私たちは、気液界面での大麻蒸気曝露を研究するための標準化された in vitro モデルを確立します。このモデルは、気化した大麻の影響を調べるための体系的なアプローチを提供し、喫煙の代替手段として大麻気化器への関心が高まっていることに対処します。
この記事について
サマリー
要約
大麻は、世界中で推定1億9,200万人が使用しています。ほとんどの人は、肺の健康に悪影響を与える可能性のある燃焼副産物を含む大麻の煙を吸い込むことによって大麻を使用します。これらのリスクに関する知識は、乾燥した大麻の花を燃やさずに加熱する大麻気化器への関心の高まりにつながっています。気化大麻は、吸入用のカンナビノイドを放出しますが、植物材料を低温で加熱します。現在、乾燥大麻蒸気の影響を評価するための標準化された in vitro モデルはありません。そこで、気液界面(ALI)での肺細胞培養物の曝露モデルを確立し、細胞を気化した大麻に頂端を曝露することで、肺上皮細胞の生理機能をより正確にシミュレートしました。このプロトコルは、細胞表面への大麻蒸気の一貫性と再現性のある送達を保証し、気化した大麻の細胞および分子への影響を調査するための信頼性の高いプラットフォームを提供します。この研究は、 in vitro での大麻蒸気送達方法を標準化した最初の研究であり、将来の前臨床大麻研究のベンチマークとして役立つ可能性があります。
概要
大麻は通常、娯楽目的であろうと薬用であろうと、関節の形で植物の花を燃やすことによる煙を吸い込むことによって使用されます。大麻の主な生物学的活性は、Δ9-テトラヒドロカンナビノール(Δ9-THC)やカンナビジオール(CBD)などのカンナビノイドによるもので、吸入すると体内に放出されます。大麻の煙には、発がん性物質、変異原性物質、催奇形性物質などの発熱性化合物も含まれており、これらは健康に悪影響を及ぼす可能性があります1。これらの懸念を考えると、燃焼せずに大麻の花を加熱する大麻気化器に目を向けることに関心があり、これにより、燃焼生成物なしでその後の吸入のためにカンナビノイドを放出できることを期待しています。大麻蒸気の化学成分を特徴付けるためにいくつかの研究が行われており、カンナビノイドだけでなくさまざまな呼吸器毒物の存在も示されており、これらのデバイスが安全であるという考えに挑戦しています2,3。気化した大麻が肺や他の臓器にどのような影響を与えるかについては、知識に大きなギャップがあります。
細胞培養研究は、吸入物質の特異的な影響を細胞レベルで分離して理解するために毒物学において不可欠であり、ヒト生物学に関連するハイスループットで費用対効果の高いメカニズムの洞察を可能にします。細胞の培養方法も、 in vitro 実験から得られる全体的な結果の重要な決定要因です。ほとんどの細胞培養研究は、細胞をプラスチック上で増殖させ、頂端を水性培地に曝露する水中環境を使用して行われます。しかし、気道上皮細胞は、この点で独特の課題を提示します。呼吸器系全体で、上皮細胞の頂端面は空気と接触しています。肺胞内では、上皮細胞は界面活性剤を産生しますが、他の気道上皮細胞は粘液を産生します。全体として、これは肺機能を保護し、維持します。水中培養物は、頂端の空気曝露を再現できないため、 in vivo 環境を正確にモデル化する能力が制限されます。水中培養モデルに代わるものとして、気液界面(ALI)での培養があり、呼吸器上皮細胞をコラーゲンでコーティングしたメンブレン上で増殖させ、基底外側に培地を装着しながら、先端を空気にさらします。ALIで培養された上皮細胞は、この環境で分極し、界面活性剤または粘液を生成し、接合を形成する能力があるため、呼吸器上皮のより正確なモデルです4。
従来のサブマージ細胞培養法が直面する追加の考慮事項は、カンナビノイドのような疎水性化合物は水性培地に溶けにくいことです5。エタノール抽出物は、水中培養物6,7,8,9,10,11,12で疎水性化合物を研究するための一般的な溶媒です。これらの抽出物は、疎水性化合物と親水性化合物の両方を水性媒体に溶解することを可能にします。ただし、制限は、化合物の凝集と培地と相互作用する化合物の可能性であり、どちらもバイオアベイラビリティを変化させる可能性があります13,14。近年、expoCube15(ALI/Transwell in vitro/ex vivo exposureシステム)などの先進露光装置を用いて、溶媒や培地を含まずにエアロゾル相化合物を細胞に送達することが可能になってきました。高度暴露システムを用いたエアロゾルおよび粒子懸濁液の直接沈着は、粒子の物理化学的特性を実質的に変化させることが知られている水中暴露に重要な収集再懸濁プロセスを排除する16。ここでは、ALIでの肺胞上皮細胞株の曝露に関する標準化されたプロトコルについて説明します。
プロトコル
1. ALIでの肺上皮細胞の培養
注:ここでは、ALIでA549細胞を培養するためのプロトコールについて説明します。研究で使用する細胞タイプの文献を確認してください。ALIで必要な細胞株は、分化、タイトジャンクションの形成、界面活性剤/粘液の生成に必要な時間が異なります。
- 細胞培養
- 50 mLの熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、5 mLのGlutamax、5 mLの抗生物質-抗真菌薬、および500 μLのゲンタマイシンをDMEMの500 mLボトルに加えて、培地を調製します。.
