G-四重鎖におけるDNAポリメラーゼダイナミクスの1分子蛍光可視化

Summary

このプロトコルは、蛍光顕微鏡法に基づく単一分子DNA複製アッセイの概要を示しており、DNAポリメラーゼとG-四重鎖構造などの障害物との間の相互作用をリアルタイムで可視化することができます。

Abstract

真核生物のDNA複製に関与するタンパク質が、タンパク質やDNAの「障害」などの障害を克服する能力は、忠実なゲノム複製を確保するために重要です。G-四重鎖は、DNAのグアニンに富む領域に形成される高次核酸構造であり、障害物として作用し、ゲノム維持経路を妨害することが示されています。この研究では、G-四重鎖構造とDNAポリメラーゼの相互作用を観察するための、リアルタイムの蛍光顕微鏡法を紹介します。G-四重鎖を含む短いプライミングされたDNAオリゴヌクレオチドを、マイクロ流体フローセル内の官能基ガラスカバースリップに固定化しました。蛍光標識されたDNAポリメラーゼを導入し、その挙動と化学量論を経時的に監視することを可能にしました。このアプローチにより、G-四重鎖によって停止したポリメラーゼの挙動を観察することができました。具体的には、蛍光標識酵母ポリメラーゼδを用いて、G-四重鎖に遭遇すると、ポリメラーゼは結合と非結合の連続サイクルを経ることがわかった。この1分子アッセイは、さまざまなDNA維持タンパク質とDNA基質上の障害物との間の相互作用の研究に適合させることができます。

Introduction

DNAポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸の取り込みを触媒してDNAを複製する酵素^です1,2,3,4,5。そのため、DNA複製^6,7,8や修復^9,10,11,12などの重要なDNA維持プロセスにおいて重要な役割を果たします。DNAポリメラーゼは、ゲノムの完全性を確保し、ゲノム内の突然変異の蓄積を防ぐために、ゲノムを正確かつ効率的に複製する必要があります。合成中、ポリメラーゼはしばしばDNA結合タンパク質や二次DNA構造などの「障害」に遭遇します¹³。これらの障害は、ポリメラーゼの進行を遅らせたり、ブロックしたりする可能性があります¹⁴。これらの障害を克服することは、忠実なゲノム重複を確保するために重要であり、そうしないとゲノムが不安定になる可能性がある^15,16。

障害の主要なクラスの1つは、G-四重鎖(G4)であり、ヒトゲノム¹⁷内のグアニンリッチ配列で形成されることが示されている非標準的な二次DNA構造です。ヒトゲノムには、テロメアやがん遺伝子プロ^{モーター18}内の領域を含む、G4を形成することができる700,000以上の異なる配列がある。これらのDNA構造は、塩基配列、長さ、および結合金属カチオン19,20,21に応じて、様々な立体配座を採用する。この多様性は、ポリメラーゼがさまざまなG4トポロジーを克服する必要があることを意味します。これは、さまざまな程度の効率で克服できる可能性があります。ポリメラーゼがG4構造を克服またはバイパスできないと、in vivoでの複製フォークの進行が妨げられ、ゲノムの不安定性につながることが示されています²²。インビトロ研究は、G4構造が酵母ポリメラーゼ^{23、24、25、26、27}を失速させるか、または完全にブロックする可能性があることを示しています。G4構造がDNAポリメラーゼを失速またはブロックする能力は、その速度論的および熱力学的安定性に完全に依存しており、一部のポリメラーゼは特定のG4を展開できます²⁸。これらの研究は、G-四重鎖の障害を克服するポリメラーゼの能力に関する洞察を提供しますが、G4に遭遇したときのポリメラーゼの挙動を直接視覚化する能力を欠いています。ポリメラーゼの運命は、結合したままであるか、脱落するか、動的に交換されるかによって、G4を分離するためにアクセス可能な下流プロセスを決定します。

