このプロトコルは、DNAキャプチャビーズ精製と組み合わせたビーズビード精製により、 結核菌 サンプルからDNAを抽出するための迅速かつ一貫した方法を提供し、次世代シーケンシングアプリケーションに効果的な選択肢となることを示しています。
方法論記事
カスタムバッファーでのビーズビーティングとそれに続く NGS ワークフローを使用したマイコバクテリア DNA 抽出
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
結核は致命的な病気であり、原因菌である 結核菌に抗生物質耐性が出現すると、治療成績が悪化します。シーケンシング技術による正確かつ迅速な薬剤耐性の特定は、カスタマイズされた治療レジメンを通じて結核患者の転帰を改善するために必要です。DNA抽出法は、下流の分子アッセイに不可欠であり、 マイコバクテリウムの強固な細胞壁、多くの臨床サンプルの低バシラリー負荷、および喀痰マトリックスの複雑さによって複雑になります。 結核菌 のDNA抽出法は数多く報告されていますが、現在のところゴールドスタンダードはありません。さらに、これらの方法のうち、一貫して機能することが示されているものはほとんどなく、多くは低資源で高負荷の結核の状況には適していません。その結果、ラボでは独自の手順変更が頻繁に導入され、分析法のばらつきが大きくなっています。ここでは、臨床喀痰と培養物の両方からマイコバクテリアDNAを抽出するための費用対効果が高く、迅速で標準化されたプロトコルを提示します。これにより、qPCRに適したDNAが生成され、臨床診断ラボでの使用を検討すべきです。
概要
薬剤耐性結核(TB)の検出には、標的次世代シーケンシング(NGS)や全ゲノムシーケンシング(WGS)を用いて、 結核菌 から高品質なDNAを抽出する必要がありますが、見落とされがちです。私たちは、Deeplex-MycTB(GenoScreen)や全ゲノムシーケンシングなどの標的NGSアプローチを含む、臨床NGSアプリケーションのための一貫性のある高品質のDNAを提供するための標準化されたプロトコルを開発しました。これには、現在、世界保健機関(WHO)が薬剤耐性結核の診断に推奨しています。特に、WHOはこれらのNGSベースの診断戦略を推奨していますが、それらをサポートする特定のDNA抽出プロトコルは指定していません。私たちの方法は、WHOが承認した検査だけでなく、高品質のマイコバクテリアDNAを必要とする新しい技術にも使用できます。
抽出の課題は、結核菌のユニークな細胞壁に起因しており、ミコール酸と脂質で構成されているため、突破が非常に困難です。現在公開されている抽出溶液は、溶解法(超音波処理、化学法、加熱法、ビーズビーティング法など)およびDNA抽出法(フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿法、CTABベースおよびカラムおよびビーズベースの方法など)に大きなばらつきがあり、その結果、DNAの収量、純度、および品質に違いが生じます1,2,3,4,5,6,7,8 、9、10、11、12、13、14、15、16。さらに、研究グループが同じDNA抽出方法を使用することはめったになく、成功の測定方法が異なることがよくあります。これにより、最適なアプローチは分子アプリケーションの種類に依存するため、どの方法が最も効果的かを判断するのが難しくなります。例えば、ロングリードシーケンシングを用いて喀痰中の結核菌の構造変異を解明するには、rpoBの小さな領域のみを標的とする有料の診断ツールを実行するよりも、より高品質なDNAとより正確なポリメラーゼが必要です。DNA抽出の成功をさらに複雑にする要因はいくつかあります。抽出できるDNAの量は、サンプルの種類、存在する細菌の数、およびプロセスを妨害する物質(共抽出された非マイコバクテリアDNAおよびPCR阻害剤)があるかどうかによって異なります。ラボの技術者がピペットをどれだけ正確に使用するかなどの技術的な側面でさえ、結果に影響を与える可能性があります。現在の方法では、臨床現場でよく遭遇する細菌負荷が低いサンプルや高レベルの汚染DNAのサンプルを処理する場合、不十分であることがよくあります17,18,19。
カスタムバッファーでのビードビークティングとそれに続くビードクリーンアッププロトコルは、他の方法に比べて大きな利点があります。これは、オペレーターに依存する変異の機会を減らし、ダウンストリームのNGSアプリケーションのDNA完全性を維持するシンプルで迅速なワークフローです。この標準化されたアプローチは、WHOが推奨するNGS薬剤耐性アッセイおよびすべてのWGSアプリケーションを使用して、信頼性と再現性のある結果を求める臨床検査室に特に適しています。
