In-Cloning ツールキットを使用したモジュラークローニング (MoClo) によるポリシストロニックオペロンの標準化されたモジュラーアセンブリ

Summary

この記事では、モジュラークローニング(MoClo)をポリシストロンオペロンクローニングにどのように適応させることができるかを示すステップバイステップのプロトコルを紹介します。

Abstract

モジュラークローニング(MoClo)ツールキットは、マルチ遺伝子コンストラクトの迅速な組み立てを可能にします。これらは、認識部位の外側を切断するIIS型制限酵素を使用するゴールデンゲートクローニングに基づいています。認識配列と切断配列は分離されているため、IIS型制限酵素によって作成されたオーバーハングを意図的に選択することができ、クローニング戦略は通常、正しく結合されたDNA断片の切断を妨げます。これにより、1回の反応で複数のDNAフラグメントを非常に効率的に組み立てることができます。MoCloでは、プロモーター、リボソーム結合部位、コード配列、ターミネーターなどの個々の機能DNA部分、および高次アセンブリに標準化されたオーバーハングが割り当てられ、再利用可能な部品ライブラリを作成できます。細菌MoCloツールキットの大部分は、モノシストロン転写ユニットのクローニング用に設計されており、ポリシストロンオペロンを組み立てるための構造化された経路を提供しません。このプロトコルは、 In-およびOut-Cloning ツールキットを使用したポリシストロン転写ユニットの組み立てを示します。同じアプローチを他のMoCloツールキットにも適用できます。

Introduction

分子クローニングは、プラスミドなどのレプリコンに組換え DNA を導入するもので、分子生物学の基礎的な方法論です。DNAの構築と組み立ての方法は、ここ数十年でますます洗練されています。現在では、研究者は合成されたDNA^から合成染色体全体、さらにはゲノムを構築できます1。従来の分子クローニングは、アドホッククローニング戦略に依存することが多く、大規模なマルチ遺伝子コンストラクトには手間と費用がかかる^{可能性があります2。}近年、ゴールデンゲート(GG)クローニングおよび派生した階層型モジュラークローニング(MoClo)ツールキット^2,3は、時間とコスト効率の高いDNAアセンブリを可能にする一般的なソリューションとなっています。

IIS型制限酵素は、方向性(非回文)配列を認識し、この認識配列の外側を切断するエンドヌクレアーゼ^です4。その結果、切断によって作成されたオーバーハング配列は認識部位に依存しませんが、^選択することができます4。さらに、機能的DNA断片、ここでは「パーツ」と呼ばれるものは、切断が結合されるパーツ²の末端から認識部位を除去するように設計することができる。GGクローニング戦略はこれを活用して、ワンポ^{ット反応で}効率的なマルチパートDNAアセンブリを可能にします5。MoClo ツールキットは GG クローニングに基づいており、マルチ遺伝子コンストラクトを組み立てるためのモジュール式で階層的な方法を提供することを目的としています。部品の組み立てに使用されるオーバーハングは標準化されており、再利用可能で交換可能な部品ライブラリの作成が可能です。MoClo ツールキットは、複数の DNA 配列を受け入れ、組み立てられた生成物を放出するように設計されたアクセプタープラスミドに依存しています。各アクセプタープラスミドには、2つの異なるIIS型酵素の2つの認識部位が含まれており、1つはDNAカーゴの受容に使用され、もう1つは組み立て^{られたDNAの}放出に使用されます^3,6。その原理の図を図1に示し、個々の部分であるターミネーターをMoCloアクセプタープラスミド(レベル0)にクローニングします。アクセプタープラスミドとインサートの両方が制限酵素BbsIによって切断され、互換性のあるオーバーハングを残し、BbsI認識部位が除去されます。したがって、正しくライゲーションされたプラスミドは、もはやBbsIによって切断されません。得られたプラスミドをIIS型酵素SapIで切断すると、次のアセンブリステップ(レベル1)で以前に挿入されたフラグメントが放出されます。

