亀裂線が現れるまで、同様の方法で前筋を切除します。この線は、開頭術の窓の前方境界になります。
      6. メスと鉗子で後部隆起の周りから筋肉を澄まし、強力な光源を使用して高度に血管新生した領域に切り込むのを防ぎます。
      7. ドリルを使用して後尾根を削り、頭蓋骨の表面から浮かばなくなるまで削ります。
         注:この手順は、μECoGグリッドを下げて皮質表面と直接接触させるために不可欠です。
      8. 切除した筋肉が付着した尾根のすぐ上の窓の背側の端にドリルで穴を開けます。ドリルダウンされた後尾根の前方に後縁を配置します。眼窩の近くまで伸びる亀裂線の後方に前縁を配置します。
         注意: 前部の筋肉をきれいにするときは、目を避けるように注意する必要があります。
6. 開頭術用窓の穴あけ
   1. 開頭術の窓に穴を開ける(ヒント)
      1. 穴を開けるときは、ドリルビットが頭蓋骨の表面と平行に保たれていることを確認してください。ドリルをブラシのように使用して、ドリルが頭蓋骨に軽く接触できるようにしながら、目的の開頭線に沿って短く反復的な動きを使用しながら、できるだけ力を加えないでください。
         注:ラットでは、窓の後端に最も厚い骨があります。穴あけがしすぎると、骨が薄片状で「カリカリ」な品質を示し、穴あけの進行状況の測定が複雑になる可能性があります。誤って配置すると、この骨領域は静脈状の赤い色を示し、脳に近接しているという誤った印象を与える可能性があります。
      2. 開頭術の窓の両側にドリルで穴を開け、骨が淡いピンク色に見え、その長さに沿って細い白い亀裂または亀裂が走っています。軽い圧力をかけます。骨は、完全に穴を開けると、はっきりとした「小刻みに動く」はずです。亀裂がばらばらに見える場合は、連続した線が得られるまで軽く穴あけを続けます。
   2. 開頭術の窓の中で薄くなった頭蓋骨を取り除く
      1. 頭蓋骨が十分に薄くなり、非常に軽い圧力で窓全体が目に見えて小刻みに動くようになったら、薄くなった頭蓋骨を取り除きます。
      2. 開頭部位を生理食塩水で洗い流し、少なくとも1分待ちます。これにより、薄くなった骨が弱くなり、骨が硬膜から分離するのを助けます。余分な生理食塩水を吸収性の綿の三角形または掃除機で排出します。
      3. 鉗子を使用して薄くなった頭蓋骨を慎重に持ち上げ、下にある組織への損傷を避けます。
      4. 止血スポンジを使用して、脳を湿らせます。
      5. 歯付き鉗子で背側と腹側の窓をしっかりとつかみ、頭蓋骨から直接引き離します。窓をサイトから引き出すのが難しい場合は、骨が十分に弱くなるまで軽い穴あけを止めて再開します。
      6. マウスμECoG記録の場合は、硬膜をそのままにしておきます。
7. マウス用のセメントとヘッドポストインプラント
   1. 参照ワイヤを挿入して固定します。
      1. 銀線の端をバリ穴に~1mm挿入し、脳の表面に接触するのに十分な量ですが、出血を引き起こさないようにします。
      2. 最初の層を塗布しながら、歯科用セメントを所定の位置に塗布します。
   2. 歯科用セメントの調製
