共焦点顕微鏡法を用いた生細胞のミトコンドリア形態の決定

サマリー

この研究では、ステップバイステップのプロトコルを説明し、サンプル調製、画像取得、データ解析など、生細胞のミトコンドリアの形態学的特性を決定するための重要な詳細を強調します。この方法は、さまざまな条件を研究するためにミトコンドリアの形態を調べるために一般的に使用されます。

要約

ミトコンドリアの融合と分裂の動的バランスは、ミトコンドリアの恒常性に直接寄与し、アデノシン三リン酸(ATP)の恒常性に加えて、多くの細胞機能に影響を与えます。したがって、ストレス条件下でのミトコンドリアの形態評価は、機構研究に不可欠です。この研究では、MitoTracker溶液の調製、ミトコンドリアの染色、イメージングパラメータの最適化、形態学的特徴の検出など、ミトコンドリアの形態を解析するための詳細なプロトコルについて説明しています。MitoTrackersは、一般的に使用されている費用対効果の高いミトコンドリア特異的色素です。しかし、不適切な取り扱いによりミトコンドリアの形態に何らかの変化が生じることがあり、これは認識できず、ミトコンドリアの真の状態を反映していない可能性があります。そのため、MitoTrackersを用いてミトコンドリアの形態変化を解析する方法を理解する必要があります。このプロトコルは、ミトコンドリアの形態学的解析のプロトコルを説明するために、1-メチル-4-フェニルピリジニウムヨウ化物(MPP⁺)で刺激されたSH-SY5Y細胞を利用しました。対照細胞と比較して、MPP⁺刺激細胞はミトコンドリアがより小さく、より断片化されており、形態学的パラメータはミトコンドリアフットプリントの減少を示していました。これらの結果から、MitoTracker染色は、ミトコンドリアの形態学的解析に効果的かつ実現可能な方法であり、(わずかな変更を加えれば)さまざまな条件の研究に適用できることが示唆されています。

概要

ミトコンドリアの形態は、ミトコンドリアの融合と分裂のダイナミックなバランスによって維持されているため、エネルギーの恒常性やその他多くの細胞機能に影響を及ぼし、神経変性疾患、癌、炎症などのさまざまな病状を引き起こします1,2,3,4,5 .ミトコンドリアの形態を観察するために、プローブと抗体の両方を含むいくつかのミトコンドリア選択染色剤が共焦点顕微鏡で使用するために開発されました。テトラメチルロサミンやローダミン123のような一部のミトコンドリア特異的プローブは、ミトコンドリア膜電位(MMP)に基づいて機能するため、MMPを破壊する条件の研究における適用性は限られている^6,7。逆に、抗体染色は、固定細胞内のミトコンドリアの形態を調べるためのMMPに依存しない形態学的評価を提供します。適切な染色剤があれば、固定細胞のミトコンドリア形態を評価することができますが、一部の誘導因子によって障害された生細胞のミトコンドリア形態を調べることは依然として困難です。細胞透過性のカチオン性およびミトコンドリア特異的蛍光プローブであるMitoTrackerは、この課題に対する解決策を提供し、生細胞と固定細胞の両方の染色を可能にします。このプローブは、さまざまな疾患の研究でミトコンドリアの形態を調べるために広く利用されています^8,9,10,11。それにもかかわらず、一部の研究では、プローブがメーカーが提供するガイドラインに厳密に従って使用されている場合でも、高いバックグラウンドシグナルや非特異的結合などの問題が報告されています。これらの観察結果は、ミトコンドリアの形態を成功裏に解析するためには、サンプル調製と画像取得を完全に理解することの重要性を浮き彫りにしています。

ミトコンドリアの形態の解析を容易にするために、種々の画像処理プログラムおよびアルゴリズムが開発されてきた12,13,14,15,16。本研究では、ImageJのマクロツールであるMitochondrial Network Analysis(MiNA)を用いて、ミトコンドリアの形態を解析した¹³。このツールは、個体数(分岐のない構造)、ネットワーク数(少なくとも1つのジャンクションピクセルを持つオブジェクトの数)、平均長(すべてのロッドとブランチの平均長さ)、中央値(すべてのロッドとブランチの中央値)、長さ標準偏差(個々の長さの標準偏差)、 平均ネットワークサイズ(ネットワークあたりの平均ブランチ数)、ネットワークサイズの中央値(ネットワークあたりのブランチ数の中央値)、ネットワークサイズ標準偏差(ネットワークあたりのブランチ数の標準偏差)、およびミトコンドリアフットプリント(バックグラウンド分離後の合計信号面積)。このプロトコルでは、ミトコンドリアフットプリントを代表的なパラメータとして選択しました。