このプロトコルでは、In-およびOut-Cloning MoCloツール^{ボックスが使用されます}7。ここで、レベル0プラスミドには、5'非翻訳領域(UTR)を持つプロモーター、コード配列、3'UTRを持つターミネーターなど、定義された基本的な遺伝的部分が含まれており、図1はレベル0の概略図を示しています。レベル1では、複数のパーツが転写ユニット(TU)に組み立てられており、図2はレベル1のパーツとクローニングの概略図を示しています。インクローニングとアウトクローニングMoClo は、3 ヌクレオチドのオーバーハングを作成する IIS 型酵素を使用して、レベル 1 の転写ユニットを瘢痕なく組み立てるように設計されています。これにより、オーバーハングは、ATG開始コドンとTGA停止コドンをアセンブリに使用して、コーディングシーケンスのコドンラスター内に完全に収めることができます。レベルMおよびPは、レベル1プラスミド^3,8から放出された複数の転写ユニットの組み立てに使用されます。図3は、レベルMとPにクローニングするための部分の概略図と、レベルMのバイシストロンオペロンの組み立てを示しています(バイシストロンオペロンは、複数のコード配列(CDS)を発現する転写単位です)。レベルPおよびMは、組み立てることができる部品の数に理論上の制限がないように、一方から他方への反復サイクルを可能にするように設計されていますが、このプロトコルの主な焦点はバイシストロンオペロンのアセンブリを示すことであるため、これはこのプロトコルでは説明されていません。組み立てることができる部品の数に制限はありませんが、組み立てることができる構成のサイズには制限があります。最大100,000 bpは、MoClo キット⁹ を使用して組み立てられています。さらに、大きなコンストラクトまたは有毒な遺伝子を含むコンストラクトは、細胞に負担をかける可能性があります。これらの例については、修正されたプロトコルが公開されています¹⁰。

インクローニングとアウトクローニング は当初、ポリシストロン転写ユニットの組み立てのためのスキームを記述していませんでした。ポリシストロンオペロンは、細菌^11、12、13において非常に一般的な遺伝子構成モードであり、したがって、モジュール化された方法でボトムアップアセンブリに注目すべき関心があります¹⁴。ここでは、 インクローニングとアウトクローニング を用いたポリシストロンオペロンを組み立てるための構造化されたスキームについて説明します。提示されたスキームは、ポリシストロン転写ユニット内のコーディング配列の位置、ならびにモノシストロン転写とポリシストロン転写の両方からなるアセンブリの位置を簡単に交換することを可能にする。

次のステップバイステップのプロトコルは、 In-およびOut-Cloningを使用したポリシストロンオペロンの設計とクローニングを示しています。ポリシストロン転写ユニットをクローニングするための提示された戦略は、他のMoCloツールキットに簡単に適応できます。

Protocol

注:このプロトコルは、 インクローニング 標準の3つのレベル(0、1、およびM)によるポリシストロンオペロンの設計と組み立てについて説明します。ここで組み立てられたポリシストロンオペロンは、プロモーターから始まり、リボソーム結合部位(RBS)、コード配列(CDS)、2番目のRBS、2番目のCDS、そして最後にターミネーターが続きます(図S1)。設計されたクローニング戦略が正しいことを確認するために、分子クローニングソフトウェアを使用して インシリコでクローニングをシミュレートすることを強くお勧めします。ここでは、レベル0の部品としてプロモーターを組み立て、コード配列とターミネーターを持つRBSをレベル1の転写ユニットに組み立て、レベルMのバイシストロンオペロンを組み立てる例を説明し、アセンブリ全体の概略図を 図S1に示します。

1. レベル0:部品の家畜化

注:「家畜化」という用語は、分子部分がMoClo部品ライブラリに統合されており、MoCloキットのレベル全体で組み立てることができることを示すために使用されます。典型的には、キット内で使用されるタイプIIS制限酵素のすべての認識部位は、例えば、同義再コード化によって、家畜化される部分から除去される。

