機械的軟骨過負荷に対する軟骨細胞損傷の反応をよりよく理解するために、プロトコルでは、24時間亜致死的であった ex vivo 軟骨衝撃モデルの開発について説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
心的外傷後変形性関節症(PTOA)は、一般的で変性性があり、痛みを伴う進行性関節疾患であり、通常、重大な関節外傷の後に発生し、600万人以上のアメリカ人が罹患しています。衝撃による軟骨外傷は、軟骨細胞損傷反応を引き起こし、PTOAで最高潮に達します。軟骨細胞の損傷に関連する分子イベントを理解することは、PTOAを予防したり、その進行を遅らせたりするための治療法を開発するために必要です。これを容易にするために、24時間亜致死性の ex vivo 軟骨衝撃モデルが開発されました。骨軟骨外植片は、ウシの中手指節関節から採取され、ドロップタワーを使用して外植片に衝撃荷重を送達しました。応力と衝撃が関節軟骨に比較的均一に加えられるように、骨表面を上に向けて外植片を配置し、骨を上から衝撃を受けました。キャリッジ高さ4.0cm、4.5cm、5.0cmから外植片に異なる荷重が加わり、平均ピーク応力はそれぞれ10.87 ± 1.84 MPa、11.69 ± 0.67 MPa、0.75 MPa±12.98 MPaとなりました。この研究では、インパクト後の培養中の軟骨における軟骨下骨の存在の役割と、インパクト時に装着ホルダーまたはルーズホルダーを使用した場合の影響を分析し、細胞の生存率とアポトーシスを評価しました。4.5cmから衝撃を受けた関節軟骨は、装着されたホルダーと即時の骨除去と組み合わせることで、衝撃後24時間で細胞死を最小限に抑えて軟骨損傷を誘発するための最適なモデルを提供しました。
概要
心的外傷後変形性関節症(PTOA)は、米国で500万人以上の成人が罹患している衰弱性疾患です1。軟骨への単一の外傷性衝撃が軟骨細胞損傷反応を引き起こし、早期発症の症状を引き起こし、関節痛や機能障害との生涯にわたる闘争につながる可能性があります2。軟骨には内在的な修復能力がほとんどまたはまったくないため、病気の進行を変更する治療法を開発する必要性が満たされていません3。PTOAは、明確に定義された単一の外傷性事象と相関しているため、病気が進行する前に介入する機会があります。しかし、これらの治療法の開発は、軟骨細胞の損傷反応を調節し、心的外傷後変形性関節症につながる分子シグナル伝達に関する知識のギャップによって妨げられています 2,3,4。軟骨細胞損傷後の分子イベントをよりよく理解することは、軟骨細胞損傷反応を救い、PTOA 2,5,6の発症を予防または遅延させる新しい治療法の設計に役立つ可能性があります。
軟骨細胞損傷の分子シグナル伝達をよりよく理解するために、以前の研究では、軟骨外植片に機械的に衝撃を与えて損傷反応を開始するドロップタワーまたは同様のデバイスを利用していました。これらの研究は、機械的特性と構造の変化7,8、マトリックス損傷と合成6,9,10,11、ミトコンドリア機能障害12,13,14,15、イオン輸送経路16,17,18、図19、および遺伝子発現9,11,20,21,22,23。しかし、これらの研究の多くでは、細胞生存率は報告されていないか、または損なわれており、一部の研究では細胞生存率が50%以下であった24,25,26。細胞生存率が低いことによる交絡効果により、損傷反応の研究が困難になる可能性があります。関節外傷の直後の軟骨細胞死は不可逆的ですが、軟骨細胞損傷を治療する治療法は、その後のPTOA27を軽減します。軟骨細胞の損傷に関連する分子変化を特定し、生存細胞の喪失ではない分子変化を特定するためには、軟骨細胞の生存能力を一定期間維持する軟骨衝撃モデルが必要です。さらに、軟骨組織全体で比較的均一な軟骨細胞損傷応答を生成する軟骨衝撃は、細胞の挙動を分析する際に最も一貫した結果を提供します。