      1. 冷却したセラミックミキシングディッシュを使用して、歯科用セメント混合物を準備します。このセメントは急速に肥厚し、新しい混合物の定期的な調製が必要です。新しい混合物を準備する前に、ミキシングディッシュをきれいに拭いてください。
         注:セメントが脳に直接接触してはいけません。
   3. 第1層の適用
      1. マイクロアプリケーターを使用して、開頭術の周囲と頭蓋骨全体にセメントの最初の層を塗布します。この層は、頭蓋骨と金属製のヘッドバーとの間の電気絶縁として機能します。
      2. 開頭術をセメントで完全に囲み、横方向の被覆を含めて、開頭術とμECoGグリッドを適切に保護します。
   4. 金属製のヘッドバーの配置
      1. ヘッドバーの大部分をホルダーに完全に締めずに取り付けます。
      2. 必要に応じてヘッドバーを配置し、セメント表面と接触する頭蓋骨の正中線に沿って薄い部分を置きます。
   5. インプラントの固定
      1. ヘッドバーを歯科用セメントで覆い、セメント表面に接続します。
   6. ホルダーの取り外し
      1. 歯科用セメントが固まるまで数分待ちます。
      2. ヘッドバーが完全に固定されたら、最初にホルダーからネジを取り外してヘッドバーを取り外します。次に、ホルダーを後方に引っ込めて、ヘッドバーに力が加わらないようにします。
8. ラット手術のためのデュロトミー
   注:これは挑戦的な外科的ステップです。
   1. 硬膜の持ち上げ
      1. 5番鉗子を脳の表面とできるだけ平行に保持して、硬膜のごく一部を脳から持ち上げます。
      2. 新しい30Gの針(できるだけ短い)を使用して、持ち上げた硬膜を慎重に引き裂きます。
         注:硬膜は、脳の真上にある薄くて透明な組織の層です。ラットのμECoG記録では除去されます。脳の表面の血管系を乱すことなく硬膜切開術を行うことが重要です。硬膜切開術を実施するための推奨される方法には、鉗子と注射針を使用して硬膜を引っ張る前に硬膜に穴を開けること、または頭蓋骨の近くに固定されたデュラトームツールを使用して硬膜を慎重に引っ込めることが含まれます。
   2. 硬膜の切除
      1. 鉗子で硬膜をつかみ続け、脳から持ち上げます。持ち上げながら針で斜めの裂け目を作ります。
      2. 鉗子を使用して、硬膜を開頭窓の側面に向かって慎重に剥がし、脳の表面が乱されないようにします。
9. マウスを電気生理学的記録のためのセットアップに移す
   1. 切歯バーから鼻と切歯をそっと持ち上げてから、動物を引き戻して、動物を手術セットアップから取り外します。クロルプロチキセン(1 mg / kg、腹腔内[IP])を注入し、低濃度のイソフルランを使用して継続的な麻酔を維持できるようにする鎮静剤です。.
   2. マウスを電気生理学的記録セットアップに置きます。
      1. 加熱パッドが所定の位置にあり、適切に機能していることを確認します。
      2. 頭部固定は、電気生理学的セットアップでホルダーのヘッドバーを使用して動物を固定します。
      3. イソフルランマスクを近づけて、動物の鼻を完全に覆います。.