1. インサートのデザイン
   1. プロモーター、CDS、ターミネーターなどの分子部品をオペロンに組み立てます。
      注:このプロトコルでは、オペロンはプロモーターP_LuxBで開始され、これは誘導化合物N-(β-ケトカプロイル)-L-ホモセリンラクトン(OC6)¹⁷の存在下でタンパク質LuxRによって活性化される可能性があります。GFPはオペロンの最初のCDSです。そのRBSはiGEM BBa_B0064です。GFPの後には、非終端リンカーである「ターミネータブリッジ」が続きます。2番目のCDSはmTurquoiseです。そのRBSは、RBS計算機¹⁸によって設計されている。最後に、オペロンはターミネータL3S2P21¹⁹で終了します。
   2. 部品を組み立てる位置を選択し、概要を 図1に示します。位置に基づいて、GGで使用するアクセプタープラスミドを選択します。
      注: 部品は、後でさまざまな位置で使用するために家畜化できます。たとえば、プロモーターは、後で5'UTR部品(pSL252)と接続して単一の部品として組み立てることも、すでに含まれている5'UTRを使用して飼いならすこともできます(pSL099)。CDSは、タグなしで組み立てる(pSL102)、N末端タグで組み立てる(pSL104)、C末端タグで組み立てる(pSL101)、またはN末端タグとC末端タグの両方で組み立てる(pSL103)に4つのアクセプタープラスミドで組み立てることができます。与えられた例では、プロモーターはpSL252に家畜化され、最初のRBSはpSL253に家畜化され、最初のCDSはpSL102に家畜化され、ターミネーターブリッジはpSL106に家畜化され、2番目のRBSはpSL099に家畜化され、2番目のCDSはpSL102に家畜化され、ターミネーターはpSL106に家畜化される。
   3. 選択したアクセプタープラスミドに基づいて、設計されたインサートにエクステンションを追加します。 表1は 、アクセプタープラスミドごとのGGアセンブリに必要な拡張の概要を示しています。これらの伸長は、PCR用のプライマーの設計中、2つのオリゴをアニーリングして部品を構築する場合のオリゴの設計中、または遺伝子合成中に追加する必要があります。
      注:パーツを飼いならすためには、パーツ自体にキット内で使用されるタイプIIS酵素、SapI(5'-GCTCTTC-3')、BbsI(5'-GAAGAC-3')、およびBsaI(5'-GGTCTC-3')の認識部位が含まれていないことを確認する必要があります。部品に認識部位が存在すると、最終製品は使用されたタイプIIS酵素によって切断できるため、正しい組み立ての効率が大幅に低下します( 図1を参照)。
2. GG反応
   1. GG反応では、目的のインサート50 fmol、アクセプタープラスミド50 fmol、1 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、1 μLのT4リガーゼ、および1 μLのBbsIを加えます。ヌクレアーゼフリーの水を総量10 μLまで加えます。さらに、目的のインサートなしで同じ反応を持つネガティブコントロールを含めます。
   2. サーモサイクラーで次のプログラムを実行します:37°Cで3分間(37°Cが制限酵素の最適温度)および16°Cで4分間(16°CがT4リガーゼの最適温度)の25サイクル、続いて50°Cで20分間最終消化(50°Cで、T4リガーゼは活性をほとんどまたはまったく示さず、 制限酵素がまだ機能している間、最終生成物中の切断されていないアクセプタープラスミドの量が制限されます)、および酵素の熱不活性化を80°Cで20分間(80°Cで、すべての酵素が熱不活化され、反応が終了します)⁶。
   3. 50μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞に5μLのGG反応を添加することによりGG反応を形質転換し、以前に公開されたプロトコル¹⁵に記載されているように、回復ステップで熱ショック形質転換を行う。
   4. 形質転換成長物100 μLを100 μg/mLのスペクチノマイシンとともにLuria-Bertani(LB)寒天プレートに広げます。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
   5. 両方のプレート上の白いコロニーの数を数えることにより、ネガティブコントロールの変換効率を完全なアセンブリの変換効率と比較します。アセンブリにネガティブコントロールの約10倍(またはそれ以上)の白いコロニーがある場合は、次のステップに進みます。
      注:結果として得られるコロニーの大部分は白で、赤いコロニーのごく一部のみである必要があります。 In-Cloning ツールキットのアクセプタープラスミドには、 mCherry (レベル0およびレベル1)または LacZα (レベルMおよびレベルP)のいずれかを含むデュアルセレクションカセットと、ジャイレース阻害剤をコードする ccdB 遺伝子があります。GG反応の形質転換は ccdB 感受性大 腸菌 細胞で行われるため、組み立てられたプラスミドを持つ細胞のみが増殖できますが、元のアクセプタープラスミドは増殖できません。 ccdB に敏感なひずみの例としては、DH5αやTOP10などがあります。 mCherry/LacZα は、 ccdB メカニズム¹⁶から逃れる細胞を視覚的に識別することができます。
   6. 各アセンブリについて、ピペットチップでコロニーの材料をピックアップし、それぞれ100 μg / mLスペクチノマイシンを含む5 mLのLB培地に再懸濁し、250 rpmの振とうインキュベーターで37°Cで一晩インキュベートすることにより、2つの白いコロニーを培養します。製造元の指示に従ってカラムベースのプラスミド抽出を実行します。抽出されたプラスミドがサンガーシーケンシングによって期待される配列を持っていることを確認します。

2. レベル 1: ポジションの決定

注:レベル1は、部品の飼いならしとポリシストロンオペロンの組み立ての間のレベルです(図2)。ここでは、最終構造における中間アセンブリの位置が決定されます。オペロン内のレベル1アセンブリの位置は、別のレベル1アクセプタープラスミドを使用して変更できます。与えられた例は、バイシストロニックユニットの組み立てを説明していますが、与えられたスキームは、最大6つのコーディングシーケンス(それぞれRBSを使用)の組み立てに簡単に適合させることができます。さらに、より多くのコーディングシーケンスを組み立てるには、レベルPとMの間のサイクルが必要です。レベルPとMの間の反復サイクルでは、単一のオペロンに組み立てることができる符号化シーケンスの数に固定された上限はありません。

