シリコンナノメンブレン分析パイプラインを用いた飲料水中のマイクロプラスチックのマルチモーダル分析

Summary

ここでは、飲料水中の汚染粒子の効率的な捕捉と分析のための光学的に透明で平坦な基板を示すプロトコルを紹介します。ここで紹介するのは、液体媒体中の粒子の捕捉、定量化、同定のための柔軟なパイプラインであるシリコンナノ膜分析パイプライン(SNAP)です。

Abstract

マイクロプラスチック汚染が人間の食物や水源に及ぼす生物学的影響はほとんど知られておらず、飲料水源もこのマイクロプラスチック汚染を免れることはできません。ここでは、飲料水中のマイクロプラスチックを捕捉、定量化、同定するための合理的なアプローチを示します。ここでは、新しい窒化ケイ素ナノメンブレンを利用して、懸濁粒子を平坦な観察領域に集約し、同じ基板上の個別化、定量化、およびマルチモーダルな粒子分析を可能にする新しい「濃縮係数」を活用した分析ワークフローを紹介します。SNAPの主な利点は、従来のサイズのフィルターディスクに収納された超薄型の窒化ケイ素ベースのメンブレンを使用していることに由来し、非ポリマーバックグラウンド上のポリマーMPを直接捕捉して分析することができます。ニューヨーク州ロチェスター地域で供給された飲料水サンプルは、住宅の水道水源から収集され、SNAPを使用して分析されました。各試料中の粒子は、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡(SEM)、ラマン分光法、およびエネルギー分散型X線分光法(EDX)によって特徴付けられ、同定されたさまざまな成分が捕捉された粒子全体に比例して定量されました。

Introduction

マイクロプラスチックは、サイズ^が5ミリメートル未満の合成ポリマーと定義されます^1,2。マイクロプラスチック(MP)汚染は、人間の健康、環境、生態学的な懸念事項として深刻化しています。MP汚染は、すべてのタイプの水源で発見されています。淡水、海、さらには飲料水源³.MPは、一次プラスチック源⁴と合成繊維^5,6,7の内訳から生成されます。MPは遍在しており、ヒト胎盤、糞便、血液などのヒト組織に発見されています^8,9,10。2023年と2024年にそれぞれ4,100件と4,600件以上の出版物(PubMedデータ、キーワード「マイクロプラスチック」)からも明らかなように、MP研究への関心が高まっているほか、MPへのヒト曝露に対する国民の関心が高まっている。また、国民の関心の高まりに対応して、カリフォルニア州¹¹やEU諸国など、いくつかの政府規制機関¹²は、飲料水中のMPレベルに関する規制を実施してきました(または実施する予定です)。上記のすべてを考慮して、米国環境保護庁は最近、MPを新たな懸念汚染物質として発表しました。しかし、ヒトのリスク評価は、MPを信頼性と再現性のある方法で検出する方法がないため、著しく妨げられています。

MPsの特性評価は、光学顕微鏡および電子顕微鏡¹³、および分光法および分光法^1,14,15などの分析方法に依存して、^MPs7およびそれらの組成の視覚的特性をそれぞれ理解する。MPを含むサンプルには、MPの特性評価、同定、定量化のための複数の分析を含める必要があり、少なくとも、Science of the Total Environment¹⁶などの環境サンプル中のプラスチックの測定に関する一部のジャーナルの最小要件に従って、分光法/分光法(ラマン分光法、赤外分光法、熱分解ガスクロマトグラフィー-質量分析法など)が必要です.ラマン分光法は、特に生体試料中の物質同定に関して、赤外(IR)分光法よりも汎用性があります。ラマン分光法は光散乱法であり、より大きな粒子を必要とし、サンプルの配置により多くの制約がある光吸収技術であるIRよりも小さな粒子をより簡単に分析することができます¹⁷。シリコンまたは酸化ケイ素を含むラマン分光法の基板は、最小限のバックグラウンドノイズで信頼性の高い結果をもたらすことが以前に示唆されてきた¹⁸。

通常、1つのタイプの分析に適合している特定の分析手法用の基板(つまり、IR分光法に必要な金コーティング基板)は、透過型および/または反射光顕微鏡に適合しないことがよくあります。その後、研究者の間では、各分析に適したサンプルを作成するために、反復サブサンプリングが一般的ですが、サブサンプリングには時間がかかり、少量の微粒子^1,2,6を除外する可能性があります。通常、1つの基質から次の基質への微粒子の手動移動は、異なる分析モダリティによる特性評価と同定のために同じ粒子を分析するために必要ですが、これらのゆっくりとした手動移動は、バイアス、汚染、および損失の可能性を高めるだけでなく、MPの分析を手動で操作できる最大サイズの粒子のみに制限します¹³.これらの最適でないワークフローは、多くの課題と信頼性の問題を引き起こし、文献^3,7で報告されているMP定量の大きなばらつきの一因となっています。