プロトコル
この研究は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(UCSF)で、施設内バイオセーフティ委員会(BUA #BU198320-01GBUA/BABB)の承認の下で実施され、UCSFの研究倫理ガイドラインに従っています。私たちは、IRBが承認した同意免除プロトコルに基づいて、ディスカバリーライフサイエンスが非結核呼吸器疾患を持つ個人から収集した残りの喀痰サンプルを入手しました。
1. バッファーの調製
- カスタムTritonバッファー(表1):100 mLのカスタムTritonバッファーを調製するには、まず2 mLの5 M NaCl、1 mLの1 M Tris-HCl(pH 8)、1 mLのTriton X-100、および0.2 mLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を組み合わせます。超純水を加えると、総容量が100mLになります。使用前にフィルター滅菌してください。最終的なバッファーには、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、および1 % Triton X-100が含まれています。
- 低EDTA TE(表2):100 mLの低EDTA TEバッファーを調製するには、1 mLの1M Tris-HCl(pH 8)と0.02 mLの0.5 M EDTAを組み合わせます。超純水を加えると、総容量が100mLになります。最終的なバッファーには、10 mM Tris-HCl と 0.1 mM EDTA が含まれています。
2. 溶解チューブの調製
- メスの刃を使用して、変曲点のすぐ下にある1.5mLのスクリューキャップチューブの底を慎重に切り取ります。
- P1000の先端から先端を切り取り、端近くでV字型のくさびを切り、その中に準備したスクリューキャップチューブの底をくさびで留めます。スクープの図については、 図 1 を参照してください。
- 滅菌容器(リザーバーやシャーレなど)に0.1 mmのジルコニア-ケイ酸塩ビーズを入れ、準備したスコップを使用して、1スクープのビーズ(~200 mg)を1.5 mLのスクリューキャップチューブに分配します。
図1:社内のビーズ配布スクープ。 このスコップは、~200 mg の 0.1 mm ジルコニウムビーズを処理チューブに簡単に移すことができるように設計されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. インプットの準備
注:すべてのサンプル調製は、施設のバイオセーフティプロトコルに従って実施する必要があります。エアロゾルへの曝露のリスクを最小限に抑えるために、感染性物質をクラスIIバイオセーフティキャビネット(BSC)内で取り扱うことを強くお勧めします。
- 細菌細胞培養
- 結核菌培養物(MGITまたは濁液培養物)を15 mLの円錐形遠心チューブに~5 mLを最高速度(≥ 3,000 x g)で10分間遠心分離します。
- 10 mLの血清ピペットを使用して、ペレットを乱さずに~500 μLの上清を除くすべてを慎重に取り除きます。ペレットを乱さずに、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。
- ピペッティングを上下させて、ペレットを350 μLのカスタムTritonバッファーに再懸濁します。必要に応じて(つまり、BSL-3の外部で処理するためにサンプルを除去する場合)、標準の操作手順に従ってサンプルを不活性化します。
- 喀痰の準備
- 1〜5 mLの喀痰サンプル(自発的または誘発)を滅菌済みの50 mL遠心分離チューブに移します。
- DTT液化
- 4容量の100 mMジチオスレイトールを喀痰サンプルに加えます(容量は異なる場合があります)。市販の試薬を使用する場合は、メーカーの希釈手順に従ってください。
- 30秒間徹底的に渦巻きます。室温(20-25°C)で7分間インキュベートします。再び30秒間渦巻きます。
- 手順3.3.1を繰り返します。および 3.3.2.1x、非常に粘性のあるサンプルの場合、最大5回のインキュベーションボルテックスサイクルを実行します。