1. 部品とアクセプタープラスミドの選択
   1. トランスクリプションユニットに組み立てるレベル0のパーツを選択します。これらには、少なくともプロモーター、CDS、およびターミネーターが含まれている必要があります。
   2. オペロンで転写ユニットを組み立てる位置を選択します。その位置に基づいて、適切なアクセプタープラスミドを選択します。概要を 図 2 に示します。
      注:例として示されているバイシストロンオペロンを構築するための7つのDNAフラグメントは、2つのレベル1コンストラクトに組み立てられています。プロモーター、最初のRBS、最初のCDS、およびターミネーターブリッジはpSL68に組み立てられます。2番目のRBS、2番目のCDS、およびターミネータはpSL69に組み立てられています。
2. GG反応
   1. GG反応では、所望の各インサート50 fmol、アクセプタープラスミド50 fmol、1 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、1 μLのT4リガーゼ、および1 μLのSapIを加えます。ヌクレアーゼフリーの水を総量10 μLまで加えます。
   2. サーモサイクラーで次のプログラムを実行します:37°Cで3分間、16°Cで4分間の25サイクル、続いて50°Cで20分間の最終消化、および80°Cで20分間酵素の熱不活化^6。
   3. オプション:0.5 μLのSapIをGG反応に加え、37°Cで1時間インキュベートします。
      注:SapIは、他の使用されるIIS型制限酵素ほど安定していません。GG反応後のSapIによる消化ステップは、再ライゲーションされたアクセプタープラスミドを運ぶコロニーの量を減少させることがわかっています。SapIにはアイソシゾマーであるBspQIがあり、この最終消化ステップを必要としない場合があります。
   4. 50 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞で5 μLのGG反応を形質転換し、好ましくはステップ1.2.3で実行したように回収ステップを使用して、熱ショック形質転換を実行します。
   5. 形質転換成長物100 μLを100 μg/mLのアンピシリンでLB寒天プレートにプレートします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
   6. それぞれについて、ピペットチップでコロニーの材料をピックアップし、それぞれ100 μg / mLのアンピシリンを含む5 mLのLB培地に再懸濁することにより、2つの白いコロニーを培養します。37°Cで250rpmの振とうインキュベーターで一晩インキュベートします。製造元の指示に従ってカラムベースのプラスミド抽出を実行します。
   7. BbsIで制限ダイジェストを使用して正しいアセンブリを確認し、カットアウトのサイズがチップの予想サイズと一致していることを確認します。1 μLの適切な10倍消化バッファーと1 μLのBbsIを添加して、1000 ngのプラスミドDNAを消化します。ヌクレアーゼフリーの水を総容量10 μLまで加えます。反応を37°Cで15分間インキュベートします。
   8. 消化したプラスミドを1%アガロースゲルにロードしてゲル電気泳動を行い、ゲルを100 Vで35分間実行します。
      注:予想されるプラスミドの インシリコ 消化を実行して、アガロースゲルをシミュレートし、結果を予測することができます。

3.レベルM:ポリシストロンオペロンの組み立て

注:このステップでは、ポリシストロンオペロンが組み立てられます。バイシストロンオペロンの場合、2つのレベル1インサートが位置1と2に組み立てられます。したがって、アクセプタープラスミドpMA60が選択されます。さらに、エンドリンカーが必要です。すべてのレベルMおよびPアクセプタープラスミドは、2番目のオーバーハングとしてオーバーハングGGGAを持っています。エンドリンカーは、インサートプラスミドとアクセプタープラスミドをブリッジし、レベルPコンストラクトをレベルMに、またはその逆に組み立てることができます。2 つのレベル 1 インサートのレベル P アセンブリの場合、エンドリンカー pMA668 が使用され、3 番目で最後の位置になります。レベルMとPの概要とクローニングステップの視覚化を 図3に示します。レベルM(またはP)のみでアセンブリすることで、最大6つのコーディング配列のオペロンをクローン化できます(1〜6位)。位置 7 はエンドリンカーによって取得されています。オペロン内のより多くの符号化配列の組み立ては可能ですが、このプロトコルでは説明されていないレベルM(またはP)へのサイクルが必要です。