ここでは、シリコンナノメンブレン分析パイプライン(SNAP)と呼ばれる分析ワークフローを紹介し、MPを捕捉、特性評価、同定、定量し、ニューヨーク州ロチェスター地域から供給された飲料水サンプルを分析することでSNAPの有用性を実証します。SNAPは、シリコンナノメンブレン(膜特性については補足表S1を参照)を統合した従来のサイズの直径25mmのフィルターディスクによって可能になり、複数の技術を使用して飲料水からのMPを濃縮および分析するための均一な基質を提供します^15,19。カットオフサイズを縮小したナノメンブレン(円筒形細孔を持つ20 μm微孔性窒化ケイ素(MPSN)と直角プリズム孔を持つ8.0 μm微小窒化ケイ素(MSSN))にMPを順次濃縮して捕捉した後、SNAPは、1)サンプル染色、光学顕微鏡、MP定量、2)ラマン分光法による粒子同定、3)走査型電子顕微鏡(SEM)による粒子特性評価の3つの連続した分析ステップを促進します。 1つのナノメンブレン基板上に捕捉された同じ粒子の複数の分析が可能になります。

コーティングされていないシリコンナノメンブレン(SiN)フィルターディスクと金コーティングシリコンナノメンブレン(Au-SiN)フィルターディスクの両方を利用して、複数のSNAPパイプラインを実証します:パイプラインA)SiNでSNAPを実行し、複数の分析技術を通じて同じMPを順次特性評価します。パイプラインB)ラマン分光法を用いてAu-SiNでSNAPを実行。パイプラインC)は、エネルギー分散型X線分光法(EDX)を備えたSEMを使用してAu-SiNでSNAPを実行しました(図1)。したがって、SNAPのバリエーションは、柔軟で合理化された分析ワークフローであり、多くのサンプルタイプや分析手法に使用できます。高分子膜に依存する以前に発表された方法¹¹とは異なり、SNAPの利点は、合成高分子MPが非高分子のシリコンベースの膜に捕捉され、非高分子バックグラウンド上のMPの組成同定を可能にするシリコンナノ膜の使用に由来します。さらに、シリコンナノメンブレンは、しわになりやすい高分子膜とは異なり、均一な焦点面を提供するため、複数の自動顕微鏡および分光法技術が可能になります。

我々は以前に、分析モデリング、モデル粒子の課題、および飲料水および空気サンプル^19,20、^ならびにモデル粒子を用いたそれらのろ過および光学顕微鏡特性を広く使用されている4つの膜¹⁵と比較することにより、MP分析のためのシリコンナノメンブレンの使用を特徴付けた。このプロトコルでは、4つの飲料水サンプル中のMPの分析に対するSNAPの有用性をヒューリスティックに実証します。サンプルは、ニューヨーク州ロチェスター周辺の4つの異なる水源から収集されました。この研究に含まれる各サンプルは、オンタリオ湖、ヘムロック湖、ヘムロックとオンタリオの混合、カナンデーグア湖などの異なる地表水源に由来しています(図2)。これらの飲料水源から捕捉された粒子には、ポリスチレン(PS)やポリエチレン(PE)などの広範なプラスチック、鉄、シリカなどの重金属、非合成粒子が含まれていました。