- 調製した培地を水浴に10〜15分間入れ、37°Cに温めます。
- バイオセーフティキャビネットに70%エタノールをスプレーし、拭き取ります。培地が温まったら、滅菌したバイオセーフティキャビネットの下に置きます。
- 培養フードの下で、約10 mLの培地を15 mLのチューブにピペットで移します。
- 液体窒素から細胞を回収し、水浴中で穏やかに攪拌して解凍します。
- 培養フードの下で、凍結バイアルの解凍した細胞を15 mLチューブにピペットで移します。
- 15 mLチューブを300 g で5分間遠心分離します。
- ペレットを乱さないように上澄みを慎重に取り除きます。
- ペレットを培地と混合し、T75 フラスコに移します。
- T75 フラスコを顕微鏡で確認します。
- 細胞を37°C、5%CO2 で飽和湿度でインキュベートします。
- 細胞培養培地は2〜3日ごとに更新してください。
- 目的の細胞数に達するまで細胞を継代し、増殖させます。1つの12ウェルプレートを播種するには、3×106 細胞が必要です。
- トランズウェルのコラーゲンコーティング
- コラーゲン溶液の調製
- IV型コラーゲン10 mgを20 mLのddH2Oに溶かし、50 μLの氷酢酸を溶解します。
- 37°Cで30分間インキュベートし、時々渦を巻きながら、完全に溶解するまでインキュベートします。
- 0.22μmフィルターでろ過して溶液を滅菌します。
- 溶液1.5 mLを15 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。
- トランズウェルフィルターにIV型コラーゲンをコーティング
- IV型コラーゲン(50μg/mL)1本のチューブを-20°Cから解凍します。
- 各トランズウェルフィルターに150μLのコラーゲンを加えます。
注:12ウェルプレートのみが露光システムに適合します。 - 蓋を開けたプレートをバイオセーフティキャビネット(BSC)に18時間放置して乾燥させます。
- 紫外線(UV)に30分間さらして滅菌します。
- プレートは4°Cでパラフィルムで包み、最大30日間保管してください。
- 細胞をプレーティングする前に、フィルターの両面を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいでください。
- コラーゲン溶液の調製
- インサート内の細胞の播種とALIへの移行
- プレートおよび細胞懸濁液の調製
- 予め加温した調製済み培地1.5 mLを12ウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。
- プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。
- 調製した培地に5×105 細胞/mLの濃度の細胞懸濁液を調製します。
- インサートにセルを播種する
- 調製した細胞培養プレートをインキュベーターから取り出し、滅菌したバイオセーフティキャビネットの下に置きます。
- 0.5 mLの細胞懸濁液(2.5 × 105 細胞/インサート)をインサートのメンブレンの上部にピペットで移します。
- プレートをプレートカバーで覆い、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに戻します。
- ALIの設立
- 細胞を播種してから24時間後に頂端培地を取り出します。
- 基底側培地を0.6 mLの調製済み培地と交換します。この時点で、細胞は頂端から空気にさらされ、ALIが確立されます。
- A549細胞をALIで最大2週間培養し、2日ごとに培地を交換して、以前に特徴付けられたように細胞が分化できるようにします4。
- プレートおよび細胞懸濁液の調製
2. LC/MSを用いた大麻蒸気曝露の線量測定評価
注:プロトコルのこの部分では、Δ9-THC濃度を分析することにより、各ウェル内に堆積した大麻蒸気の用量を特徴付けるために、無細胞法が使用されました。Δ9-THCはプラスチック材料に付着するため、サンプルの収集にはガラスバイアルのみを使用してください。この方法では、選択した大麻品種にΔ9-THCが含まれている必要があります。
- 露光システムの準備とセットアップ
- 指定された流路(図1A、B)に従って露光システムのチューブをセットアップします：ENDSユニット>コンデンサー>パフポンプ > Aeronebポンプ付きアイソメトリックサンプリングアセンブリ > expoCube>湿度センサー、フィルター付き > expoCube露光フローポート付き。
- 温度制御をオンにして、システムを35°Cおよび50°Cに加熱します。
- フローテストを実施して、システムに漏れがなく、圧力が正しく設定されていることを確認します(expoCubeのSCIREQテクニカルノートA Guide to Troubleshooting Uneven Flowsを参照)。
- Aeronebポンプを始動して、相対湿度が75%を超えるようにします。
- 線量測定試験と気化器の調製
- 大麻気化器の準備