この研究の目的は、主要な詳細に焦点を当てたミトコンドリアの形態学的分析のための段階的なプロトコルを提供することです。MPP⁺誘導SH-SY5Y細胞を使用して、このプロトコルを実証しました。MPP⁺は、ドーパミン作動性ニューロンのミトコンドリア呼吸鎖の複合体Iを阻害し、ミトコンドリアの形態と機能に損傷を与えます^8,17。この研究で説明されている形態素解析プロトコルは、高解像度の画像の取得と、ミトコンドリアネットワークの形態学的特徴を定義するための関連パラメータの評価を可能にします。

プロトコル

1. 事前準備

1. MPP⁺ をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して1 mMのストック溶液を作り、暗所で-30°Cで保存します( 材料の表を参照)。
2. 50 μgのMitoTracker(MitoTracker Red CMXRos)を94 μLのDMSOに溶解して、1 mMのストック溶液を調製します。ストック溶液を数本の微量遠心チューブに分注し、さらに使用するまで-30°Cで光から保護して保管します。
3. SH-SY5Y細胞を、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコのModified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12培地とフラスコで、5%_CO2 と95%の空気、37°Cの加湿環境でインキュベートします。 継代のために、0.05%トリプシン溶液で細胞を1分間剥離し、100 × g で3分間遠心分離します。

^{2. MPP+}刺激

1. SH-SY5Y細胞をガラス底の共焦点ディッシュに播種し、1%(v/v)FBSを添加したDMEM/F12培地で一晩維持します。
2. 培地を交換し、MPP⁺ の有無にかかわらず細胞を24時間インキュベートします。

3. MitoTracker染色

1. DMEM/F12を予温し、次にMitoTrackerストック溶液をDMEM/F12で希釈して、50 nMの作業溶液を得ます。手順全体を通して、溶液を光から保護してください。
2. 細胞培養培地を取り出し、共焦点ディッシュを新鮮なDMEM/F12で2回洗浄します。
3. 各ディッシュの細胞を1 mLのMitoTrackerワーキングソリューションと15分間、暗所で37°Cでインキュベートします。
4. MitoTrackerの作業溶液を取り出し、DMEM / F12で2回洗浄します。
5. 各ディッシュに1 mLのDMEM/F12を加え、イメージングする前に細胞インキュベーターでインキュベートします。

4. 共焦点顕微鏡のイメージングパラメータ

1. その後の操作のために顕微鏡を事前に平衡化します。 アクイジションパネルの下で、励起波長と発光波長を設定して、光路関連のパラメータを調整します。
2. パラメータを次のように設定します: ピンホールサイズ、1.2 AU、ピクセルスキャンサイズ、1,024 x 1,024、ピクセル滞留時間、2.4 μs(平均2倍) (キャリブレーションのために一貫性を保つ)。

5. イメージングパラメータの最適化

注意: 可視レーザーおよび/または不可視レーザーからの直接放射線と散乱放射線の両方に目をさらさないでください。

1. ハロゲンライトを使用して、プランアポクロマート60倍対物レンズ(1.4 NA)を使用して細胞に焦点を合わせ、光毒性を回避します。
2. レーザー出力と高電圧(HV)を飽和レベルのすぐ下に調整し、ズーム倍率を3に設定してから、画像をキャプチャします。
3. 関心領域を移動し、セルに焦点を合わせると、設定を変更せずに画像をキャプチャします。

6. データ分析

注:データは、MiNAプラグイン¹³にプリインストールされているImageJを使用して分析されました。正確で関連性のある測定値を得るためには、画像は独立して分離されたミトコンドリアを透明で明るい染色で捉える必要があります。