Protocol

1. 品質管理手順と超高純度 溶液調製

1. 層流フードとグローブのクリーニング
   1. ドンPPE(個人用保護具):綿100%の白衣とニトリル手袋。
      注:PPEはプロトコル全体を通して連続しています。
   2. ニトリル手袋に99%イソプロピルアルコール(IPA)をスプレーします。手をこすり合わせ、~18MΩ、0.22μmのろ過水ですすいでください。これを3回行って、手袋から離型剤を取り除きます。
   3. 天然繊維のデリケートなタスクワイプを四分の一に折りたたんでから、70%のIPAをスプレーします。フードの表面を後ろから前に長いストロークで拭き、デリケートなタスクワイプを2ストロークごとに未使用の表面に折り直します。すべての表面が清掃されるまでフードの清掃を続行し、汚れたらワイプを新しいものと交換します。
   4. シリコンローラーマットのカバーを外し、フードの表面を転がして、残っている粒子を拾います。シリコンローラーをクリーニングするには、99% IPAをスプレーし、手袋をはめた手でこすり洗いした後、18MΩの0.22μmろ過水ですすいでください。3回繰り返してから、フード内で風乾させます。
   5. 手順1.1.2のように手袋を再度すすいでください。
2. 超純水とIPA生成。
   1. 1Lのビーカーに18MΩの水を入れ、フードに入れます。
   2. 60 mLシリンジと付属の0.22 μmカットオフシリンジフィルターをプライミングし、シリンジと付属のフィルターで少なくとも200 mLの18 MΩ水をろ過します。
      注:シリンジポンプは時間を節約しますが、説明されているプロトコルを実行するための要件ではありません。
   3. ガラス製スクリューキャップ容器を18MΩ、0.22μmのろ過水で3回すすいでください。0.22 μmシリンジでろ過した18MΩのろ過水で満たします。
   4. 18MΩ、0.22μmでろ過された水の代わりに、IPAの所望の%濃度で手順1.2.1-1.2.3を繰り返して、超高純度IPAを生成します。

2. ろ過による液体サンプルからの粒子捕捉

注:以下のプロトコルは、水以外の液体サンプルで使用できます。検証されたサンプル収集方法は、研究者の研究とサンプルのニーズに基づいて、研究者の裁量に委ねられるべきです。

1. ドンPPE。
   注意: 手袋とフードの表面が手順1.1.2〜1.1.5に従って清掃されていることを確認してください。
2. シリコンガスケットにUltrapure 99% IPAをスプレーし、手袋をはめた指でこすり洗いした後、Ultrapure水ですすいでください。ガスケットごとにこれを3回繰り返します。
   注意: ろ過に使用するガスケットの数は、使用するフィルターディスクの数に1を加えた数に等しくなります。視覚的な組み立て図については、 図1B を参照してください。
3. ステップ1.1.2でプライミングしたシリンジを使用して、30 mLの超純水と30 mLの空気をシリンジに取り込むことにより、60 mLシリンジの内部を超純水ですすいでください。シリンジフィルターをねじ込み、激しく振って分注します。これを3回繰り返します。
   注:サンプルの容量に基づいて、必要に応じて任意のサイズのシリンジを使用できます。
4. 図1Bの視覚的な組み立て図に示すように、ろ過装置を組み立てます。
   注意: 組み立ておよび分解中にフィルターディスクとガスケットを取り扱うには、清潔なピンセットを使用してください。
   1. シーケンシャルろ過の場合は、ディスクとサポートフリットの間にガスケットがあり、各ディスク間にガスケットがあり、ディスクとろ過漏斗の間にガスケットがあることを確認してください。
   2. ディスクが、スタックの一番上に最大のカットオフフィルターがあり、下部に最小のカットオフフィルターがあるように注文されていることを確認します。
5. フィルターディスクスタックに負の流れがあるように、装置への真空をオンにします。
6. バックグラウンド汚染の測定
   注:次のプロセスにより、シリンジのクリーニングとUltrapureメディアの生成の評価、およびシステムのコンポーネントによって寄与される背景粒子の決定が可能になります。
   1. すすいだシリンジで、50 mLの超純水を上部ディスクの中央にあるナノメンブレン上にゆっくりと分注し、分注されたすべての液体がろ過されるようにします。
      注:大量のサンプル(>50 mL)をろ過する場合は、ガラスろ過漏斗をお勧めします。手順2.3のようにガラスろ過漏斗を清掃します。実験器具を追加すると、追加の粒子汚染リスクが発生する可能性があります。洗浄手順を慎重に行い、目的のサンプルを使用する前に、常にブランクろ過で清浄度を確認してください。
   2. 超純水をろ過します。ろ過後、さらに1分間真空状態に保ちます。サンプルが完全に乾いたら、真空装置をオフにします。
   3. 清潔なピンセットを使用してフィルターディスクをガスケットから慎重に取り外し、ガラスのペトリ皿や黒ずんだ箱など、保管用に適切な清潔でラベル付きの容器にディスクを置きます。
   4. 光学分析、粒子計数などのために、顕微鏡でフィルターディスクを画像化します。
7. 液体サンプルの場合は、ステップ2.2のように追加のガスケットを清掃します。固有の液体培地サンプルごとに新しいシリンジを入手し、ステップ2.3を繰り返します。
8. 必要な量のサンプルを取り込み、上部ディスクの中央にあるナノメンブレン上にサンプルをゆっくりと分注します。
9. サンプルのろ過が完了したら、1 mLの超純水で3回のすすぎを行い、サンプル中のすべての粒子がフィルターディスクの中央にあるメンブレンにすべての表面から十分にすすぎされていることを確認します。
10. さらに1分間真空装置をONにして、3回すすぎたサンプルを完全に乾燥させた後、真空装置をオフにしてください。
    1. 手順2.7〜2.10を繰り返します。対象のサンプルに対して実行される各反復について。