この研究の目的は、急性軟骨損傷反応に固有のシグナル伝達経路を研究する能力を維持する関節軟骨の費用対効果の高い ex vivo 衝撃損傷モデルを開発し、特徴付けることでした。さらに、このようなモデルは、損傷反応を救うための潜在的な治療法を評価するために使用できます。これを達成するために、私たちはまず、ドリルプレスに取り付けられたダイヤモンド先端のコアリングビットを使用して、骨格的に成熟した動物のウシ中手指節関節から軟骨外植片を採取する無菌技術を開発しました。中手指節関節は、動物が食用として加工されるときに食肉処理場によって廃棄されるため、この関節は容易にアクセスでき、安価な組織源となっています。次に、骨軟骨標本をドロップタワー装置の下のホルダーに入れる衝撃傷害モデルを確立しました。このモデルでは、#8鏡面研磨されたステンレス鋼の表面に関節面を下に向けて骨軟骨標本を配置し、骨に上からの衝撃を与えることで、軟骨組織に比較的均一な負荷を供給しました。衝撃後24時間にわたって軟骨細胞の生存率を維持しながら、アポトーシス分子損傷応答を引き起こす衝撃パラメータを決定しました。衝撃時に試料の横方向の動きを異なる量に許容したホルダーは、細胞生存率とアポトーシスへの影響について評価されました。最後に、衝撃後に軟骨下骨から軟骨を除去する効果を評価しました。
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プロトコル
地元の食肉処理場から入手したウシの手足の使用は、食用として加工された動物から死後に組織を採取したため、倫理的な承認を必要としませんでした。
1.骨軟骨外植片の収穫
- 外植片の収穫前にオートクレーブを使用して、次の材料を滅菌します:リン酸緩衝生理食塩水(PBS;ジョイントあたり約1 L)、コアリングドリルビット、水スイベルアダプター、オートクレーブ可能な洗浄ボトル1本、メスハンドル1本、鉗子2本、および剖検鋸刃1枚。
- ドリルプレスとバイスで組織培養フードを洗面器内に設置し、PBSを封じ込めます。コアリングドリルビットとスイベルアダプターをドリルプレスに組み立て、スイベルアダプターノズルをホースで滅菌PBSを充填したカーボーイに接続します。剖検のこぎりを組み立て、ボンネットの中に置きます(図1A-B)。
- 使い捨てのアンダーパッドを組織培養フードの積み重ねに広げます(各関節に1つずつ)。
注:アンダーパッドは、関節を開くときに滴り落ちる可能性のあるPBSと滑液を吸収します。アンダーパッドを複数積み重ねることで、濡れすぎたときに最上層を簡単に取り外すことができ、施術中ずっと清潔で乾燥した作業スペースを確保することができます。 - 70%エタノールを含む50 mL試験管1本とPBS中に0.13% v / vベタジンを含む50 mL試験管を1本準備し、フードに入れます。鉗子とメスのハンドルをエタノール試験管に入れて、組織の取り扱い中に無菌性を維持し、フードの後ろに滅菌済みの6ウェル細胞培養プレートを置きます。
- 予想される検体ごとに3 mLの細胞培養培地を調製します。培養培地は、0.9 mMピルビン酸ナトリウム、インスリン、トランスフェリン、およびセレン(ITS)、50 mg / mL L-アスコルビン酸、最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンBを含むModified Eagle's Medium(DMEM)で構成されています。
- 犠牲から6時間以内に地元の食肉処理場から骨格的に成熟した動物からウシの前脚を入手します。輸送中はティッシュを氷の上に置いてください。
- 関節包を開かずにミートバンドソーを使用して蹄を取り除き、中手指節関節を分離します。関節包に穴を開けずに#22メスの刃を使用して皮膚を取り除きます。
- バイオセーフティキャビネットの外側の両脚を冷水で十分に洗い流して汚れを取り除き、ベタジンでコーティングして消毒します。
- 組織培養フードの内側で、新しい#22メスブレードを使用して関節包を開きます。遠位関節を分離し、関節軟骨をウォッシュボトルのPBSで水和させます(図1C)。関節軟骨をPBSを染み込ませた滅菌ガーゼで覆い、水分補給を維持します。
- 剖検鋸で中足骨を切断することにより、遠位中手指節関節をさらに分離します(図1D)。カバーされた軟骨を上に向けて遠位関節を万力に置き、固定されるまで締めます。プロセス全体を通して、軟骨のガーゼを定期的にPBSで湿らせます。
- ガーゼを1つの顆から折り返し、コアリングビットが関節面の最も平らな領域より上にくるように万力の位置を調整します(図1E)。
- カーボーイバルブを開いて、PBSがコアリングビットを流れるようにします。ウォッシュボトルを使用して、PBSで組織を継続的に水和し、穴あけ中にサンプルを冷却します。
注:カーボーイとウォッシュボトルからのPBSは、コアリングプロセス中に冷却効果があります。 - ドリルビットを顆の表面に押し込むことにより、ゆっくりと顆にコアを入れます。頻繁に圧力を解放し、熱を放散させます。コアリングの深さが軟骨下骨に約2mmになるまで続けます。各側面について繰り返します(図1E)。