- 最高速度(≥3,000× g)で10分間遠心分離します。10 mLの血清ピペットを使用して、上清の~500 μLを除くすべてを慎重に廃棄します。ペレットを乱さずに、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。
- ペレットを350 μLのカスタムTritonバッファーに再懸濁します。
- NALC-NaOH液化
- NALC-NaOH溶液を調製するには、調製と希釈について製造元の指示に従ってください。
- 喀痰サンプルに4容量のNALC-NaOH溶液を追加します(自発的または誘導的、容量は異なる場合があります)。
- 30秒間渦巻きます。室温(20-25°C)で7分間インキュベートします。手順 3.4.1 と 3.4.2 を繰り返します。1倍です。非常に粘性の高いサンプルの場合は、最大5回のインキュベーションボルテックスサイクルを実行します。
- 50mLのマークにPBSを加えます。渦を少し混ぜます。最高速度(≥3,000× g)で10分間遠心分離します。
- 50 mLの血清ピペットを使用して、~500 μLの上清を除くすべての上清を慎重に廃棄します。ペレットを乱さずに、P1000ピペットで残りの上清を取り除きます。
- ペレットを350 μLのカスタムTritonバッファーに再懸濁します。必要に応じて(つまり、BSL-3の外部で処理するためにサンプルを除去する場合)、標準の操作手順に従ってサンプルを不活性化します。
4. DNAの抽出
- 不活化細菌懸濁液(ステップ3から350μL)を、~250 μLの0.1 mmジルコニア-ケイ酸塩ビーズを含む新しい標識済みの1.5 mLスクリューキャップチューブに移します。
- Beadは、6.5 m/sでライセートを45秒間打ち負かし、実行の間に2分間の休憩を挟みました。合計3回のビーズ叩きサイクルを繰り返します。
- 最高速度 (≥ 12,000 x g) で 2 分間遠心分離し、上清 150 μL を新しい標識チューブに移します。ビーズや細胞の破片を移さないように注意してください。
- クリーンアップ磁気ビーズを室温まで30分間平衡化させ、使用前に完全に再懸濁するように完全にボルテックスします。
- 180 μL (1.2倍容量) のクリーンアップ磁気ビーズを加え、ピペッティングで 10 回上下させて混合します。室温で2分間インキュベートします。
- 磁気ラックに置き、溶液がクリアするのを~2分間待ちます。P200ピペットを使用して、磁気ビーズを乱さないように上清を慎重に廃棄します。
- チューブを磁気ラックに置いたまま、調製したばかりの70 % (v / v) エタノール 500 μL を加え、反対側のチューブ壁に沿って磁気ビーズに分注します。30秒待ちます。
- 手順4.5を繰り返します。- 4.7.合計2回の洗浄。最後の洗浄が終わったら、P10ピペットで残留エタノールを取り除きます。ビーズを短時間~2分間乾燥させます。
- ビーズペレットが不透明になった直後に、チューブを磁気ラックから取り出し、20 μL の Low EDTA Tris Buffer に再懸濁します。ビーズが乾燥してひび割れないようにしてください。
- ピペッティングまたはボルテックスで混合し、すべてのビーズが溶液中にあることを確認します。室温で5分間インキュベートします。
- マグネットラックに置き、溶液が透明になるのを~2分間待ちます。溶出したDNAを新しいウェルラベルチューブに移し、ダウンストリーム分析を行います。抽出したDNAを<20 μLで吸引し、磁気ビーズのキャリーオーバーを回避します。
5. マイコバクテリアDNAのqPCR列挙
- マイコバクテリア atpE (Rv1305) の 99 ヌクレオチドを標的とする定量的 PCR を使用してマイコバクテリア DNA を定量するには、5 μL のユニバーサルプローブマスターミックス (2x)、フォワードプライマー (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3'、10 μM) の各 0.4 μL、およびリバースプライマー (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3'、10 μM)、0.2 μL の TaqMan プローブ (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3') を含む 1 サンプルあたり 10 μL の反応混合物を氷上に組み立てます。 10 μM)、2 μL の DNA テンプレート、2 μL のヌクレアーゼフリー水 (表 3)。