   3. 麻酔調整
      1. 麻酔レベルを徐々に0.7〜1%のイソフルランに下げます(5分ごとに最大0.5%ずつ刻み)。
      2. 動物の呼吸数と動きを監視します。
         注:呼吸数は手術状態に比べてわずかに増加するはずですが、動物は動いてはいけません。
      3. 動物が動いている場合は、すぐにイソフルラン濃度を2%に増やしてから、0.5%刻みでゆっくりと低いレベルに戻します。
   4. 感覚刺激のためのヒゲの挿入
      1. マウスの振動をウィスカ刺激装置に取り付けます。このプロトコルでは、9つのビブリッサを短い10μLピペットチップに挿入し、ビブリッサの迅速なたわみを提供する圧電アクチュエータに接続されます。

3. 録音

1. グリッドのインストール
   1. 事前の手順
      1. 録音システムとアンプの電源を入れます。
      2. 動物のバイタルサインを確認してください。
   2. プロシージャ
      1. 動物と道具の配置については、手順3.1.2.2-3.1.2.4に従います。
      2. 動物を記録セットアップに置き、生理食塩水を定期的に塗布して開頭術が湿ったままであることを確認します。
      3. ラットの場合は、マイクロマニピュレーターを開頭部位のかなり後ろにあるリグの手すりに配置して、干渉を避けます。
      4. マウスの場合は、マイクロマニピュレーターを開頭部位に対して横方向に配置し、動物と並べます。
      5. マウスにグリッドをアタッチして配置するには、手順 3.1.2.6 から 3.1.2.12 に従います。
      6. μECoGグリッドをヘッドステージに取り付けますtage ZIFクリップコネクタ(ヘッドステージコネクタ)を使用します。ヘッドステージの電子ボードを、マイクロマニピュレーターに固定されたメカニカルバーで固定します。
      7. μECoGグリッドを水平に下げて、前後軸に沿って開頭術上に平らに整列させます。
         注:外側-内側軸に沿って、グリッドの端は開頭術の内側境界の近くになければなりません。
      8. グリッドが脳の近くに配置され、脳と接触していない場合は、グリッドの参照ワイヤーを埋め込まれた銀線-金ピンに取り付けます。必要に応じて、アース線を動物(覆っていない筋肉など)に取り付けて、電気ノイズを減らします。
      9. さらに、グリッドを下げて脳に接触させます。
      10. グリッドを横方向に動かして、湿った硬膜の表面を「滑るように」します。グリッドが中外側の軸に沿って中央に配置されるまで調整を続けます。
      11. 開頭術の縁の周りに吸引または外科用スポンジを使用して、余分な生理食塩水を取り除きます。
      12. 準備が少し乾いたら、グリッドが硬膜によりしっかりと接着し、その表面を滑らないようにします。乾燥している場合は、フレキシブルグリッドに横方向から内側への動きを適用し、最も横方向の電極との接触を確保します。グリッドのフレキシブルケーブルは、脳の輪郭に合わせて自然に曲がります。
      13. グリッドをラットに配置するには、手順3.1.2.14-3.1.2.18に従います。
      14. 保持フォークのステムをマイクロマニピュレーターに固定し、グリッドのコネクタボードが下がったときに開頭窓の後側に浮かぶことを確認します。
      15. グリッドが開頭部位のほぼ上に来るように、手すり上のマイクロマニピュレーターの位置を調整します。グリッドが脳の表面のすぐ上に浮かぶまでグリッドを下げます。少量の生理食塩水で脳の表面を湿らせます。
      16. 顕微鏡を使用してこれらの手順を実行します。マイクロマニピュレーターのダイヤルを使用して、開頭術の中心にある脳表面に対して平らになるまでグリッド位置を調整します。
      17. グリッド自体に触れずに、吸収性のコットントライアングルを使用して慎重に湿気を逃がします。グリッドのすべての行が脳の表面に接触していることを確認します。
          注:水分を除去すると、皮質表面とグリッドの間の流体を介した電気信号の受動的な拡散が防止され、電極で感知された信号が空間的に拡散します。
      18. 2番または5番の鉗子を使用して、グリッド接地線を同じバリ穴に挿入するか、参照ワイヤをバリ穴に挿入し、アース線を近くの筋肉組織に挿入します。
          注:ワイヤーは、脳に接触するのに十分な~1mmのみ挿入する必要がありますが、脳に出血や外傷を引き起こさないようにする必要があります。