1. バイナリ変換やスケルトン化の前に画質を向上させるには、画像を開いて予備処理を行います。ROI ツールを使用して、1 つのセルの領域を選択します。プロセスの適用 |フィルター |シャープネスを高めるアンシャープマスク機能、プロセス|コントラスト機能を強化して、ノイズの過剰増幅を減らします。特に塩とコショウのノイズを除去するには、Process |フィルター |中央値関数(補足図S1を参照)。
2. 記述パラメーターを計算するための簡略化された形態素モデルを構築するには、しきい値処理を使用して画像をバイナリに変換します ( [プロセス] |バイナリ |Make Binary)、 次にSkeletonize関数 を使用してバイナリ画像をスケルトン化します( Process |バイナリ |スケルトン化) ( 補足図 S2 を参照)。
3. スケルトン内のすべてのピクセルをグループ化するには、[ 解析] |スケルトン |スケルトンの解析(2D/3D)機能。MiNAツールを使用して、スケルトン化された画像内の9つの記述パラメータを計算することで、分析を簡素化します( 補足図S3を参照)。

結果

このプロトコルでは、試料調製プロトコルの標準化、共焦点顕微鏡イメージングの光学パラメータの体系的な最適化、および計算画像処理ガイドラインという3つの相互依存最適化モジュールを通じて、ミトコンドリアの形態学的解析の詳細なステップバイステップの手順を概説しています。最適なサンプル調製プロトコルは、信頼性の高いミトコンドリアイメージングデータを得るために重要です。MitoTracker Red CMXRos濃度の系統的評価により、濃度依存性の蛍光特性が示されました。25 nM処理では、高濃度の場合に比べて蛍光シグナルが有意に弱くなりました(図1A)。特に、50 nMと100 nMの処理間で標識効率に大きな差は見られませんでしたが、200 nMの条件では、より低いレーザー照射閾値を必要とする光感受性の増加と、細胞質バックグラウンドの大幅な染色という2つの重大な制限が示されました。

さらに、PBSと培地がバックグラウンド蛍光シグナルに与える影響を評価しました。その結果、厳密なPBS洗浄とPBS充填イメージングの組み合わせにより、培地...

ディスカッション

本研究は、ストレス条件下での生細胞のミトコンドリア形態を系統的に解析するための方法論を確立する。ミトコンドリアイメージングにおける重要な手順には、適切な濃度のMitoTrackerプローブ、画像取得前の共焦点皿の徹底的な洗浄、細胞状態への障害の最小化、および適切なイメージングパラメータの設定が含まれます。

高濃度のMitoTrackerを使用すると、細胞毒性が誘発され、ミトコンドリアがレーザーパワーに敏感になり、色素が他の細胞構造を染色する可能性があります(図1A)。これらの結果に基づいて、50 nMが最適な濃度であり、強いシグナル強度と最小限の光毒性影響のバランスが取れていると判断されました。同様に、MitoTrackersの実験濃度とインキュベーション時間は、他の細胞タイプについても決定する必要があります。一般に、MitoTrackersの使用濃度は25 nMから200 nMの範囲であ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-メチル-4-フェニルピリジニウムヨウ化物(MPP+)	マックリン	M875357	酸化ストレスを誘発するために使用されます
共焦点皿	巣	801001	細胞の培養に使用
共焦点顕微鏡	ニコン	C2	画像のキャプチャに使用
ダルベッコの改良イーグル培地/栄養混合物 F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033	細胞に栄養を与えるために使用されます
ジメチルスルホキシド(DMSO)	ビヨタイム	ST038	マイトトラッカープローブの溶解に使用
ウシ胎児血清(FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A3161001C	細胞に栄養を与えるために使用されます
イメージJ	国立衛生研究所	イメージJ	ミトコンドリア形態の解析に使用
MitoTracker レッド CMXRos	サーモフィッシャーサイエンティフィック	M7512	ミトコンドリアの視覚化に使用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C10010500BT	共焦点皿の細胞を洗浄するために使用されます
SH-SY5Yセル	ATCCの	CRL-2266	ミトコンドリア形態解析のワークフローを実証するために使用
TI-SH-Uステージアダプタ	ニコン	MEC59110	試験片の固定に使用