注意: 過熱の兆候には、急速な液体の蒸発や焦げ臭い臭いなどがあります。 - 剖検のこぎりを使用して、関節軟骨表面と平行に骨を切断し、切断しながらウォッシュボトルからPBSを剖検のこぎりと骨軟骨の界面に絞り続けることにより、骨軟骨コアを解放します。このステップでは、脱水症状を避けるために、湿らせたガーゼを関節軟骨の表面に保持します。
- 骨軟骨コア(図1F)を希薄なベタジン溶液(ステップ1.3を参照)に保管し、すべての関節が処理されます。
- 骨軟骨コアをPBSですすぎ、サンプルを3 mLの予熱培地(0.9 mMピルビン酸ナトリウム、インスリントランスフェリン-セレン(ITS)、50 mg / mL L-アスコルビン酸、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンB)を含む滅菌6ウェルプレートの個々のウェルに移します。サンプルは、翌日の衝撃手順まで、5%CO2 を含む37°Cの加湿インキュベーターに保持します。
2.骨軟骨外植片の影響
- 鏡面研磨された衝撃面を備えたステンレス鋼のインパクトホルダーを製作し(補足図1 および 補足図2)、ドロップタワーベースプレートに対応する穴を開けます(補足図3)。
- 衝撃手順の前にオートクレーブを使用して次の材料を滅菌します:直径15mmのステンレス鋼球形インパクターヘッド、鏡面研磨された衝撃面を備えたステンレス鋼ホルダー、4 6/32ネジ、4ワッシャー、鉗子。
- 以前に設計および製造されたドロップタワー29をバイオセーフティキャビネットに配置します。この研究では、ロードセルと加速度計を装備したキャリッジ(図2A)に取り付けられた直径15mmの球形インパクターヘッドを備えたドロップタワーを使用し、キャリッジの総質量は358.4gです。
- 4本のオートクレーブネジでホルダーをドロップタワーのベースプレートに固定します(図2B)。この研究では、直径8.7mmと9.1mmの円形開口部を持つホルダーをテストしました。
- 骨を上に向けて、ドロップタワーのインパクターヘッドの下のホルダー(補足図1、補足図2、補足図3)に骨軟骨コアを配置します。
注:骨軟骨コアを骨を上向きにし、関節面を下向きに配置する30は、より均質な負荷のために選択されました。 - ドロップタワーキャリッジを、ボーンの上部に対して希望の高さに調整します。パイロット スタディからドロップ タワーのおおよその高さを決定します。この研究では、4.0cm、4.5cm、5.0cmの高さが評価されました。
- ドロップタワーキャリッジを解放する直前に、データ収集ソフトウェア(Supplementary Coding File 1)のStart(スタート)ボタンをクリックして、スピンドルストップ(図2A)を解放し、インパクターヘッドが重力の重みでサンプルに落下できるようにします。すぐにキャリッジを持ち上げ、スピンドルストップに置きます。
注:衝撃中、データはデータ収集モジュールに接続されたデータ収集ソフトウェアを使用して100kHzで収集され、インパクターヘッドとキャリッジの間に配置されたロードセルからの信号と加速度計からの信号が記録されます。衝撃後、できるだけ早くキャリッジを持ち上げますが、反発防止機能や二次衝撃を防ぐためのその他のメカニズムはありません。 - データ収集ソフトウェアによって生成された.txtファイルをMatlabデータ解析コード(Supplementary Coding File 2、https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis でも入手可能)と同じフォルダに配置し、データ解析コードを実行して生データをフィルタリングし、影響パラメータを計算します。
注:データ分析コードでは、軟骨の厚さ0.563mmを使用して衝撃エネルギーを計算します。これは、針法31 とBiomomentum Mach-1メカニカルテスターを使用した別の研究で、5つの標本のそれぞれ>50か所から採取した平均軟骨の厚さとして決定されました。影響パラメータは、前述のように計算される32。 - 必要に応じて、#11メスブレードで骨から軟骨を取り除きます。サンプルを培地と加湿インキュベーターに5%CO2 を入れた37°Cで翌日のイメージングまで戻します。