この研究では、G4構造とのDNAポリメラーゼ結合をリアルタイムで直接可視化し、モニタリングするために、蛍光ベースの1分子顕微鏡アッセイを開発しました。このアッセイでは、G4形成DNAテンプレートをマイクロ流体フローセル内のビオチン化カバースリップにテザリングし、蛍光標識されたDNAポリメラーゼを導入してDNA合成を開始することができます。ポリメラーゼの蛍光を経時的に測定することにより、G4構造に遭遇したときのポリメラーゼの挙動を直接観察することができます。c-MYC がん遺伝子に見られるG4構造は、その高い安定性のためにこのアッセイに選ばれました。このプロトコルは、さまざまなG4トポロジーと安定性に関連する生命のすべてのドメインにわたるさまざまなポリメラーゼの挙動をカタログ化するために適合させることができます。このアッセイは、DNAポリメラーゼがDNAの障害物をナビゲートするメカニズムを解明するための革新的でハイスループットなアプローチを提供し、ポリメラーゼダイナミクスの理解を深めるための強力なツールを提供します。

Protocol

試薬および使用した機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 円二色性分光法

注:アッセイを開発する前に、正しいフォールディングを確保するために、選択したG4配列に対して円二色性(CD)分光法を実施する必要がありました。22 nt配列(5'-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3')は、c-MYC がん遺伝子に由来するG4構造を形成します。CD分光法は、G4形成を防止する主要なヌクレオチドが変更された制御配列(5'- TGAGTGTGAAGACGATGTAGAA -3)でも行われました。

1. CD分光法用のDNAテンプレートを調製するには、22 ntテンプレートのうち100 μMを40 μL、360 μLのTris-HCl(pH 8.0)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)(TE)バッファーに200 mMの塩化カリウム(KCl)を添加します。CD分光法の実験には、10 μMの最終DNA濃度が望ましいです。
   注:K⁺ イオンの存在は、テンプレート内のG4構造を安定化するために不可欠です。
2. DNA溶液をデジタルドライバスで95°Cに15分間加熱します。完了したら、加熱ブロックをポリスチレンに入れて、溶液を一晩かけてゆっくりと冷却します。このゆっくりとした冷却プロセスが、G4の折り畳みの原因となっています。
3. 400 μLのG4形成および制御シーケンス溶液を、気密シリンジを使用して光路長0.1 cmの石英キュベットに移します。気泡の形成を避けるために、キュベットをゆっくりと満たします。
4. 25°Cの分光偏光計を使用して、200nmから400nmまでのCDスペクトルを測定します。 この測定のパラメータと条件は、前に説明した²⁹。結果は 補足図1に記載されています。
   メモ: バッファだけがブランクとして機能するように、CD スペクトルを記録してください。

2. DNAテンプレートの調製

注:複製可能なテンプレートは、標準的な分子生物学的手法を使用して調製された短い100 ntのプライミングされた線形テンプレートです。G4形成テンプレート(5'-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGAA
CTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGGGGTGGGGGGGGGT
GGGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3')は、その中心に MYC由来のG-四重鎖(ステップ1から)を形成することができる配列を含む。制御テンプレート (5'-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGA
ACTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGATGTAGCAGAACT
GTGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3')は、その中心にも同じ制御領域(ステップ1から)があります。

1. G4形成および制御DNAテンプレートへのプライマーをアニールするには、20 μMのプライマー(5'-Biotin-AF647-TCTTAATGTAATTTAAAATGTGTC-3')を20 μMの100 ntテンプレートに20 μMに混合し、200 mM KClを添加したTEバッファーで混合します。
2. DNAテンプレート溶液をデジタルドライバスで95°Cに15分間加熱します。完了したら、加熱ブロックをポリスチレンに入れて溶液を一晩ゆっくりと冷却し、G4を折り畳み、2本のストランドをアニールします。