- 次の熱サイクル条件を使用して反応を実行します:最初の変性を95°Cで60秒間、続いて95°Cで10秒間、60°Cで30秒間の35サイクル(ここでキャプチャし、2.11°C/sのランプレートを使用。 表4)。
注:この場合、qPCR は、QuantStudio 3 リアルタイム PCR システム上で VIC 標識プローブを用いた TaqMan アッセイを使用して実施しました。 - すべてのサンプル、標準試料、およびコントロールをテクニカルトリプリケートで分析します。精製した 結核菌 DNAの段階希釈液を使用して標準曲線を作成します。解析ソフトウェアを使用して相対定量分析を実行します。
- 得られた相対定量値をCSV形式にエクスポートし、R Studio(バージョン2024.09.1+394)を使用して視覚化し、抽出方法間でDNA収量を比較する箱ひげ図を生成します。
結果
我々は、培養 された結核菌 と 結核菌 のスパイク喀痰サンプルの両方でDNA抽出プロトコルを試験した(各条件でn = 3)。培養 した結核菌 H37Rv mc² 7901を用いて、50μLあたり8.4×106 細胞にインプットを標準化しました。これは、200GUでMGIT培養物1mLに相当します。喀痰実験では、非結核呼吸器疾患(市販)の患者からプールした1 mLの喀痰に2つの異なる細菌濃度(50,000、約1+の喀痰塗抹グレード、および10,000桿菌、約わずかな喀痰塗抹グレード)でスパイクして、さまざまな細菌負荷に対するこの方法の性能を評価しました。
当社は、単一コピー遺伝子を標的とするカスタム TaqMan qPCR を使用して DNA 収量を評価しました(図 2)。純粋な培養物やスパイクした喀痰を含むすべてのサンプルで結 核菌 DNAを検出し、複製間の変動はほとんどありませんでした。しかし、わずか10,000個の細胞でスパイクした喀痰の定量化には大きなばらつきが観察されました。
抽出されたDNAの品質は、Illuminaの全ゲノムシーケンシングによって評価されました。試験した3つの培養由来サンプルはすべて、 結核菌 H37Rvゲノムの99%≥にわたって>100倍のカバレッジを示しました。しかし、スパイクした喀痰サンプルのシーケンシングでは、DNA抽出が成功した(qPCRで確認)にもかかわらず、ほとんどのシーケンシングリードは 結核菌ではなくヒトゲノムにアライメントされているという重要な制限が明らかになりました。このことは、この分析法が両方の供給源から DNA を効果的に抽出する一方で、臨床サンプルを処理する際にマイコバクテリア DNA を濃縮するために追加のステップが必要になる場合があることを示しています。
図2: 結核菌 の培養物とスパイクした喀痰サンプルからの総DNA収量(y軸)(x軸)。 ビーズビーティングプロトコルを使用して抽出した 結核菌 DNA の TaqMan qPCR 定量(条件あたり n = 3)。純粋な培養物は最も高いDNA濃度をもたらしましたが、スパイクした喀痰サンプルは、細菌のインプットが減少すると、収量が徐々に低下し、変動が大きくなりました。ボックス プロット エレメントは、四分位範囲 (ボックス)、中央値 (ボックス内の線)、四分位範囲の 1.5 倍以内の最小値と最大値 (ひげ)、外れ値 (個々のポイント) を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | 内容量(mL) |
| H2O | 95.8 |
| NaCl (5 M) | 2 |
| Tris-HCl pH 8.0 (1 M) | 1 |
| トリトンX-100 | 1 |
| EDTA(0.5メートル) | 0.2 |
表1:カスタムTriton Bufferレシピ。
| 低EDTA TE(1x) | |
| コンポーネント | 内容量(mL) |
| H2O | 99 |
| トリスHCl(1 M、pH 8) | 1 |
| EDTA(0.5メートル) | 0.02 |
表2:低EDTA TE(1x)レシピ。
| コンポーネント | 10 μL 反応の V (μL |
| ユニバーサルプローブミックス(2x) | 5 |
| フォワードプライマー(10 μM;AATTCCTGGTGTAGCGGTGG) | 0.4 |
| リバースプライマー(10μM;GTTTACGGCGTGGACTACCA) | 0.4 |