- ハーブグラインダーを使用して大麻の花を挽きます。
- 0.25 gのアリコートを量り、ピルセパレーターを使用して各部分を整理します。
- 露光システム内の12ウェルトランズウェルプレートの露光列にステンレス製インサートを配置します。
- 大麻気化器の準備
- ステンレス鋼インサートの大麻蒸気への暴露
- 露出開始
- 気化器オーブンに0.25gの大麻を詰めます。
- 大麻気化器を安全なガスケットで露出システムのENDSユニットに取り付け、希望のパフレジメンを開始します。気化器を スマートパスレベル2 の温度設定に設定します。
注:この研究で使用した曝露システムには、レベル1(176-188°C)、レベル2(188-199°C)、レベル3(199-210°C)、レベル4(210-221°C)の4つのスマートパスレベルから選択できます。 - flexiWareソフトウェア(データ収集ソフトウェア、SCIREQテクニカルノート:Flex iWare 8のプロファイル作成ガイドを参照)でパフプロファイルを作成します。このプロトコルでは、70 mLのパフ容量を4パフ/分の頻度で使用します。
- 大麻を切り替える前に、大麻の花を気化器オーブンから取り出し、新しい0.25gの大麻を気化器に追加して、大麻を切り替える前に、乾燥ハーブ気化器を5分間実行します。2つの気化器を交互に使用して、連続暴露を行います。
- 目的の露光時間に達するまで、手順2.3.1.1-2.3.1.4を続けます。
- 各露光後、ピンセットを使用してインサートを露光システムから慎重に取り外し、以下に説明するようにサンプル収集の準備をします。
- 露出開始
- LC/MS分析用サンプルの収集と調製
- ピンセットを使用して、各露光に対応するフィルターを、10 mLのLC/MSグレードのメタノール(例:露光1、露光2、露光3)を含むラベルガラスバイアルに入れます。
- インサートを洗浄します。
- 露出した各ステンレス製インサートを、10 mLのLC/MSグレードのメタノールが入ったラベル付きガラスバイアルに入れます。
- 曝露ごとにバイアルにラベルを付けます(例:Exposure 1 Well 1-4)。
- 抽出物Δ9-THC
- ソニケーターバスを使用して、インサート付きのバイアルを10分間ソニケートし、Δ9-THCを抽出します。
- インサートを10mLの新鮮なメタノールを入れた2番目のガラスバイアルセットに移し、さらに10分間超音波処理します。
- 調製したすべてのサンプル(ウェル、洗浄、フィルター)をLC/MS分析に提出し、Δ 9-THCレベルを定量化します。
- 線量推定計算
- LC/MS分析結果を用いて、Δ9-THCの沈殿量を計算し、露光流のドシメトリ(フィルター内に沈着した量)とウェル内のドシメトリを決定します。
- 曝露フローフィルターとΔ9-THCのウェル堆積物との間の比率を計算します。
- この比率を使用して、曝露中に細胞に送達される線量を決定します。
3. 水晶振動子マイクロバランスを用いた大麻蒸気曝露の線量測定評価
注:この方法では、曝露中に堆積した大麻蒸気粒子の質量を評価するための水晶振動子マイクロバランス(QCM)のセットアップとキャリブレーションについて詳しく説明します。各QCMはリアルタイムの測定を提供し、大麻蒸気曝露の正確な線量測定を可能にします。
- 露光システムにおけるQCMの準備とセットアップ
- 前述のように露光システムを設定します。
- クリップコネクタを使用して各QCMを電子機器モジュールに取り付け、モジュールを7ピンコネクタでinExpose(吸入曝露プラットフォーム)ユニット入力に接続します。
- QCMインサートを露光システムの露光側のウェルプレートにセットし、QCMが適切に位置合わせされていることを確認します。
- QCMを取り付けた状態で露光システムを予熱し、システムが目標温度の35°Cおよび50°Cで安定するまで待ちます。
- 実験設定に応じてマイクロフローと露光フローを活性化します。
- QCM のキャリブレーション
- データ集録ソフトウェアのキャリブレーションウィザードを使用して、各露光実行の前にQCMを校正します。
- 青いキャリブレーションバーが安定するのを待ってから、[ 次へ ]を選択して、正確な質量計算のためにQCM共振周波数を記録します。
注:予想されるキャリブレーション範囲は-15%から15%です。偏差は、QCMが汚れている、LEMOコネクタが切断されているなどの問題を示している可能性があります。
- QCM信号のリアルタイムモニタリング
- QCM出力を監視します。システムは、堆積した累積質量を出力します。値は、データ集録ソフトウェアでは、グラフの一部として、また実際の現在値として表示されます。
注:各実験実行について、最大沈着量と最小沈着量もソフトウェアで報告されます。
- QCM出力を監視します。システムは、堆積した累積質量を出力します。値は、データ集録ソフトウェアでは、グラフの一部として、また実際の現在値として表示されます。
- QCMのクリーニング
- 精度を維持するために、各実験後にQCMを清掃してください。