1. GG反応では、所望の各インサート50 fmol、アクセプタープラスミド50 fmol、10 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、1 μLのT4リガーゼ、および1 μLのBbsIを加えます。ヌクレアーゼフリーの水を総量10 μLまで加えます。
2. サーモサイクラーで次のプログラムを実行します:37°Cで3分間、16°Cで4分間の50サイクル、続いて50°Cで20分間最終消化し、80°Cで酵素を20分間熱不活化^{します6。}
3. 50 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 細胞で5 μLのGG反応を形質転換し、ステップ1.2.3で実行したように回復ステップで熱ショック形質転換を実行します。
4. 100 μg/mLのスペクチノマイシンを入れたLB寒天プレート上に形質転換成長物100 μLを広げます。プレートを37°Cで一晩インキュベートするか、アセンブリの代謝負荷または毒性が予想される場合は30°Cでインキュベートします。
5. アセンブリごとに、2つの白いコロニーから培養物を作ります。この目的のために、ピペットチップをコロニーに浸し、それを使用して5 mLのLBに100 μg / mLのスペクチノマイシンを接種します。37°Cまたは30°Cで250rpmの振とうインキュベーターで一晩インキュベートします。製造元の指示に従ってカラムベースのプラスミド抽出を実行します。
6. 手順 2.2.7 で実行したように、BsaI を使用した制限ダイジェストを通じて正しいアセンブリを確認し、カットアウトのサイズがインサートの予想サイズと一致することを確認します。
   注:コンストラクトは長すぎて、確認のためにサンガーシーケンシングでカバーできない場合があります。その後、複数のシーケンシングサービスプロバイダーから商用サービスとして利用できる全プラスミドシーケンシングによって確認できます。

Results

ここでは、レベル0からレベルMまでのポリシストロンオペロンをボトムアップで組み立てた結果を示しています(図S1)。オペロンはプロモーターP_LuxBで始まり、誘導化合物N-(β-ケトカプロイル)-L-ホモセリンラクトン(OC6)¹⁷の存在下でタンパク質LuxRによって活性化される可能性があります。GFPはオペロンの最初のCDSであり、そのRBSはiGEM BBa_B0064です。GFPの後には、非終端リンカーである「ターミネータブリッジ」が続きます。第2のRBSはRBS計算機¹⁸によって設計され、第2のCDSはmTurquoiseである。最後に、オペロンはターミネータL3S2P21¹⁹で終了します。

ターミネーターの家畜化
設計されたポリシストロンオペロンを組み立てるには、すべての...

Discussion

分子クローニングは、特にアドホッククローニング戦略では、時間がかかり、面倒な場合があります。MoClo ツールキットは、モジュール性、階層的なアセンブリ、および高効率のワンポット反応によって分子クローニングを改善できます。彼らはゴールデンゲート反応によるDNA集合に依存しています。標準化されたオーバーハングのおかげで、分子部分のライブラリを再利用し^、他の人と共有することができます^3,6。パーツの再利用性により、マルチ遺伝子構築物のプールまたは配列された組み合わせライブラリの作成が可能になります。これにより、例えば、理想的なプロモーター強度や酵素の同一性を見つけるための異種経路の最適化が容易になります。この方法の標準化された性質により、自動化が可能になり、DNA のハイスループット アセンブリが可能になります。さらに、In- & Out-Cloning MoClo ツールキットのアウトクローニングスキー...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アンピシリン	メルク・ライフサイエンス	A9518
細菌寒天	フィッシャー・サイエンティフィック	P0011B
BBSI-HF	ニューイングランド・バイオラボ	R3539
BsaI-HF V2	ニューイングランド・バイオラボ	R3733
E. coliDH5α有能な細胞
エッペンドルフ Mastercycler ネクサス・サーマルサイクラー	エッペンドルフ	6333000014
EzDrop 1000マイクロ体積分光光度計	ブルーレイ・バイオテクノロジー	BRED-1000
GeneJETプラスミドミニプレップキット	サーモ・サイエンティフィック	K0503
イン&アウト- クローンツールキット
リガーゼバッファー	ニューイングランド・バイオラボ	B0216
NaCl	フィッシャー・サイエンティフィック	BP358
ニューブランズウィック州イノバリッジ; 42/42R - 積み重ね可能なインキュベーターシェーカー	エッペンドルフ	M1335-0080
フェノブース+	シンガー楽器	PHB-007
サップ	ニューイングランド・バイオラボ	R0569
スペクチノマイシン	メルク・ライフサイエンス	S4014
標準的なラボウェア
T4 DNAリガーゼ	ニューイングランド・バイオラボ	M0202
サーモミックスMM	B. ブラウン・バイオテック・インターナショナル
トリプトン	フィッシャー・サイエンティフィック	LP0042B
酵母抽出物	フィッシャー・サイエンティフィック	LP0021B