Method Article

カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出

DOI:

10.3791/68037

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June 13th, 2025

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1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

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このプロトコルは、DNAキャプチャビーズ精製と組み合わせたビーズビード精製により、 結核菌 サンプルからDNAを抽出するための迅速かつ一貫した方法を提供し、次世代シーケンシングアプリケーションに効果的な選択肢となることを示しています。

Abstract

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結核は致命的な病気であり、原因菌である 結核菌に抗生物質耐性が出現すると、治療成績が悪化します。シーケンシング技術による正確かつ迅速な薬剤耐性の特定は、カスタマイズされた治療レジメンを通じて結核患者の転帰を改善するために必要です。DNA抽出法は、下流の分子アッセイに不可欠であり、 マイコバクテリウムの強固な細胞壁、多くの臨床サンプルの低バシラリー負荷、および喀痰マトリックスの複雑さによって複雑になります。 結核菌 のDNA抽出法は数多く報告されていますが、現在のところゴールドスタンダードはありません。さらに、これらの方法のうち、一貫して機能することが示されているものはほとんどなく、多くは低資源で高負荷の結核の状況には適していません。その結果、ラボでは独自の手順変更が頻繁に導入され、分析法のばらつきが大きくなっています。ここでは、臨床喀痰と培養物の両方からマイコバクテリアDNAを抽出するための費用対効果が高く、迅速で標準化されたプロトコルを提示します。これにより、qPCRに適したDNAが生成され、臨床診断ラボでの使用を検討すべきです。

Introduction

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薬剤耐性結核(TB)の検出には、標的次世代シーケンシング(NGS)や全ゲノムシーケンシング(WGS)を用いて、 結核菌 から高品質なDNAを抽出する必要がありますが、見落とされがちです。私たちは、Deeplex-MycTB(GenoScreen)や全ゲノムシーケンシングなどの標的NGSアプローチを含む、臨床NGSアプリケーションのための一貫性のある高品質のDNAを提供するための標準化されたプロトコルを開発しました。これには、現在、世界保健機関(WHO)が薬剤耐性結核の診断に推奨しています。特に、WHOはこれらのNGSベースの診断戦略を推奨していますが、それらをサポートする特定のDNA抽出プロトコルは指定していません。私たちの方法は、WHOが承認した検査だけでなく、高品質のマイコバクテリアDNAを必要とする新しい技術にも使用できます。

抽出の課題は、結核菌のユニークな細胞壁に起因しており、ミコール酸と脂質で構成されているため、突破が非常に困難です。現在公開されている抽出溶液は、溶解法(超音波処理、化学法、加熱法、ビーズビーティング法など)およびDNA抽出法(フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿法、CTABベースおよびカラムおよびビーズベースの方法など)に大きなばらつきがあり、その結果、DNAの収量、純度、および品質に違いが生じます<....

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Protocol

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この研究は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)で、施設内バイオセーフティ委員会(BUA #BU198320-01GBUA/BABB)の承認の下で実施され、UCSFの研究倫理ガイドラインに従っています。私たちは、IRBが承認した同意免除プロトコルに基づいて、ディスカバリーライフサイエンスが非結核呼吸器疾患を持つ個人から収集した残りの喀痰サンプルを入手しました。

1. バッファーの調製

  1. カスタムTritonバッファー(表1):100 mLのカスタムTritonバッファーを調製するには、まず2 mLの5 M NaCl、1 mLの1 M Tris-HCl(pH 8)、1 mLのTriton X-100、および0.2 mLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を組み合わせます。超純水を加えると、総容量が100mLになります。使用前にフィルター滅菌してください。最終的なバッファーには、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、および1 % Triton X-100が含まれています。
  2. 低EDTA TE(表2):100 mLの低EDTA TEバッファーを調製するには、1 mLの1M Tris-HCl(pH 8)と0.02 mLの0.5 M EDTAを組み合わせます。超純水を加えると、総容量が10....

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Results

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我々は、培養 された結核菌 と 結核菌 のスパイク喀痰サンプルの両方でDNA抽出プロトコルを試験した(各条件でn = 3)。培養 した結核菌 H37Rv mc² 7901を用いて、50μLあたり8.4×106 細胞にインプットを標準化しました。これは、200GUでMGIT培養物1mLに相当します。喀痰実験では、非結核呼吸器疾患(市販)の患者からプールした1 mLの喀痰に2つの異なる細菌濃度(50,000、約1+の喀痰塗抹グレード、および10,000桿菌、約わずかな喀痰塗抹グレード)でスパイクして、さまざまな細菌負荷に対するこの方法の性能を評価しました。

当社は、単一コピー遺伝子を標的とするカスタム TaqMan qPCR を使用して DNA 収量を評価しました(図 2)。純粋な培養物やスパイクした喀痰を含むすべてのサンプルで結 核菌 DNAを検出し、複製間の変動はほとんどありませんでした。しかし、わずか10,000個の細胞でスパイ.......

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Discussion

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この研究では、下流の分子アプリケーションとNGSアプリケーションのための磁気ビーズクリーンアップによるビーズビーティングを使用して高品質の 結核菌 DNAを抽出するための堅牢で検証済みのプロトコルを紹介します。

この方法には、既存の 結核菌 DNA抽出プロトコルに比べていくつかの利点があります。従来のフェノール-クロロホルム抽出には通常数日かかり、危険な化学物質が導入されますが、この方法では60分以内に完了し、有害廃棄物は最小限に抑えられます。このアプローチにより、試薬の調達に柔軟性がもたらされ、バッファーは複数のベンダーから購入することも、社内で調製することもできるため、単一のサプライヤーへの依存を減らすことができます。磁気ビーズ自体でさえ、中程度の複雑さの実験室で合成することができる20。市販のビーズはより高い収率を提供する可能性がありますが、この方法は適応性が高いため、ラボは性能を維持しながらコストを最適化することができます。.......

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Disclosures

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著者は何も開示していません。

Acknowledgements

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R01AI153213 国立アレルギー感染症研究所(NIAID)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 mm ジルコニア ケイ酸塩ビーズバイオスペック製品11079101zマイコバクテリア細胞を溶解するためのビーズビートステップに使用されるビーズ
AMPure XPビーズベックマン・コールターA63880溶解後のDNAクリーンアップ用磁気ビーズ
EDTA(0.5M、pH 8.0) サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9260GカスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント
ファストプレップ 24MPbio, アメリカ1160045006.5 m/sのビードビート用装置
フォワードプライマーサーモフィッシャーサイエンティフィックカスタム合成プライマー配列:AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O(水、分子生物学グレード)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP2819-1カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント
ルナユニバーサルプローブニューイングランドバイオラボM3004マイコバクテリアDNA計数用qPCR試薬
MycoPrepキットBDのSKU/REF 240863NALC-NaOH喀痰処理のためのBD MycoPrep検体消化
NaCl(塩化ナトリウム、5M溶液)サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9759カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント
PBSのミリポアシグマP2272喀痰処理
リバースプライマーサーモフィッシャーサイエンティフィックカスタム合成プライマー配列:GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqManプローブサーモフィッシャーサイエンティフィックカスタム合成プローブシーケンス:AGGAGGAACACCGGTGGCGA
トリス-HCl(1M、pH 8.0)サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9855GカスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント
トリトンX-100サーモフィッシャーサイエンティフィック28314カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  2. George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.

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