- 各QCMインサート内に1 mLの70%イソプロピルアルコールを加えます。
- アルコール溶液を2〜3回上下にピペットで動かして、残留物を溶解します。
- アルコール溶液を取り出し、QCMをほこりのない環境で完全に風乾させてから、次に使用してください。
4. 細胞を大麻蒸気に曝露した結果
注:このプロトコルは、expoCubeシステムを使用してALIで培養された呼吸器細胞に対する大麻蒸気の影響を評価するように設計されています。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)や乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)などの曝露後アッセイにより、用量依存的な細胞毒性と代謝活性に関する知見が得られます。
- 大麻蒸気の供給
- 上記のように露光システムを設定します:システムが35°Cおよび50°Cの温度と相対湿度レベルが75%を超えていることを確認します。
- QCMを使用する場合は、クリップコネクタを使用してデバイスを電子機器モジュールに取り付け、モジュールを7ピンコネクタで吸入曝露ユニットの入力に接続します。単数形のQCMインサートをexpoCubeの露光側のウェルプレートにセットし、QCMがしっかりと位置合わせされていることを確認します。
- 露光システムを開き、細胞培養プレートを中に入れます。
- セクション2に基づいて、希望の期間パフレジメンを開始します。QCMを使用すると、堆積した総蒸気をリアルタイムで追跡できます。
- 曝露後、目的のアッセイ時点まで細胞をインキュベーターに戻します。
- 必要に応じて、基底外側コンパートメント、頂端コンパートメント洗浄(界面活性剤または粘液用)、細胞溶解物など、さまざまなコンパートメントからサンプルを採取します。
- 用量選択アッセイ:LDHおよびMTTアッセイを使用して、最適な用量と潜在的な細胞毒性を決定します。
- ALIでの細胞のLDHアッセイ
- 培地の回収:露光後の所望の時点で、基底外側コンパートメントから培地を回収します。
- 回収した培地100 μLを透明な96ウェルマイクロプレートに移します。
- 調製したばかりのLDH反応混合物100μLを各ウェルに加えます。
- プレートを室温(15-25°C)で30分間インキュベートし、光から保護します。
- 600 nmを超える基準波長を使用して、490〜492 nmの吸光度を測定します。
- 次の式を使用して細胞毒性を計算します。
細胞毒性(%)=(実験値-ネガティブコントロール)/(ポジティブコントロール-ネガティブコントロール)×100
- ALIでの細胞のMTTアッセイ
- 以前に確立されたALIでA549細胞を培養します。
- 曝露システムでの曝露送達後、目的のアッセイ時点まで細胞をインキュベーターに戻します。
- 1 mgのMTTを1 mLのPBSに溶解して、MTT溶液を作ります。
- 細胞の頂端側に500 μLのMTT溶液を、基底外側コンパートメントに500 μLのMTT溶液を加えます。
- 細胞を37°Cのインキュベーターに1時間戻します。
- すべてのメディアを慎重に取り外します。
- 500 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を頂端側に、1,000 μLのDMSOを基底外側側に加えます。
- 1時間インキュベートしてホルマザン結晶を溶解します。
- 頂端側と基底外側の両方から溶液を収集して組み合わせます。
- 540 nm (OD540) の吸光度を 690 nm (OD690) の基準値で測定します。
- 次の式を使用して細胞生存率を計算します。
細胞生存率 (%) = 100 × (平均OD_exposure/平均OD_negative対照)
結果
expoCubeシステムを用いた実験では、4つのウェルが大麻蒸気への曝露を受け、4つのウェルがビヒクルコントロールとして調整された空気に曝され、残りの4つのウェルがネガティブコントロールとして完全に囲まれている(図1C)17。この設定により、処理された状態、車両の状態、および陰性状態を正確に比較できます。このシステムは、細胞培養に適した環境を作り出すために加湿され(図2)、システム内の温度調節により、熱泳動による粒子の沈着が促進され、気化した化合物の細胞への効率的な送達が可能になる18。曝露を定量化するために、細胞曝露部位での大麻蒸気沈着のマーカーとしてΔ9-THCの量を測定します。この定量化は、曝露時間と用量を最適化するために重要であり、研究者は細胞培養実験で目的の用量を達成するために活性曝露期間を調整できます(図3)。曝露フローフィルターに収集された Δ9-THC と個々のウェルに堆積した量の比率を計算することで、細胞に供給される実際の線量を推定できます (表 1)。この計算された線量は、望ましい曝露範囲を通知し、大麻蒸気に対する細胞の反応を一貫して測定可能な方法で研究するための最適なパラメーターを決定するのに役立ちます。これは、選択した大麻株のカンナビノイドプロファイルに応じて、他のカンナビノイドに対して行うことができます。さらに、QCM分析を実行して、リアルタイムの大麻蒸気堆積を測定することができます。 図4 は、気化器と大麻材料が5分ごとに交換された30分間の時間経過にわたる大麻蒸気沈着を示しています。各ウェルは、時間の経過とともに質量が一貫して増加しており、大麻蒸気粒子全体が効果的かつ連続的に沈着していることを示しています。