| TaqMan プローブ (10 μM;AGGAGGAACACCGGTGGCGA) | 0.2 |
| デオキシリボ核酸 | 2 |
| H2O | 2 |
表3:qPCR試薬のセットアップ。
| 舞台 | 温度 (°C) | 時間 | ランプレート(°C / s) | サイクル数 (x) | データキャプチャ |
| 初期変性 | 95 | 60秒 | 2.73 | 1 | いいえ |
| 変性 | 95 | 10秒 | 2.73 | 35 | いいえ |
| アニーリングとエクステンション | 60 | 30秒 | 2.11 | はい |
表4:qPCRサイクリングプロトコル。
ディスカッション
この研究では、下流の分子アプリケーションとNGSアプリケーションのための磁気ビーズクリーンアップによるビーズビーティングを使用して高品質の 結核菌 DNAを抽出するための堅牢で検証済みのプロトコルを紹介します。
この方法には、既存の 結核菌 DNA抽出プロトコルに比べていくつかの利点があります。従来のフェノール-クロロホルム抽出には通常数日かかり、危険な化学物質が導入されますが、この方法では60分以内に完了し、有害廃棄物は最小限に抑えられます。このアプローチにより、試薬の調達に柔軟性がもたらされ、バッファーは複数のベンダーから購入することも、社内で調製することもできるため、単一のサプライヤーへの依存を減らすことができます。磁気ビーズ自体でさえ、中程度の複雑さの実験室で合成することができる20。市販のビーズはより高い収率を提供する可能性がありますが、この方法は適応性が高いため、ラボは性能を維持しながらコストを最適化することができます。全体として、このアプローチは迅速で再現性があり、複数の実験や異なるサンプルバッチで一貫して機能します。したがって、喀痰から直接標的とするNGSアッセイや、培養分離物のWGSに検討する必要があります。
重要な手順とトラブルシューティングには、細心の注意が必要です。シリカジルコニアビーズの均一な分布は不可欠です-一貫性を確保するために、改造された微量遠心チューブから作られたカスタムスプーンを使用することをお勧めします(または、プレフィルドチューブを購入することもできます)。DNA収量が低いのは、多くの場合、ビーズのビーキングが不十分であったり、磁気ビーズの取り扱いが不適切であったりすることに起因します。歩留まりが低い場合は、ビーズビーターが6.5 m/sの速度を維持していることを確認し、磁気ビーズが室温にあり、使用前に完全に再懸濁されており、最終的な溶出前に過度に乾燥していないことを確認します。臨床サンプルを処理する場合、この方法はさまざまな一般的な実験室の慣行に対応します。培養サンプルの場合、MGIT培養物と濁った液体培養物の両方が出発物質として役立ちます。通常、5 mLの熱不活化培養物を使用しますが、DNA収量に大きな影響を与えることなく、培養密度に基づいて容量を調整できます。熱不活化プロトコルはラボによって異なりますが、温度(80〜95°C)と持続時間(15〜45分)の変動はDNAの回収に大きな影響を与えないことがわかりました。喀痰処理の場合、この方法は、さまざまな量の自発喀痰サンプルと誘発喀痰サンプルの両方に適合します。バクテリアペレットは、DTTまたは広く使用されているNALC-NaOH除染法のいずれかを使用して調製できます。培養サンプルの場合、出発物質の容量は2〜10 mLの間で調整でき、プロトコールの性能に大きな影響を与えませんが、収量はインプットにほぼ比例してスケールします。
いくつかの制限を考慮する必要があります。この方法では、高速ビーズビーターなどの特殊な機器が必要であり、その使用は設備の整った実験室に限定されています。ただし、結 核菌 溶解21に対してこれらと同様に機能する低コスト(<40ドル)の代替手段があります。培養分離物には効果的ですが、喀痰サンプルはヒトDNA組成が高いため課題があり、シーケンシングの結果は、これがWGSなどのダウンストリームアプリケーションに干渉する可能性があることを示しています。現在のプロトコルでは、バッチあたり最大24サンプルを処理しますが、これはハイスループット設定には不十分な場合があります。また、ダウンストリーム解析に支障をきたす可能性のあるPCR阻害剤を除去するための特定のステップも含めていません。ほとんどの阻害剤はビーズのクリーンアップ中に除去されますが、特に臨床現場では、一部が持ち越される可能性があります。残りのPCR阻害剤の影響は、最終濃度0.5〜2.0 mg / mLのウシ血清アルブミン(BSA)を下流のPCR反応に添加することで軽減できます。.