3. 蛍光色素の調製と染色

注:ナイルレッドおよび/またはトリパンブルーによる蛍光染色は、目的のラマン分光レーザーに干渉する可能性があります。

1. ナイルレッド(NR)による染色
   1. ドンPPE。
   2. 手順1.1.2-1.1.5のように手袋とフードを清掃します。
   3. ステップ2.7-2.10で概説されているように、サンプルのろ過を完了します。
   4. 2つのガラス製スクリューキャップ容器を超純水3倍ですすいでください。
   5. 清潔なガラス容器に超高純度99%IPA中のNRの0.1 mg/mL溶液を調製します。
   6. 10倍を静かに反転させて混ぜます。
   7. NR溶液を0.22 μmシリンジフィルターで2つ目のガラス製スクリューキャップ容器にろ過します。
      注:NRのプレフィルタリングに使用されるフィルターは、サンプルのフィルタリングに使用されるフィルターよりもカットオフが小さくなければなりません。
   8. 染色するフィルターディスクを真空収集フラスコのサポートフリットに置きます。
   9. 0.1 mg/mL NR溶液20 μLをフィルターディスク中央のナノメンブレンにピペットで移します。
      注:汚れはナノメンブレンの多孔質表面を完全に覆う必要があります。20 μLでは不十分な場合は、ナノメンブレンのすべての多孔質領域が汚れで適切に覆われるまで、追加の染色剤を追加します。
   10. 染色物を5分間インキュベートします。
   11. インキュベーションが完了したら、汚れを真空ろ過します。
   12. Ultrapure 99% IPA 1 mL で 3 回すすぎ、余分な NR 汚れを取り除きます。
       注:対比染色を行う場合は、このステップの後、以下のトリパンブルー染色セクションに進んでください。
   13. フィルターディスクをバキュームをオンにした状態でサポートフリットに2分間置いて、残留液体をろ過して乾燥させます。2分経っても乾かない場合は、きれいなガラスのペトリ皿を使用してフィルターディスクを70°Cオーブンに2〜5分間移します。
   14. 乾燥したら、ステップ2.6.4で説明したように蛍光顕微鏡法を行い、セクション4に進みます。
2. トリパンブルー(TB)による染色
   1. ドンPPE。
   2. 手順1.1.2-1.1.5で概説されているように、手袋とフードを清掃します。
   3. ステップ2.7〜2.10からサンプルろ過を完了するか、ステップ3.2.4から開始します。
   4. 2つのガラス製スクリューキャップ容器を超純水3倍ですすいでください。
   5. 1つの容器に0.4%TBの染色液を調製します。
      注:TBの事前ろ過に使用するフィルターは、サンプルのろ過に使用するフィルターよりもカットオフが小さくする必要があります。
   6. 10倍を静かに反転させて混ぜます。
   7. TB染色液を0.22 μmシリンジフィルターで2つ目のガラス製スクリューキャップ容器にろ過します。
      注:TBの事前ろ過に使用するフィルターは、サンプルのろ過に使用するフィルターよりもカットオフが小さくする必要があります。
   8. 染色するフィルターディスクを真空収集フラスコのサポートフリットに置きます。
   9. 0.4% TB染色液20μLをフィルターディスク中央のナノメンブレンにピペットで移します。
      注:汚れはナノメンブレンの多孔質表面を完全に覆う必要があります。20 μLでは不十分な場合は、ナノメンブレンのすべての多孔質領域が染色で適切に覆われるまで、滴下するように追加の染色剤を追加します。
   10. 染色物を5分間インキュベートします。
   11. 5分間インキュベートした後、汚れを真空ろ過します。
   12. 1mLの超純水で3回すすいでください。
   13. フィルターディスクをバキュームをオンにした状態でサポートフリットに2分間置いて、残留液体をろ過して乾燥させます。2分経っても乾かない場合は、きれいなガラスのペトリ皿を使用してフィルターディスクを70°Cオーブンに2〜5分間移します。
   14. 乾燥したら、ステップ2.6.4で説明したように蛍光顕微鏡法を行い、セクション4に進みます。