2. グリッドの位置を確認する
   1. 電気生理学的活動のモニタリング
      1. 記録ソフトウェアを使用して電気生理学的活動を観察します。光麻酔下では、脳信号は変動し、さまざまなパターンを示すことがあります。
      2. グリッド線、リファレンス線、およびアース線を適切に接続すると、信号振幅がmVの範囲にある高い信号対雑音比が得られるはずです。Trodes(100〜6000 Hzなど)によるバンドパスフィルタリングを使用して高周波範囲のノイズを監視し、ノイズが数十マイクロボルト(μV)を超えないようにします。
   2. ノイズ(例:手を叩く、指を鳴らす)を使用して感覚反応性を評価し、目に見えるイベント関連の皮質表面電位(CSEP)を誘発します。
      注:単一のウィスカーの刺激は、わずか数チャネルで明確で鋭いイベント関連のCSEPを呼び起こすはずです（マウス〉。
   3. グリッド位置の検証
      1. ラットの場合は、グリッドが聴覚皮質の上に正しく配置されていることを確認してください。記録される最初のブロックは、通常、グリッドが脳からの適切な応答を記録することを確認するために設定された60秒のホワイトノイズ刺激であるべきです。ポリトロードを挿入する前にのみグリッドを使用してホワイトノイズとトーンの診断録音を行い、グリッドが正しく配置されたかどうか、および信号応答があるかどうかを判断します。
      2. マウスの場合、グリッドの配置を確認するには、350 ミリ秒間隔で 20 から 30 のウィスカ偏向でクイック マッピング セッションを実行します。Trodes を使用して局所電界ポテンシャル (LFP) バンドの活動を記録し、カスタム MATLAB コードを使用してオフラインで解析し、ウィスカー誘発活動の空間範囲を可視化します。
   4. リポジショニング
      1. グリッドの調整が必要な場合は、グリッドの上に生理食塩水を滴垂らして皮質表面を湿らせます。
      2. グリッドを持ち上げる前に、生理食塩水を30秒から1分間放置します。
      3. グリッドを慎重にゆっくりと持ち上げます。
      4. 手順3.1で説明されている手順を使用して、位置を変更します。
3. ラットの層流ポリトロード
   1. Polytrodeのセットアップ
      1. まず、ヘッドステージアダプターをポリトロードの裏側に接続します。コネクタをアダプタのボード上の3番目のチャネルセットにクリップします。クリップの黒いマークがポリトロードのビジネスエンドの右側を向いていることを確認します。
   2. ポリトロード挿入
      1. ポリトロードを脳に挿入し、最後の(一番上の)電極が皮質表面の上に見えるようにします。ゆっくりとした降下(1μm/sまで)すると、信号品質が向上します。15分待って、脳が多角形の存在に順応するのを待ちます。
      2. 15分後、最後の電極が皮質表面に入ったかどうかを確認します。そうでない場合は、ポリトロードを少し下げて、さらに10分待ってから続行します。
4. マウスへのオプトジェネティック光源の位置決め
   1. 多関節アームに取り付けられた3次元の微調整ネジシステム、または光ファイバーホルダーを取り付けるためのマイクロマニピュレータのいずれかを使用します。
   2. 光源をガイドし、ファイバーの位置決めを支援するために、光遺伝学的光を低強度でオンにします。多関節アームを使用して、光遺伝光をターゲット領域に向けて大まかに配置します。
   3. マイクロマニピュレーターまたは微調整ネジを使用して、ファイバーの位置に焦点を合わせて微調整します。
5. 信号の記録
   1. 準備
      1. 電気干渉を減らすために、外科用リグの不要なライト、延長コード、およびサージプロテクタをすべて取り外します。リグのオーバーヘッドライトをオフにします。
      2. 実験を開始する前に、隔離された記録スペースのドアと手術室のドアを閉めてください。
   2. 買収開始
      1. ラットの場合は、録音プラットフォーム/コンピューターでSynapseを起動し、信号をプレビューして確認することにより、取得が機能していることを確認します。μECoG信号に大きくて鋭い過渡電圧を誘発するために、動物の近くに刺激を与える、つまり拍手をします。
      2. マウスの場合は、Trodesでレコーディングセッションを開始します。
   3. 水酸化