このプロトコルは処理時間が短いため、自動化されたリキッドハンドリングシステムへの統合に適しており、スループットを向上させ、オペレーターのばらつきを減らす可能性があります。この方法は、同様の細胞壁特性を持つ他のマイコバクテリア種、または真菌や酵母に適応できる可能性があります。臨床応用では、下流の選択的DNAキャプチャステップを組み込むことで、喀痰サンプルからマイコバクテリアDNAを濃縮し、マルチプレックスPCRを改善したり、WGSを実現したりする可能性があります。
全体として、臨床喀痰および培養分離株の両方からマイコバクテリアDNA単離のための迅速なDNA抽出の代替手段を提供しており、これはすべてのダウンストリーム分子診断アプリケーションでの使用を検討する必要があります。
開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
R01AI153213 国立アレルギー感染症研究所(NIAID)。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1 mm ジルコニア ケイ酸塩ビーズ | バイオスペック製品 | 11079101z | マイコバクテリア細胞を溶解するためのビーズビートステップに使用されるビーズ |
| AMPure XPビーズ | ベックマン・コールター | A63880 | 溶解後のDNAクリーンアップ用磁気ビーズ |
| EDTA(0.5M、pH 8.0) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9260G | カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント |
| ファストプレップ 24 | MPbio, アメリカ | 116004500 | 6.5 m/sのビードビート用装置 |
| フォワードプライマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | カスタム合成 | プライマー配列:AATTCCTGGTGTAGCGGTGG |
| H2O(水、分子生物学グレード) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP2819-1 | カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント |
| ルナユニバーサルプローブ | ニューイングランドバイオラボ | M3004 | マイコバクテリアDNA計数用qPCR試薬 |
| MycoPrepキット | BDの | SKU/REF 240863 | NALC-NaOH喀痰処理のためのBD MycoPrep検体消化 |
| NaCl(塩化ナトリウム、5M溶液) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9759 | カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント |
| PBSの | ミリポアシグマ | P2272 | 喀痰処理 |
| リバースプライマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | カスタム合成 | プライマー配列:GTTTACGGCGTGGACTACCA |
| TaqManプローブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | カスタム合成 | プローブシーケンス:AGGAGGAACACCGGTGGCGA |
| トリス-HCl(1M、pH 8.0) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AM9855G | カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント |
| トリトンX-100 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 28314 | カスタムTriton/低EDTAバッファーコンポーネント |
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再版と許可