3. AF647によるDNAポリメラーゼの標識

1. 染料によるポリメラーゼの標識
   注:酵母Pol δは、前述のように発現および精製した³⁰。次に、ポリメラーゼをAlexa Fluor NHSエステル単反応性色素(AF647)で標識して、単一分子レベルでの視覚化を可能にする必要がありました。これは、前述の⁵のとおりで完了しました。
   1. N末端を標識するには、30 mMのTris-HCl(pH 7.6)、2 mMのジチオスレイトール(DTT)、300 mMの塩化ナトリウム(NaCl)、50 mMのグルタミン酸カリウム、および10%(v/v)グリセロールを含むバッファーに、3倍過剰のAF647色素を320 μLの58.5 μM Pol δとともにインキュベートします。 溶液をゆっくりと回転させて、完全に混合し、ラベリング効率を向上させます。
      注:タンパク質配列は、リジンアミノ酸中に追加の第一級アミンを含んでいてもよい。pHなどの反応条件を調整することにより、標識をリジン残基ではなくN末端に優先的に接着することができます。これには、ラベリングの効率を高めるために、さらに最適化が必要になる場合があります。
   2. 0.5 mL のスピン脱塩カラム(分子量 7 K カットオフ)を調製するには、まずカラムを 1500 x g で 1 分間遠心分離し、保存溶液を除去します。遠心分離後、収集チューブに堆積した溶液を廃棄します。
      注:遠心分離ステップ中は、スピンカラムのキャップを緩めてください。これにより、カラムが適切に溶出されます。
   3. 30 mM の Tris-HCl(pH 7.6)、300 mM の NaCl、3 mM の DTT、50 mM のグルタミン酸カリウム、および 5% (v/v) グリセロールを含むバッファーで、カラムの上部に 300 μL のバッファーを加えて、カラムを平衡化します。カラムを1500 x g で1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。
   4. 各Pol δサンプル200 μLをカラムに適用します。カラムを 1500 x g で 2 分間遠心分離し、精製した Pol δ を 1.5 mL の微量遠心チューブに回収します。
   5. 精製した画分を液体N₂ で凍結し、アリコートを-80°Cで保存して、時間の経過とともにタンパク質が分解するのを防ぎます。
2. ラベリング効率の決定
   1. AF647で標識されたPol δサンプルの2μLをUV-vis分光光度計³¹にロードします。
      注意: Pol δ バッファーのブランクが最初に測定されていることを確認してください。
   2. 分光光度計を使用して、AF647色素の650 nm、Pol δの280 nmの励起波長を測定します。
   3. ランベルトベールの法則と、AF647 染料の 270,000 ^{cm-1 M-1} とポリメラーゼの 195,960 ^{cm-1 M-1} のモル吸光係数を使用して、標識効率を計算します。
      注:このアッセイで使用したAF647標識酵母Pol δについて決定された標識効率は、約67%と計算されました。

4. Ensemble プライマー伸長アッセイ

注:単一分子複製実験を行う前に、バルク複製アッセイ を介して DNAポリメラーゼがG-四重鎖によってブロックされていることを確認する必要があります。

1. デジタルドライバス内の加熱ブロックの温度を30°Cに設定します。 これにより、酵母Pol δの最大限の活性が保証されます。
2. レプリケーションバッファー(25 mMのTris-HCl(pH 7.6)、10 mMの酢酸マグネシウム、50 mMのグルタミン酸カリウム、40 μg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)、0.1 mMのEDTA、5 mMのDTT、および0.0025%(v/v)Tween-20)中のG4形成およびコントロールテンプレート用の「マスターミックス」を調製します。各混合物に 1 mM の DTT、dTTP、dCTP、dATP、dGTP (dNTP) の各 250 μM、およびそれぞれの DNA テンプレートの 10 nM (G4 形成またはコントロール) を添加します。これらを加熱ブロックに入れて、30°Cに達することを確認します。
3. 各マスターミックスの12 μLを12 μLのホルムアミドローディングバッファー(80%(w/v)ホルムアミド、10 mMのEDTA)でクエンチして、T = 0 minコントロールとして機能します。
4. DNA合成を開始するには、AF647標識酵母Pol δを各マスターミックス(最終濃度20 nM)に加えます。DNAポリメラーゼがテンプレートを最大効率で複製するように、完全に混合します。
   注:使用中は酵母Pol δを氷上に保管して、酵素活性を維持してください。
5. 30秒、60秒、180秒後、各マスターミックス12μLを取り出し、12μLのホルムアミドローディングバッファーで急冷します。マスターミックスとホルムアミドローディングバッファーの比率が1:1であるため、一度クエンチすると複製反応が続行できなくなります。
6. 30°Cの加熱ブロックから急冷した溶液を取り出し、代わりに98°Cの加熱ブロックに入れてdsDNAをssDNAに変性させます。10分が経過したら、加熱ブロック全体をゲルタンクに持って行き、変性15%トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)-尿素ポリアクリルアミド(PAGE)ゲル³²に溶液をロードします。
   注:PAGEゲルは、サンプルをロードする前に、1x TBEバッファーで180Vで30分間ゲル電気泳動を実行して加温する必要があります。完了したら、各ウェルをすすぎ、尿素を取り除きます。
7. 各サンプルの15 μLを、ホルムアミドローディングバッファー中の0.02 μMの20 nt、60 nt、および100 ntの標識オリゴヌクレオチドを含むラダーとともにゲルにロードします。
8. ゲルを1x TBEバッファー中で180 Vで60分間分析し、完全な分離を確保します。
9. 生体分子イメージャーのCy5チャネル内のゲルをイメージングします。これにより、AF-647標識を含む複製されたDNA鎖を測定できるようになります。