      1. 脱水症を防ぐために、記録中に1〜2時間ごとにそれぞれ1mLまたは0.1mLの生理食塩水をラットまたはマウスに皮下注射します。.ラットの場合は、生理食塩水を投与してから5〜10分待ってから、新しい記録ブロックを実行します。
   4. 刺激セット
      1. ラットの場合、記録部位を確認したら、必要な刺激セットの記録に進みます。セットの例には、次のようなものがあります
         ホワイトノイズ(60秒)
         トーン診断 (5 分)
         ピュアトーン (23分)
         ダイナミックムービングリップル
         トーン150 (15分)
         ティミット (38分)
      2. ラットの場合、グリッドの位置を変更するたびに、ホワイトノイズとトーンの診断を再表示します。
      3. マウスの触覚刺激:試行構造で触覚刺激を提供し、各試行には350ミリ秒ごとにランダムなひげのたわみの列が含まれています。この例では、各試行には 4500 ミリ秒にわたって提示された 14 個の変形が含まれています。
      4. マウスの光遺伝学的刺激:一部の試験では、試験期間全体(5秒)にわたって光遺伝光の方形パルスを適用します。使用するオプシンと、光透過率の推定値を使用して到達する組織の深さに基づいて、必要な光レベルを決定します(https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php)
6. クリーンアップ
   1. グリッドの持ち上げと清掃
      1. 録音が終了したら、録音ソフトウェアを閉じて、リグに光源を再接続します。
      2. 脳が乾燥している場合は、注射器を使用して脳の表面に生理食塩水を少量垂らします。グリッドを持ち上げる前に、生理食塩水を30秒から1分間放置します。
      3. 顕微鏡下で作業し、マイクロマニピュレータを使用してグリッドを脳表面からそっと持ち上げます。
      4. グリッドを持ち上げるときに追加の力が必要な場合は、カーボン先端の鉗子(閉じた状態)を使用して、グリッドを脳からそっと持ち上げます。マイクロマニピュレーターの動きがわずかに前方にあることを確認して、グリッドを脳の表面からそっと剥がします。
      5. グリッドが完全に取り外されたら、グリップフォークからグリッドを取り外し、手順3.6.1.6-3.6.1.7に従って清掃します。
      6. グリッド(コネクタボードを除く)を希釈した酵素洗剤(50%エンゾール、50%蒸留水)に少なくとも1時間浸します。その後、純粋な蒸留水の2回目の浴に移し、安全で清潔な場所で風乾させます。
      7. グリッドの領域に血液や組織が堆積している場合は、酵素溶液に浸した綿の三角形を使用して、優しくきれいに拭きます。
      8. 乾いたら、グリッドを箱に戻します。
   2. 動物を安楽死させる
      1. マウスの場合は、動物を頭部固定から外し、安楽死チャンバーに入れます。5 mLのイソフルランを含むガーゼを追加し、呼吸停止後60秒待ちます。.離脱反射の欠如を確認し、鋭利なハサミを使用して首を切る。
      2. ラットの場合は、0.2 mLのペントバルビタールIPを注入します。.呼吸が止まってから60秒待ってから、動物を仰向けに寝かせ、#11ブレードを使用して二重開胸術を行います。
   3. 機器の清掃
      1. すべての手術器具を実験室の流し台に持って行き、手術用タオルの上に置きます。ツールに10%漂白剤溶液をスプレーし、シンクでよく洗います。汚れた工具の場合は、洗う前に漂白剤溶液に浸してください。
      2. または、粉末洗剤(Contrex APなど)を水と一緒に使用して、シンクのブラシで器具をこすります。
      3. 工具がきれいに洗い流されたら、アルコールワイプで拭き取り、収納スペースに戻します。
   4. ワークスペースのサニタイズ
      1. 使用済みの針と刃物はすべて鋭利物容器に捨ててください。
      2. 汚染された綿棒、三角形、アルコールワイプはバイオハザードバッグに捨ててください。
      3. 作業スペースを閉じる前に、リグルームのすべての作業面をアルコールで拭き、すべての機器を清掃してください。

結果

私たちは、光遺伝学的方法および層流記録と組み合わせた皮質電気信号を記録するためのプロトコルについて説明しました。ここでは、マウスの体性感覚皮質(図1、 図2、 および図3)および感覚刺激に応答してラットの聴覚皮質内(図4、 図5、 および図6)から得られる典型的な信号を示します。

図1:マウスウィスカ...