注: この研究では、衝撃直後または衝撃の 24 時間後に骨から軟骨を除去する効果が評価されました。
3. 軟骨標本の細胞生存率の解析
- 必要に応じて骨から軟骨を取り除きます。軟骨標本を鋭利なメスで半分に切ります。複数のカットは避けてください。滑らかなエッジを確保するために、単一の切開を目指します。
- 目的の各半標本を、5 μMエチジウムホモダイマーと2.5 μMカルシエンAMからなるPBS溶液に浸します。光から保護し、室温で30分間インキュベートして、生死染色を完了させます。
- サンプルをPBS 2xですすぎ、イメージングまでサンプルをPBSに保管します。染色完了後、なるべく速やかに画像化してください。
- 顕微鏡皿にPBSを数滴垂らして軟骨サンプルを直立させ、顕微鏡の正面から半円全体が見えるようにします。倒立共焦点顕微鏡で画像を撮影します。軟骨が自立しない場合は、鉗子で軟骨をわずかに曲げます。
- プラグイン33がバンドルされたImageJのディストリビューションであるFIJIを使用して、最初にImage > Type > 8-bitをクリックして画像を8ビットに変換します。次に、[Image > Adjust > Threshold] でしきい値を設定し、[Apply] をクリックします。次に、[Process > Binary] で [Watershed] 機能を実行し、[Analyze Particles...] を実行します。[分析] で、緑と赤の両方のチャンネルを選択します。各試料の一貫したz高さで撮影された画像を解析し、グループ間の正確な比較を行います。
- 生細胞の数をサンプル中の細胞の総数で割ることにより、細胞生存率を計算します。
4. 軟骨標本におけるアポトーシスの解析
- 目的の各半標本を PBS の 8 μM Caspase-3/7 Green Detection Reagent に浸します。光から保護し、37°Cで30分間インキュベートします。
- サンプルをPBS 3xで洗浄します。染色したサンプルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で15分間インキュベートして固定します。再度PBSで洗浄し、イメージングするまでPBSで保存します。染色後24時間以内の画像。
- 共焦点顕微鏡による画像(上記のステップ3.4を参照)。グループ間の蛍光強度の有効な比較のために、対物レンズ、励起レーザー出力、光電子増倍管検出器のゲイン、ピンホールサイズ、光学スライスの厚さ、スキャン速度、ライン平均化、画像解像度など、すべてのサンプルで一貫したイメージングパラメータを維持します。
- ImageJのFIJI拡張機能を使用して、Analyze > Set Measurements...メニューの下のMean gray valueを選択します。
- ポリゴン断面ツールを使用して、画像に示されているサンプルの全領域の輪郭を描きます。「分析」メニューの「測定」機能を実行し、グループ間で同じ処理パラメーターを使用して平均グレー値を記録します。
- ポリゴン セクション ツールを使用して、サンプルを含まない画像の領域を選択し、測定機能を再度実行します。これを背景の平均グレー値として記録します。
- サンプル平均グレー値からバックグラウンド平均グレー値を差し引いて蛍光強度を計算します。
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結果
骨軟骨外植片への機械的衝撃荷重は、キャリッジ高さが組織から4.0 cm、4.5 cm、および5.0 cm(n = 3または4)のドロップタワーを使用して加えられました。キャリッジを解放する前にキャリッジの高さを大きくすると、衝撃力、平均ピーク応力、荷重率、および衝撃エネルギーが増加しました(表1)。
私たちは、衝撃後24時間亜致死性である ex vivo 軟骨損傷モデルの開発を目指しました。ドロップタワーキャリッジの異なる高さでの衝撃後24時間の生/死染色の特性評価は、収穫手順により、サンプルの中央に98.4%±0.05の高い細胞生存率の軟骨外植片が生成されたことを示しました。4.0 cmおよび4.5 cmの衝撃群の細胞生存率は、衝撃後24時間で非衝撃サンプルと有意差はありませんでしたが、高さ5.0 cmでは有意な低下が観察されました(図3A)。さらに、アポトーシスシグナル伝達を示す蛍光強度は、非衝撃群と比較して4.0cmの衝撃群で有意に増加し、4.5cmおよび5.0cm...