5. 1分子蛍光顕微鏡

1. カバースリップの機能化
   注:DNAテンプレートをガラスカバースリップに付着させるには、まずアミノシランで官能基化し、続いてビオチン化PEG分子をテザリングする必要があります。このプロセスにより、DNAおよび/またはタンパク質と表面との間の非特異的な相互作用が最小限に抑えられます。
   1. カバースリップ(24 x 24 mm)を染色ジャーに挿入し、エタノールを注いで清掃します。カバーガラスを純水ですすぐ前に、瓶を30分間超音波処理します。このプロセスを1 M水酸化カリウム(KOH)で繰り返してから、再度すすぎます。これらのクリーニング手順をもう一度繰り返します。
   2. 新しい瓶をすすぎ、アセトンで満たし、カバーガラスを中に入れます。3-アミノプロピルトリエトキシシランを瓶に播種して、2%v / v溶液を形成します。ジャーを3分間攪拌してから、大量の水で反応を急冷します。
   3. カバーガラスをN₂ で乾かし、水で満たされた湿った箱に個別に置きます。これにより、カバーガラスの乾燥を防ぎます。
   4. 100 mM の NaHCO₃ (pH 8.2) 中に 1:25 の Biotin-PEG-SVA:mPEG-SVA エステルを調製します。この混合物を20秒間ボルテックスして、完全に混合します。
   5. PEG溶液40μLを乾いたカバースリップにピペットで移します。別のカバースリップを上に置いて、2つのカバースリップの間に溶液を「挟む」ようにします。これにより、カバーガラスの内側の面が機能化されます。すべてのカバースリップに対して繰り返します。
   6. カバースリップを暗闇で3時間インキュベートします。インキュベーション後、カバースリップペアを分離し、余分な水ですすぎ、圧縮_N2 ガスで乾燥させます。
   7. 手順4.1.4〜4.1.5を繰り返して、カバーガラスにPEGの2番目の層を適用します。以前に機能化した側面を一緒に挟むようにしてくださいので、洗濯ステップ中に誤ってそれらをひっくり返さないように注意してください。溶液を暗闇で一晩インキュベートしてから、すすぎ、乾燥させます。
   8. カバースリップは真空中に保管して、機能を維持してください。機能化されたカバースリップは、正しく保管すれば1ヶ月間安定しています。
2. マイクロ流体フローセルの調製
   注:マイクロ流体フローセル³³ は、単一分子実験用に構築されている( 補足図2参照)。これにより、バッファー、DNAテンプレート、およびタンパク質を官能基化されたカバースリップと接触させることができます(ステップ5.1を参照)。
   1. 機能化されたカバースリップを真空から取り出し、部分的に水で満たされたマイクロチューブラック(湿った箱)に置きます。ブロッキングバッファー 100 μL (50 mM の Tris-HCl (pH 7.6)、50 mM の KCl、2% (v/v) Tween-20) と 25 μL の 1 mg/mL NeutrAvidin 溶液 (10% PBS) を混合し、カバーガラスの表面に広げます。これを湿った箱の中で室温で15分間インキュベートします。
   2. カバーガラスを水で洗い、_N2で乾かします。カバーガラスの片面のみが機能化されているので、どちら側であるかを覚えておいてください。
   3. カスタムメイドのポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロック³⁴ をフローセルホルダー内のカバースリップに置きます。これにより、高さ100μm、幅1mmの流路が生成されます。その後、ポリエチレンチューブ(PE-60:入口径0.76mm、外径1.22mm)をフローセルの穴に挿入して、バッファーと基板にアクセスできます。
3. 1分子蛍光イメージング
   注:これらの実験は、G4形成テンプレートと制御テンプレートの両方で実施します。これにより、両方の条件(G4構造によるPol δのブロッキングとブロッキングなし)を、全反射(TIRF)顕微鏡を使用して単一分子レベルで視覚化することができます。