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、高密度微小皮質電図法(μECoG)アレイを層流プローブおよび光遺伝学的手法と統合することを可能にします。げっ歯類モデルでのこのプロトコルの使いやすさは、皮質ダイナミクスの調査のための強力なツールとなり、被験者の数を簡単に増やすことができます。高密度のμECoGグリッドは、マウスやラットの複数の領域にわたる皮質トポグラフィーの効率的で空間的に正確なマッピングを可能にし、脳組織におけるトポグラフィー表現の重要な役割を活用する³³。層流記録の追加により、複数の空間的および時間的スケールにわたる皮質ダイナミクスの調査が可能になります。オプトジェネティクスを含めることで、因果操作が可能になり、特定の神経集団と、皮質表面誘発電位(CSEP)および皮質処理³⁴へのそれらの寄与との間の関係を決定することができる。

オプトジェネティクスは、特定のニューロン集団の選択的な調節を可能にし、皮質活動パターンの生成にお...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
使い捨て #11 ブレード	Swann Morton	303	1 個 外科手術用
使い捨て #10 ブレード	Swann Morton	3901	外科手術用
30 mm ケージ バー	Thorlabs	ER	ケージ コンポーネント
30 mm ケージ プレート	Thorlabs	CP33T	を保持
70% エタノール	Decon Labs	V1016	洗浄/消毒剤(70%に希釈)
アマルガムボンド PLUS 調整可能な精密アプリケーター ブラシ ティール 200/Bx	ヘンリー・シャイン	1869563	セメント用精密アプリケーター
アマルガムボンド PLUS 触媒 0.7 mL シリンジ Ea	ヘンリー・シャイン	1861119	セメント成分
アンプ (タッカー・デイビス・テクノロジーズ)	タッカー・デイビス・テクノロジーズ	PZ5M-512	聴覚刺激と録音に使用ソフトウェア。
関節アーム	調整スクリューシステムを保持するための	ノガ	DG60103
集光用の非球面レンズ(および光を集束させるためのレンズ1つ)	LED光を収集するための	Thorlabs	ACL25416U-B
聴覚機器	Tucker-Davis Technologies、Sony、Cortera	RP2.1 Enhanced Real-Time Processor/HB7 ヘッドフォンドライブ	聴覚刺激および録音ソフトウェアに使用されます。
ブプレノルフィン	滅菌製品LLC	#42023017905	一般的な鎮痛剤
C&。B メタボンドベースセメント Ea	Henry Schein	1864477	セメント成分
C&B メタボンド L パウダー セメント クリア 3 g	Henry Schein	1861068	メント成分
クロルプロチキセン(マウス)	シグマアルドリッチ	猫いいえ。C1671	鎮静の場合は、同日に準備し、4
カスタム設計の 128 チャネルマイクロ皮質電図検査 (μECoG) グリッド	ニューロネクサス	E128-200-8-40-HZ64	神経生理学の記録用。皮質に置かれます。
デンゴフォームゼラチンスポンジ	デンゲン歯科	用600034(SKU)	は、乾式または湿式で使用でき、滅菌塩化ナトリウム溶液で飽和できます
ドリルビット、サイズ5〜9(マウス)	ファインサイエンスツール	19007-XX	XXは、ドリルビットのサイズ(例:05または09)です。マウス処置用
ドリルビットスチールラウンドバー(5.5 mm/7.5 mm)	LZQツール	デンタルバードリルビット ステンレス鋼バー	ット処置用
Dumont No.5鉗子	ファインサイエンスツール	11251-10	外科手術用
Dumontピンセット#5曲げ45度;	頭手術窓を除去するための	世界精密機器	14101