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ディスカッション
この研究の目的は、軟骨細胞損傷後の分子イベントを研究するための細胞生存率を損なわない軟骨衝撃モデルを特徴付けて最適化することであり、最終的には、損傷した細胞を救助してPTOAの進行を防ぐ治療法を開発することを目標としていました。この目標を追求するために、骨軟骨コアの骨部分に機械的な負荷がかかり、その負荷が軟骨組織に伝達されました。さらに、異なる衝撃高さ、衝撃時の異なるホルダープレートの影響、および衝撃後の軟骨組織培養における骨の存在の影響を調べました。これらのパラメータを組み合わせると、モデルに対する重要な洞察が得られ、適切にフィットしたホルダーで4.5cmの衝撃高さと、その後の骨からの軟骨の即時除去が、細胞の生存率を維持しながら有意な軟骨細胞損傷応答を誘発するのに最適であったことが示唆されています。
4.5cmの衝撃高さを選択した理由は、平均ピークストレス(11.69 ± 0.67 MPa)が細胞死を引き起こさず、重大な軟骨細胞損傷を誘発したためです。4 cmの高さ(平均ピークストレス:10.87 ± 1.84 ...
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、NIH NIAMS Grant R21 AR080255の支援を受けました。著者は、このプロジェクトに機械加工と製造の専門知識を提供してくれた Kevin Carr に感謝します。著者らは、この研究に組織を提供してくれたムーアズビルブッチャーショップ(インディアナ州ムーアズビル)に感謝します。著者らは、共焦点顕微鏡法の支援について、インディアナ生物顕微鏡センターのコア施設のスタッフに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| #11滅菌メスの刃 | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | 骨から軟骨を除去 |
| 22 滅菌メスの刃 | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | ウシ組織から皮膚を除去し、靭帯を切断して関節を開く |
| 10-1000 ul ピペットチップ | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | 測定と移送 PBS、培地、その他のソリューション |
| 200プルーフエタノール | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 03-007-647 | 手術器具を消毒し、組織の準備と処理中に無菌環境を維持するための滅菌剤として70%エタノールを調製するために使用されます。 |
| 50 mL遠心分離管(滅菌 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 339652 | 地とサンプルの保管に使用されます |
| 5ガロンカーボー | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 04-355-233 | ースでスイベルアダプターに接続された滅菌PBS容器。 |
| 6ウェルプレート(滅菌) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 140685 | 収集、衝撃研究前のインキュベーション、およびイメージング中に、予熱培地を使用して骨軟骨コアを無菌環境に一時的に保存するために使用されます |
| 速度計 | キスラー | 8743A5 | 衝撃中に生成される加速度の測定に使用 |
| アポトーシス染色キット (CellEvent) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | C10423 | アポトーシス細胞の検出と視覚化に使用 |
| オートクレーブ可能な洗浄ボトル | Nalgene | 2405-0500 | 組織採取中に軟骨に水分を補給するために滅菌PBSを充填します。 |
| 剖検鋸 | Mopec | BD 810 | 関節を開くか、骨軟骨コアを抜いた後、余分な骨を取り除 |
| 剖検鋸刃 | Mopec | BD 101 | 骨を切断して骨軟骨外植片を分離して解放するために使用されます。 |
| ベタジン | アブリオ ヘルス LP | 該当なし | シサンプルをフードに移す前に外側を消毒し、最終的な骨軟骨サンプルを消毒するために希釈します。 |
| クリア 4 フィート ホー | n/a | n/a | PBS を含む 5 リットルのカーボイをボール盤のスイベル アダプターに接続して PBS を輸送するために使用されます。 |
| コアリングドリルビット | UKAM産業用スーパーハードツール | 3EDCD7160 | 軟骨と軟骨下骨に穴を開けて骨から骨軟骨外植片を抽出するために使用されます。- ドリルビットの直径:7/16インチ(電気メッキダイヤモンドコアドリル) |
| 三日月レンチ | McMaster Carr | 5362A1 | ランプ(ジョイントを所定の位置に保持する)を締め、コアリングドリルビットを締めるために使用されます |