   1. Tween ブロッキング緩衝液 (50 mM の Tris-HCl (pH 7.6)、50 mM の KCl、2% (v/v) Tween-20) の 1 mL アリコートと 500 μL の洗浄バッファー (25 mM の Tris-HCl (pH 7.6)、10 mM の酢酸マグネシウム、250 mM のグルタミン酸カリウム、40 μg/mL BSA、0.1 mM の EDTA、5 mM の DTT、 0.0025% (v/v) Tween-20) と 40 °C で 15 分間のレプリケーションバッファをこれにより、溶液からガスが解放されます。真空チャンバー内で溶液を大気圧より800mbar低くさらに15分間脱ガスします。
   2. 構築したフローセル(ステップ4.2を参照)を取り出し、顕微鏡のステージに置きます。対物レンズにオイルを一滴垂らした後、カバースリップに合うように対物レンズを持ち上げます。
      注:対物レンズとフローセルが31°Cに達する時間があることを確認してください。 これにより、酵母Pol δの活性が向上し、再現性のあるデータを確保するのに役立ちます。
   3. インレットチューブを脱気したTweenブロッキングバッファーに挿入し、アウトレットをシリンジポンプに接続します。シリンジを引き戻して、Tween ブロッキングバッファーをチューブを通してチャネルに引き込みます。このバッファーを少なくとも30分間インキュベートして、非特異的な相互作用を最小限に抑えます。
   4. 200 μLの脱気洗浄バッファーを100 μL/minの速度でチャネルに流します。これにより、Tween ブロッキングバッファーがフラッシュされます。
   5. DNAテンプレート溶液を500 μLの複製バッファーで0.5 pMに希釈します。150 μLを10 μL/minの速度でチャネルに流します。サンプル平面で約900 ^mWcm-2 の647nmレーザーを使用してサンプルを照らし、個々のDNAテンプレートを視覚化します。
      注:サンプルの視野(FOV)に完全に焦点を合わせていない場合、カバースリップが構築されたフローセルの底面と同じ高さに座っていない可能性があります。これが発生した場合は、新しいカバースリップを使用して新しいフローセルを構築します。
   6. 十分な密度のスポット(10 μm²あたり約1スポット)が見えたら、複製バッファー(1 mMのDTTを添加)の新鮮な溶液をチャネルに流し込み、余分なDNAを洗い流します。250 μLの容量は、結合していないすべてのDNAを完全に除去するのに十分です。
   7. 新しいFOVに移動し、DNAの画像をキャプチャして、標識されたポリメラーゼとDNA基質との間の共局在の程度を決定します。完了したら、レーザー出力を上げて残りのスポットを光退色します。
   8. 200 μLのレプリケーションバッファーに、1 mMのDTT、250 μMのdNTP、および20 nMのAF647標識Pol δを含むポリメラーゼ溶液を調製します。100 μLのポリメラーゼ溶液を5 μL/minの速度でチャネルに流します。
   9. サンプルにピントが合い、TIRF角度を調整したら、647nmレーザーのレーザー出力をサンプル平面で約900mWcm-2に設定します。次に、FOVのイメージングを希望の時間で開始します。1〜5フレーム/秒を10〜20分間取得して、すべてのレプリケーションイベントをキャプチャします。
4. データ分析
   注:すべての解析はPython(v.3.11.7)を使用して実行されました。データ分析に使用されるカスタムコードは、https://github.com/Single-molecule-Biophysics-UOW/G-quadruplex_binding_analysis で入手できます。
   1. まず、DNAテンプレートスポットを標識酵母Pol δの蛍光スポットと共局在させます。2 つのピークは、ドリフト補正後の距離が 3 ピクセル≤場合、共局在していると判断されました。DNAテンプレートを共局在化するPol δスポットのみが、その結合速度と全体的な行動傾向について分析されます。
   2. バインディング イベント データを決定するには、ムービー全体で "オン/オフ" の動作を示す各スポットの経時的な強度を測定します。これにより、1つのDNAテンプレート上でPol δ結合が何回発生するかを判断できます。
      注:この解析は、結合ダイナミクスを比較するために、G4形成実験とコントロールテンプレート実験の両方に対して行われます。
      注:G-四重鎖またはテンプレート自体への非特異的結合イベント(23.2秒±4.9秒)が結合イベントの分析に含まれないことを確認する対照実験が実施されています。