図1:ALIでの大麻蒸気曝露のためのALI/Transwell in vitro/ex vivo 曝露システムの概略図。 (A)DaVinci MIQRO気化器を使用して大麻蒸気を生成しました。このサンプルは加湿され、等速性サンプラーを通って曝露部位にシャトルされます。コントロールユニットは、エアフロー出力と温度勾配の調整を可能にします。(B)露出システムのセットアップの写真。(C)expoCubeの内部は、大麻蒸気曝露のテスト列、調整された空気の車両制御列、および空気の流れの影響を受けない密閉されたネガティブコントロール列の3列に分かれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:経時的に記録された相対湿度(%)プロファイル。 このデータは、Aeronebsが作動し、平均湿度が75%に達し、維持されたときの相対湿度レベルを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:大麻蒸気に30分間曝露した後のLC/MS分析によるΔ9-THC沈着の定量化。(あ-C) Δ9-THC 沈着は、それぞれ 1.5 g の高 THC 大麻品種を使用して、3 回の独立した 30 分間の蒸気曝露後に各ウェルで測定されました。Δ9-THCレベルはLC / MSによって定量されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ALI/Transwell in vitro/ex vivo曝露システムにおける大麻蒸気沈着のQCM測定を30分間の曝露レジメンで行った(A-D)各グラフは、ウェル1〜4における大麻蒸気粒子の累積沈着を表しており、質量は経時的にマイクログラム(μg)で測定されています。堆積速度は、すべてのウェルで着実な蓄積を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 一次フローフィルターの堆積(μg) | ウェルデポジション(μg) | 井戸に堆積した一次流量の割合(%) | |
| ばく露1 | 2142.3 | 4.7 | 0.22 |
| 4.4 | 0.2 | ||
| 4.6 | 0.22 | ||
| 4.4 | 0.21 | ||
| ばく露2 | 2726.5 | 4.1 | 0.15 |
| 3.9 | 0.14 | ||
| 4.4 | 0.16 | ||
| 4.6 | 0.17 | ||
| ばく露3 | 2400 | 3.6 | 0.15 |
| 3.8 | 0.16 | ||
| 5 | 0.21 | ||
| 4 | 0.17 | ||
| 平均 | 2422.9 | 4.3 | 0.18 |
| 標準偏差 | 292.8 | 0.4 | 0.03 |
テーブル 1.ALI/Transwell in vitro/ex vivo 曝露システムにおける曝露フローフィルターと細胞曝露部位との間の Δ9-THC 沈着の比較。
ディスカッション
ALIでの細胞培養は、従来の水中培養と比較してin vivoの気道状態をより正確に表現する能力があるため、呼吸器研究において重要な方法である19。ALIで培養することで、肺上皮細胞を基底外側側の培養培地からの必須栄養素を維持しながら、肺上皮細胞をその頂端表面で直接空気にさらすことができます。この設定により、細胞は、吸入された粒子や病原体を捕捉し除去するために重要な呼吸防御メカニズムの主要成分である界面活性剤または粘液を産生することができる20,21,22。A549細胞は、in vitro研究に一般的に使用されていますが、ALIに使用できる多くの呼吸器上皮細胞培養の1つにすぎません。Silvaらは、鼻腔から肺胞22までのALIの呼吸上皮の細胞株と初代培養をレビューしました。提示されたALI曝露システムの柔軟性により、さまざまな細胞株や初代細胞に適合させることができます。
ALI培養物は、 in vitro 吸入研究、特に大気汚染物質、粒子状物質、およびその他の吸入性物質の研究における「ゴールドスタンダード」としてますます見なされるようになってきている23。ALIモデルの主な利点は、 in vivo のヒトへの影響により翻訳可能な洞察を提供できることにあります。しかし、顕著な欠点は、ALI曝露のための標準化されたプロトコルがないことであり、これは研究間の再現性と比較可能性に影響を与える。ギャップの1つは、標準化された露出ワークフローです。ALIで細胞を大麻蒸気にさらすことにより、大麻が細胞機能、生存率、および細胞毒性に与える影響を評価できます。これらの曝露により、細胞毒性、炎症、酸化ストレスのマーカーを含む生物学的転帰の詳細な評価が可能になります。沈着したカンナビノイドを正確に定量することで、大麻蒸気(およびその他の形態の大麻製品)の細胞への影響に関する再現性のある研究が可能になり、制御された実験室環境での潜在的な健康への影響についての理解が深まります。