| 使い捨て血清ピペット | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | PBSおよび培地の測定と移送 |
| 使い捨てアンダーパッド | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | 穫中に水と液体を吸収するためのカウンタースペースを覆うために使用され、利便性と衛生性を高めます |
| 使い捨て真空フィルターユニット | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | フィルター PBS およびその他のソリューション |
| ドリルプレス | WEN | 433TV 3.25インチ | 骨軟骨サンプルの穴あけに力を加える - WEN 433TV 3.25インチ工業用強度ベンチトップ |
| ドリルプレス傾斜アングルバイス | WEN | TV434 | コアリングプロセス中に骨軟骨サンプルを希望の角度で固定位置に固定します。 |
| ドロップタワー | カスタムメイド | n/a | サンプルに影響を与えるために使用 |
| FIJI (ImageJ Extension) | /a | n/a | 細胞生存率やアポトーシス定量を含む顕微鏡画像の処理と分析に使用されるソフトウェア |
| 子 | Fisherbrand | 12-000-163 | フード内の組織を切断し、関節を開き、サンプルを移すために使用されます |
| ゼ (滅菌) | Dukal | 6412 | 関節カプセルを開封した後、関節軟骨に水分を補給するために使用 ガラス |
| 1 リットルのメディア ボトル | シグマ アルドリッチ | CLS13951LHTC | 滅菌 PBS の保管に使用されます。 |
| 手袋 | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | 回収チームの保護に使用 |
| インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS) | Gibco | 41400-045 | メディアサプリメント |
| LabVIEWデータ集録ソフトウェア | National Instruments | n/a | 衝撃試験中にロードセルと加速度計からデータをキャプチャして、その後の解析を行います。 |
| L-アスコルビン酸 | Merck | A4403 | メディアサプリメント |
| レーザー共焦点走査顕微鏡 | オリンパス | FV1000D | 染色された組織サンプルの高解像度の3次元画像をキャプチャするために使用されます。 |
| 生死アッセイ染色キット | Thermo Fisher Scientific | L3224 | 組織サンプル中の生細胞と死細胞を区別し、細胞の生存率を評価するために使用されます |
| ロードセル | Kistler | 9712B5000 | 衝撃中に加えられる力を測定するために使用します。 |
| マトラブ | MathWorks Inc. (英語) | n/a | |
| ミートバンドソー | Skymsen | MSKLE | ウシサンプルから手根蹄を除去 |
| マイクロピペット 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | 測定と移送 PBSおよび培地 |
| 最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸溶液 | Gibco | 11140-050 | 培地サプリメント |
| Modified Eagle's 培地 (DMEM) | Gibco | 10566-016 | 骨軟骨外植片培養。 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 15-140-148 | 培地サプリメント |
| リン酸緩衝生理食塩水 | サーモフィッシャーサイエンティフィ | BP399-20 | 理学的状態の維持、脱水の防止、染色液の調製のための組織のすすぎ、水分補給、冷却に使用されます |
| ドロップタワーのサンプルホルダー | カスタムメイド | n/a | 衝撃中に骨軟骨コアを固定します。 |
| メスのハンドル | モフィッシャーサイエンティフィック | 16-100-107 | 切断、組織の解剖、関節の開口に使用されます。 |
| ネジ(CADに追加) | 6-32ネジサイズ-18-8ステンレス鋼穴付きネジピ | ||
| ルビン酸ナトリウム | Gibco | 11360-070 | サプリメント |
| 面インパクターヘッド | McMaster Carr | 9292K52 | パクト手順前のオートクレーブ |
| ジカルマスクフィルター | マスク | 375101 | 収集チームを保護するために使用されます |
| 水スイベルアダプター | UKAM産業用スーパーハードツール | 7035812 | リングドリルビットに接続して、穴あけプロセス中の冷却用のPBSの連続的な流れを提供します。 |
参考文献
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