Results

このアッセイでは、蛍光標識された20-ntプライマーを持つ2つのDNA基質を設計しました:1つはG4形成配列を含む(図1A、左)もう1つはこの配列を欠く(図1A、右)。G-四重鎖がポリメラーゼ活性の効果的な障害であることを確認するために、Pol δによるDNA合成を変性PAGEゲル上でモニターしました。DNA基質上の精製標識Pol δの活性をゲル電気泳動により調べた。 図1B (左)は、蛍光標識されたPol δがG四重鎖を超えて合成できないことを示しています。合成の開始前(t = 0 min)には、テンプレート鎖から変性した標識プライマーを表す20 ntに対応するバンドが存在します。3分後、この20-ntバンドは60-ntバンドに変換され、すべてのDNAで合成が行われたことを示し、ポリメラーゼがG-四重鎖構造によって完全にブロックされたことを確認しました。このブロッキングは、ポリメラーゼが構造を解きほぐすこともバイパスすることもできないことを意味します。対照的に、G-四重鎖形成配列を含まないコントロールテンプレート(図1A右)を合成すると、3分後に100-ntバンドが生成されました(図1B右)。

テンプレート上での合成とG-quadruplexによる効率的なブロッキングを確認した後、これらの測定を1分子蛍光顕微鏡で繰り返してポリメラーゼの挙動をモニターしました。DNAテンプレートをマイクロ流体フローセル内の官能基化されたカバースリップ(図2A)につなぎ、蛍光標識プライマーを視覚化して各基質の位置を決定しました。次に、標識されたPol δをdNTPの存在下でロードして合成を開始しました。一般的なFOV内では、個々のスポットを追跡して、Pol δがDNAに結合および解離する頻度を定量化します(図2B、C)。各DNA基質の強度を時間の関数として測定することにより、単一分子の軌跡を生成できます(図2C、 補足図3)。特徴的な「滞留時間」、つまりPol δがテンプレートにバインドされたままである平均時間を測定できます。G4基板では、滞留時間は6秒±2秒と決定されましたが、制御基板では10秒±3秒でした(図2D、 補足図4)。さらに、各軌跡について、Pol δがテンプレートに結合する回数を定量化できます。G4基質への結合イベントの数は、コントロールテンプレートと比較してはるかに多くなっています(図2E)。制御テンプレートには、学問的な結合と結合解除のために複数の結合イベントのインスタンスがありますが、G4 形成テンプレートの平均結合イベントの数は明らかに増加しています。このことは、G-四重鎖によって合成が停止された後、結合したポリメラーゼがDNAから解離し、溶液からの新しいポリメラーゼが結合と非結合の連続サイクルを繰り広げることを示唆しています。したがって、この単一分子アッセイは、DNAポリメラーゼがDNAの障害にどのように反応するかについて、比類のない洞察を提供します。

図1:Ensembleプライマー伸長アッセイ。 (A)DNA基質の概略図。G4基質(左)はG-四重鎖形成配列を含んでいるが、対照基質(右)は含んでいない.(B)プライミングされたG4および対照DNA基質のアンサンブルDNAプリマーゼ伸長アッセイは、蛍光標識酵母Pol δがG-四重鎖によって完全にブロックされていることを示している。PAGEゲルは、DNAテンプレートの経時的な複製を示しており、その結果、標識された20 ntプライマーがG4基質の60 nt製品(左)とコントロールテンプレートの100 nt製品(右)にシフトします。Mは、標識された20 nt、60 nt、および100 ntのオリゴを含むラダーを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:単一分子蛍光顕微鏡 (A)AF647標識酵母Pol δを用いた単一分子プライマー伸長アッセイの概略図(B)単一分子アッセイから得られた典型的なFOV。各スポットは、蛍光標識されたPol δ DNAテンプレートに結合していることを表しています。スケールバー:10 μm. (C) (上) Pol δ交換によるオン/オフ結合を示す単一分子アッセイの例。(ボトム)実験の時間経過に伴う強度を示す同じ分子の単一分子の軌跡。黒い線は、データに当てはめられた隠れマルコフモデル(HMM)を表しています。(D)G4基板(紫色)と制御基板(灰色)上のPol δの滞留時間。線は指数関数的な近似を表しており、G4 基板で 6 秒± 2 秒、制御基板で 10 秒± 3 秒の寿命を示します。(E)単一のDNA基質へのPol δ結合イベントの数。G4基質上の結合イベント数の中央値(紫色)は、対照基質1(灰色)と比較して3.5です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:CD分光法。 25 °C で 200 mM の KCl を含む TE バッファー中の G4 形成 (紫) および制御配列 (灰色) の CD スペクトル。 260 nmの特徴的なピークとそれに続く240 nmの負のピークは、並行分子内GQの特徴です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:フローセルの構造。(A)フローセルの個々の部分の概略図。正方形のPDMSブロックは、顕微鏡のカバーガラスの上にあります。これらのピースは、フローセルホルダーの蓋と底部の内側に一緒にはめ込まれます。(B)完全なフローセル。PDMSブロックの両側にチューブを挿入して、マイクロ流体 を介して バッファーをデバイス内を流れることができるチャネルを形成できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:単一分子の軌跡。 (A)実験の10分間の時間枠中に単一の結合イベントを受ける分子の軌跡の例。(B)実験の10分間の時間枠で結合がゼロの分子の軌跡の例。(A)と(B)の黒い線は、データに当てはめられた隠れマルコフモデル(HMM)を表しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図4:滞留時間。 (A)G4基板上のPol δの滞留時間。この線は指数関数的な近似を表しており、制御基板上のPol δの滞留時間は6秒±2秒です。指数関数的なフィットは、10秒±3秒の寿命を与えます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図5:光退色制御。 このプロットは、個々のAF647標識酵母Pol δ酵素が647 nmレーザーによって光退色される平均時間を示しています。この線は指数関数的な近似を表しており、寿命は39 ± 6秒です 。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