DVD プレーヤー (ソニー)	ソニー	CDP-C345	刺激セットの受け入れと再生に使用されるシステム
静電スピーカー	ソニー	XS-162ES	聴覚刺激および録音ソフトウェアに使用されます。リグ内に設置され、鎮静されたげっ歯類に音を鳴ら
酵素洗剤(エンゾール)	高度な滅菌製品	2252	洗浄/消毒剤
エバーエッジ 2.0 スケーラー 鎌 ダブルエンド H6/H7 #9	蓋骨をこすり洗うための	ヘンリー・シャイン	6011862
ファイバー端
ゴールドピン	Harwin Inc	G125-1020005	マウスの接触基準に使用 銀線にはんだ付け
リップ鉗子	ファインサイエンスツール	00632-11	外科手術用
イソフルラン	Covetrus	11695067772	化器が必要
ケタミン (塩酸塩注射) (ラット)	Dechra	17033-101-10	麻酔/鎮痛
LED	新エネルギー	LED XLAMP XPE2 BLUE STARBOARD	青色 LED 光源
LED ドライバー	Thorlabs	LEDD1B	LED ドライバー
リドカイン	Covetrus	VINB-0024-6800	生理食塩水で 1% に希釈
メロキシカム	Covetrus	6451603845	一般的な鎮痛に使用される抗炎症剤
マイクロマニピュレーター	Narishige (Stereotacic Rig)	SR-6R +SR-10R-HTコンポーネント	ECoGとげっ歯類を細かい動きで操作するために使用
No.2鉗子	インサイエンスツール	91117-10	外科手術用
No.55鉗子	インサイエンスツール	1129551	外科手術用
Ophtalmic潤滑剤(人工涙液)	Akorn	17478-062-35	外科手術
中の乾燥から目を保護するために使用されます光ファイバー200µm コア径	Thorlabs	M133L02	FC/PC コネクタ 長さ 2 m
トバルビタール (ラット)	Covetrus / Dechra	VINV-C0II-0008	麻酔/鎮痛薬
プラチナ ブラック	シグマ	205915-250MG	神経生理学記録用 (&mu の接点の電気めっきに使用されます。ECoG グリッド)。
ポビドンヨウ素10%	ベタジン	https://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/	カタログ番号なし(小売ではありません)
粉末洗剤(Contrex AP)	Decon Labs	5204	/消毒酸素
チューブULINE用プレカットテープ	さまざまなプロバイダー)	S-14726	っ歯類定位固定装置のノーズコーンに酸素チューブを取り付けるために使用メ
スハンドル#3	World Precision Instruments	500236-G	ブレード用 #10、#11、#15
レーパー	ファインサイエンスツール	1007516	外科手術用
短い 30 G 針	ExelInt	26437	外科手術および注射用
銀線	ワーナーインスツルメンツ	63-1319	神経生理学記録用 (接地および参照電極として使用)。
滅菌生理食塩水(注射用0.9%塩化ナトリウム)	ホスピラ	00409-7101-67 (NDC)	注射剤の希釈、体液の置換用
ストールティング・ホプキンス・ブルドッグ	・ファイン・サイエンス・ツールズ	10-000-481	外科手術用
表面消毒剤(カバレッジプラスNDP消毒剤)	ステリス・ライフサイエン	638708	洗浄/消毒剤
TDT ZIF-クリップコネクター取得のために。	Tucker-Davis Technologies	ZIF-Clip アナログヘッドステージ	ECoGと外部収集機器を接続
2本爪ホールディングフォーク	Tucker-Davis Technologies	Z-ROD128	TDTクリップとマイクロマニピュレーターの接続に使用
ラジン(ラット)	Covetrus	1XYL006	麻酔/鎮痛剤