高度な曝露システムは、細胞表面への粒子の直接沈着を可能にすることで、従来の水中培養の限界に対処し、それによってより生理学的に関連性のある曝露を提供します。これにより、溶剤や担体の潜在的な影響も減少します。これらの溶剤を必要とせずに直接粒子を堆積させることにより、露光システムはビヒクル関連の影響を最小限に抑えるのに役立ちます。それにもかかわらず、車両関連の考慮事項がいくつかあります。例えば、制御されていない湿度レベルは、望ましくない細胞ストレス24を引き起こし、実験結果に影響を与える可能性がある。最適なレベルに達するように湿度を慎重に調整することは、細胞の安定性と結果の精度を維持するために不可欠です。さらに、各粒子、エアロゾル、またはガス混合物は、細胞表面25上の沈着を変化させる可能性のある、独自の物理化学的特性を有する。したがって、各製品の曝露レジメンを特徴付けることが重要です。粒子の堆積に影響を与える可能性のある要因には、熱泳動、高温の領域から低温の領域への粒子の移動が含まれます26。熱泳動は、粒子を細胞に向けるのを助け、堆積効率を高めます。
ALIで露光システムを使用する場合、特にエアロゾルや粒子が関与する場合、投薬の一貫性と精度はさらなる課題となります。肺における in vivo 粒子沈着は、粒子サイズ、形状、密度、溶解度、ならびに曝露される肺の特定の領域27の影響を受ける複雑なプロセスである。これらの要因により、沈着速度にばらつきが生じ、 in vitroで再現するのが困難な場合があります。マルチパス粒子線量測定(MPPD)などの数理モデルは、 in vivo 沈着速度を推定し、 in vitro 線量換算をガイドするための有用なツールである28。しかし、 in vitro での投与と in vivo での曝露シナリオのマッチングは、特に不均一な組成を持つ複雑なエアロゾルでは依然として課題です。
無細胞用量の特性評価では、化合物がインサートの壁と細胞が通常位置する塩基の両方に付着する可能性があるため、ステンレス鋼インサート洗浄は沈着を過大評価する傾向があることに注意することが重要です。QCMは、細胞培養場所に直接沈着した質量のみを測定することで、細胞曝露に特に関連する沈着をより正確に評価できるという利点があります。
毒物学がより生理学的に関連性の高いモデルに移行するにつれて、統一されたALI曝露プロトコルの採用は、 in vitro 所見と in vivo のヒト反応との間のギャップを埋める基本となり、最終的には呼吸器毒性物質とその健康への影響のより信頼性の高い評価をサポートします。
開示事項
PGとBUはSCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc.で雇用されています。他の著者には開示すべき対立はありません
謝辞
この研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)のプロジェクト助成金162273の支援を受けました。CJBは、Fonds de Recherche du Québec -Santé(FRQS)の支援を受けました。この研究は、ETWへのMitacs助成金 #IT34076 によっても支援されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 mL遠心分離管、ラック(ポリスチレンラック)、滅菌 | トリオールバイオテック社 | MBI601051C | |
| 30 mL ガラス バイアル | Thomas Scientific | 1755F32 | |
| A549 細胞 | ATCC | CCL-185 | |
| 抗生物質 - 抗真菌薬 (100x) | Wisent | 450-115-EL | |
| 大麻ハーブ グラインダー | Genchi | https://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i w7k_cGpHrEm0VunfiDZqO0U1mT NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3 SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4 97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8 vauHRtueWaDqYEPOCIAy956bGf PwXu2Gp9nCWVhFCo1gHqgeh1N nrWwD3lJ_r_wx2GoauoNdVw9eH A2QYc1tx3XKMidd2YkVRF_ABYL ZJd0EIDxi22hBnzaM4KklLO6Ep0v OGb1QifhM062KUvTTY9PAOUn8F -O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92 Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_ K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj CN3LXumyu8Q&dib_tag=se& キーワード=herb%2Bgrinder&qid=1736346511& プレフィックス=herb%2Bgrinder%2Caps% 2C168&sr=8-10&th=1 | |