ここでは、DNAポリメラーゼがG-四重鎖に遭遇したときの挙動についての洞察を提供する、単一分子蛍光ベースのアッセイについて説明しました。DNAテンプレート生成、Pol δ標識、およびバルクDNA複製アッセイのプロトコルはすべて簡単ですが、単一分子顕微鏡アッセイの実行は技術的に困難です。単一分子技術の性質上、粉塵、汚染、気泡がFOVを不明瞭にし、データ収集を妨げるため、これらの導入を避けるために細心の注意を払う必要があります。

単一分子TIRF顕微鏡実験の限界は、目的の生体分子に共有結合している蛍光色素の光退色です。光退色は、永久的な蛍光損失につながる不可逆的なプロセスである³⁵。実験中にこれを軽減するには、レーザーの照射時間を制限し、レーザー強度を調整し、イメージングのタイミングを最適化することが不可欠です。これらの戦略は、蛍光シグナルの保存に役立ち、より信頼性が高く、より長い観察期間を確保するのに役立ちます。これらのパラメータを微調整することにより、Pol δ信号は測定期間中維持されます。単一分子蛍光顕微鏡合成アッセイのレーザー出力を最適化するには、清潔なガラスカバースリップ上に標識ポリメラーゼをイメージングすることにより、光退色速度を測定することをお勧めします。レーザー出力を体系的に変化させ、視野全体で光退色率を評価することで、蛍光色素の信号強度と光退色に対する耐性とのバランスをとる最適なレーザー強度を特定できます( 補足図5を参照)。

この単一分子アプローチが従来のアンサンブルベースの方法よりも優れている点は、個々のDNAポリメラーゼがG4構造に遭遇し、相互作用するタイミングを直接可視化できることです。従来のアンサンブルベースの方法(ゲル電気泳動など)は、G4構造がDNAポリメラーゼ^23,36,37をブロックする能力を実証しています。しかし、これらの手法では、さまざまな分子動力学のステップと結果を解きほぐすために必要な、この相互作用のリアルタイムの速度論的および機構的情報を提供できません。単一分子技術は、アンサンブル平均³⁸によってしばしば隠される生体分子の速度論、メカニズム、および振る舞いに対する比類のない洞察を提供します。DNAポリメラーゼがどのように作用しているか、つまりDNAポリメラーゼがDNAの障害を交換、停止、解離、または回避しているかどうかをリアルタイムで確認することが可能になりました³⁹。このプロトコルが確立されると、G4のIDを選択した並列c-MYC構造から任意の並列、反並列、またはハイブリッドトポロジに簡単に変更できます。この単一分子アッセイを適用すると、同じDNAポリメラーゼが別のG4トポロジーに遭遇したときに異なる振る舞いをするかどうかが明らかになります。そのため、単一分子法は、体のタンパク質とDNAがどのように相互作用するかに関する特定の質問に答えるために不可欠です。

DNAポリメラーゼとG-四重鎖との相互作用を直接可視化することにより、これまで特徴付けられていなかった酵母Pol δの交換経路が特定されました。この発見は、ポリメラーゼがG-四重鎖に遭遇すると離脱し、DNA合成を再開する前に別のタンパク質が構造を分解するのを待っていることを示唆しています。このプロトコールは、さまざまなゲノム維持タンパク質とDNA障害物との間の相互作用を調査するために適応させることができ、細胞酵素がゲノム障害をどのようにナビゲートするかについて比類のない洞察を提供します。例えば、このアッセイの障害は、G4構造からタンパク質-DNA架橋、タンパク質がDNAに不可逆的に共有結合し、DNA複製の障害として機能するDNA病変の一種に変更することができる⁴⁰。このような検査は、DNAの複製、修復、および組換えの基本的なプロセスを理解するために重要です。このアッセイは、DNA-タンパク質のダイナミクスを分子レベルで研究することができるため、ゲノム完全性の根底にあるメカニズムを解明するための強力なツールを提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nt コントロールDNAテンプレート	統合DNAテクノロジー		プライマー拡張アッセイにおける一次制御テンプレート
100 nt G4形成DNAテンプレート	統合DNAテクノロジー		プライマー拡張アッセイにおける一次G4形成テンプレート
15% Mini-PROTEAN TBE-尿素ゲル、12 ウェル、20 µL	バイオ・ラッド	4566055	ゲル電気泳動
20 nt 標識/ビオチン化プライマー オリゴヌクレオチド	統合 DNA テクノロジー		100 nt テンプレートのプライマー伸長に必要
22 nt コントロール DNA テンプレート	統合 DNA テクノロジー		円二色性分光法実験における一次制御テンプレート
22 nt G4 形成 DNA テンプレート	統合 DNA技術		円二色性分光法実験における一次G4形成テンプレート
24 x 24 mm カバーガラス	マリエンフェルド 優れた	100062	TIRF顕微鏡に必要
3-アミノプロピルトリエトキシシラン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A10668.22	カバーガラス機能化
647 nmレーザー	コヒーレント	1196627	染色/染料に対応する波長を選択選択肢
670 nm 蛍光フィルター	Chroma Technology Corp	ET655lp	関連する波長のみが検出器に通されることを保証します
アマシャム タイフーン 5 生体分子イメージャー	Cytiva	29187191	ゲル分析
Biotin-PEG-SVA (MW 5000)	Laysan Bio	BIO-PEG-SVA-5K-100MG	カバースリップ 機能化
デオキシヌクレオチド三リン酸溶液ミックス	イエナバイオサイエンス	NU-1005L	レプリケーションビルディングブロック
デジタルドライバス(115V)	バイオ・ラッド	1660571	加熱ソリューション
ジチオスレイトール	シグマ-アルドリッチ	646563	ジスルフィド結合還元
EM-CCDカメラ	アンドール	iXon 897	単一分子映画のキャプチャ
ホルムアミド	シグマ-アルドリッチ	F9037	DNA変性アンサンブル DNA複製アッセイ
ガスタイトシリンジ、1mL	SGE	21964	円二色性分光法用充填キュベット
CFI Apo TIRF 100x油浸対物レンズ付き倒立顕微鏡	ニコン	Eclipse Ti-E	は、単一分子TIRF顕微鏡法
J-810 分光光度計	Jasco	J-810	円二色性分光法の測定
mPEG-SVA (MW 5000)	Laysan Bio	MPEG-SVA-5K-100MG	カバースリップ 機能化
NanoDrop One 分光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ND-ONE	タンパク質とラベルの濃度を測定する
NeutrAvidin	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31000	DNAテンプレートを1分子実験中に官能化カバースリップにテザリング
ポリエチレンチューブ	インテック	BTPE-60	フローセルの構築に必要
クォーツキュベット、10 mm	Starna Scientific	1/Q/10/CD	円二色性分光法用サンプルを保持
シリンジポンプ	Adelab Scientific	NE-1002X	マイクロ流体フローセルを介してバッファーと基質を流すために使用されます
トリス-EDTAバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	93283	DNA溶液バッファー
酵母ポリメラーゼ&デルタ;	Michael O'Donnell Lab		DNA テンプレートの複製
Zeba スピン脱塩カラム、7 K MWCO、0.5 mL	Thermo Fisher Scientific	89882	ポリメラーゼ精製