| ヒト胎盤由来のコラーゲン、IV 型 | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| Costar 12 mm トランスウェル、0.4 &m 細孔ポリエステル膜 Inserts | Stemcell Technologies | 38023 | |
| 細胞毒性検出キット (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Davinci MIQRO-C ドライハーブ気化器 | DAVINCI | https://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c | |
| ジメチルスルホキシド | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM 培地 | Wisent | 319-005-CL | |
| 大麻の花 | Sociétéquébécoise du cannabis | https://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup Value&fv1=THC | カンナビノイド含有量: 17–23%THC<0.1% CBD |
| ウシ胎児血清 | Wisent | 080-150 | FBS |
| flexiWare | SCIREQ | https://www.scireq.com/downloads/ | バージョン 8.4.1 |
| ゲンタマイシン | ウィセント | 450-134-XL | |
| 氷酢酸 | Sigma-Aldrich | 100063 | |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| inExpose expoCube in vitro 曝露パッケージ | SCIREQ | IX-XCP | |
| Infinite 200 PRO | TECAN | 30125944 | |
| LC/MS グレード メタノール | Sigma-Aldrich | 106035 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | |
| T175 EasYFlask、TC 表面、フィルターキャップ | ThermoFisher Scientific | 159910 | |
| T75 EasYFlask、TC 表面、フィルターキャップ | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| アゾリルブルー臭化テトラゾリウム | グマアルドリッチ | M 2128 | MTT |
| トリトンX-100 | グマアルドリッチ | 108603 | |
| 洗浄機バス | VWR | 18303 | ソニケーターバス |
| ウィークリーピルオーガナイザーHealthSmart | 640-8223-0000 |
参考文献
- Graves, B. M., et al. Comprehensive characterization of mainstream marijuana and tobacco smoke. Sci Rep. 10 (1), 7160(2020).
- Lanz, C., Mattsson, J., Soydaner, U., Brenneisen, R. Medicinal cannabis: in vitro validation of vaporizers for the smokefree inhalation of cannabis. PLoS One. 11 (1), e0147286(2016).
- Arlen, M., et al. Cannabis vaping elicits transcriptomic and metabolomic changes in inflammatory, oxidative stress and cancer pathways in human bronchial epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , (2025).
- Wu, J., et al. Characterization of airliquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Braz J Med Biol Res. 51 (2), e6950(2017).
- Kaur, K., et al. Comparison of biological responses between submerged, pseudoairliquid interface, and airliquid interface exposure of A549 and differentiated THP1 cocultures to combustionderived particles. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng. 57 (7), 540-551 (2022).
- Adekola, M. B., et al. Invitro antioxidant and antiinflammatory activities of ethanol stembark extract of Blighia sapida K.D. Koenig. J Pharm Anal. 12 (2), 350-354 (2022).
- Final report on the safety assessment of capsicum annuum extract, capsicum annuum fruit extract, capsicum annuum resin, capsicum annuum fruit powder, capsicum frutescens fruit, capsicum frutescens fruit extract, capsicum frutescens resin, and capsaicin. Int J Toxicol. 26 (Suppl 1), 3-106 (2007).
- Daltro, S. R. T., et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of Physalis angulata concentrated ethanolic extract. Planta Med. 87 (1-02), 160-168 (2021).
- Araujo, J., et al. Antioxidant and in vitro cytogenotoxic properties of Amburana cearensis (Allemão) A.C.Sm. leaf extract. Drug Chem Toxicol. 46 (1), 104-112 (2023).
- Spósito, L., et al. In vitro and in vivo antihelicobacter pylori activity of Casearia sylvestris leaf derivatives. J Ethnopharmacol. 233, 1-12 (2019).
- Ngulde, S. I., et al. Ethanol extract of Securidaca longipedunculata induces apoptosis in brain tumor (U87) cells. Biomed Res Int. 2019, 9826590(2019).
- Phuwajaroanpong, A., et al. In vitro and in vivo antimalarial activities and toxicological assessment of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. J Evid Based Integr Med. 25, (2020).
- Upadhyay, S., Palmberg, L. Airliquid interface: relevant in vitro models for investigating air pollutantinduced pulmonary toxicity. Toxicol Sci. 164 (1), 21-30 (2018).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and oxidative stress responses of an alveolar epithelial cell line to airborne zinc oxide nanoparticles at the airliquid interface: a comparison with conventional, submerged cellculture conditions. Biomed Res Int. 2013, 652632(2013).
- Ritter, D., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
- Loret, T., et al. Airliquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Part Fibre Toxicol. 13 (1), 58(2016).
- Detlef, R., et al. In vitro inhalation cytotoxicity testing of therapeutic nanosystems for pulmonary infection. Toxicol In Vitro. 63, 104714(2020).
- Ritter, D., et al. Development and evaluation of an in vitro test system for toxicity screening of aerosols released from consumer products and first ap-plication to aerosols from a hair straightening process. Appl In Vitro Toxicol. 4 (2), 180-192 (2018).
- Silva, S., Bicker, J., Falcão, A., Fortuna, A. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Kingma, P. S., Whitsett, J. A. In defense of the lung: surfactant protein A and surfactant protein D. Curr Opin Pharmacol. 6 (3), 277-283 (2006).
- Soraia, S., Joana, B., Amílcar, F., Ana, F. Airliquid interface (ALI) impact on different respiratory cell cultures. Eur J Pharm Biopharm. 184, 62-82 (2023).
- Graf, J., TrautmannRodriguez, M., Sabnis, S., Kloxin, A. M., Fromen, C. A. On the path to predicting immune responses in the lung: modeling the pulmonary innate immune system at the airliquid interface (ALI). Eur J Pharm Sci. 191, 106596(2023).
- Zavala, J., et al. Regulating temperature and relative humidity in airliquid interface in vitro systems eliminates cytotoxicity resulting from control air exposures. Toxicol Res (Camb). 6 (4), 448-459 (2017).
- Speen, A. M., et al. Benchmark dose modeling approaches for volatile organic chemicals using a novel airliquid interface in vitro exposure system. Toxicol Sci. 188 (1), 88-107 (2022).
- Seidel, S. A., et al. Microscale thermophoresis quantifies biomolecular interactions under previously challenging conditions. Methods. 59 (3), 301-315 (2013).
- Morawska, L., Buonanno, G., Mikszewski, A., Stabile, L. The physics of respiratory particle generation, fate in the air, and inhalation. Nat Rev Phys. 4 (11), 723-734 (2022).
- Kuempel, E. D., Sweeney, L. M., Morris, J. B., Jarabek, A. M. Advances in inhalation dosimetry models and methods for occupational risk assessment and exposure limit derivation. J Occup Environ Hyg. 12 (Suppl 1), S18-S40 (2015).
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