4. 蛍光顕微鏡による粒子定量

1. 光学顕微鏡画像キャプチャ
   1. シリコンガスケットを使用して顕微鏡スライド上にフィルターディスクを固定するか、顕微鏡ステージでフィルターディスクの使用に特化したアライメントスライドを使用します。撮像するフィルターディスクを顕微鏡ステージに移動します。
   2. 明視野照明を使用してナノメンブレンを画像化し、最大検出カウントが検出器カメラの最大範囲の~90%になるようにします。
      注: この 90% の値は、ホワイト レベルが 65,535 の 16 ビット検出器では ~59,000 です。
   3. 蛍光照明を使用してナノメンブレンを画像化し、 最大ピクセル強度 が 検出器カメラの最大範囲の約~25%になるようにします。
   4. 画像を 16 ビットの複合 TIFF 形式で保存します。
2. 蛍光顕微鏡による粒子定量
   1. 画像解析プラットフォームを使用して、4.1.4で生成された複合TIFFの蛍光チャンネルを、 Split-Channels 機能を使用して明視野チャンネルから分離します。
   2. Threshold 関数を使用してピクセル強度を 10,000 の値にしきい値を設定します。
      注:パーティクルにブルームが存在する場合は、しきい値が低すぎるため、引き上げる必要があります。
   3. 別の画像をPNG形式で保存します。
   4. イメージのノイズ除去は、 ノイズ ピクセルを除去するために Despeckle 関数を使用して行います。
   5. Watershed 関数を使用して画像を流域化します。
      注:この機能は、大きな連続した粒子をより小さな断片に分割するという犠牲を払って、同様のサイズの隣接する粒子を分離します。多くの場合、大きな粒子よりも多くの小さな粒子が存在するため、これは適切なトレードオフになる可能性がありますが、長い繊維が小さな粒子のストランドに分裂するなど、意図しない影響を与える可能性があります。データを受け入れる前に、画像の結果を調べます。
   6. 明視野画像の細孔の幅を測定することにより、閾値化された蛍光画像のスケールを設定します。測定された細孔幅を使用して、スケールをピクセル/μmで設定します。
      注:長方形の細孔の場合、最小の幅が製品ラベルと一致します。円形の細孔の場合、直径はナノメンブレンの細孔サイズ(つまり、カットオフ)を指定する製品ラベルと一致します。
   7. 画像解析プラットフォームのCount Particles関数を閾値化された蛍光画像に適用し、Area、min、maxを評価します。
   8. 蛍光画像と明視野画像を処理して、蛍光ドメインを視覚化する複合材料を作成します。
   9. 手順 4.2.2 と同じ値を使用して蛍光画像のしきい値を設定します。
   10. 画像解析プラットフォームを使用してチャネルをマージします。蛍光チャンネルを赤チャンネルに、明視野画像をグレイチャンネルに割り当てます。
   11. コンポジットをPNGファイルとして保存します。

5. ラマン分光法

1. ラマン装置とそれに関連するコンピューターの電源を入れ、それぞれを起動できるようにします。
2. ラマン装置に接続されているコンピューターでソフトウェアを開きます。
3. ソフトウェアが初期化されたら、プログラム画面の下部のリボンにある [現在のシステム アクティビティ] と [ディテクタ] のステータスが [準備完了] と表示され、色がそれぞれ緑色であることを確認します。
4. 画面下部の [自動キャリブレーション](AC) ボタンが 赤の場合は、目的の 自動キャリブレーション を実行し、終了するまで待ってから続行します。
5. 1つのレーザーと1つのグレーティングのみを使用する場合:
   1. 自動キャリブレーション画面で[終了]をクリックし、[取得]タブの[機器設定]の下にあるそれぞれのドロップダウンリストから目的のレーザーとグレーティングを選択します。
   2. 画面下部の 赤いAC ボタンに戻り、[ 現在のレーザー/グレーティング ]をクリックして、キャリブレーションルーチンの実行を許可します。
6. すべてのレーザーとグレーティングを使用する場合は、 すべてのレーザーとグレーティング を選択し、システムの実行を許可します。
7. 複数のレーザーおよび/または格子を使用する場合は、 カスタムレーザー/格子 を選択し、必要なすべての設定を選択します。次に、キャリブレーションの実行を許可します。
8. 計器タレットで20倍長作動距離(LWD)対物レンズを選択し、ソフトウェア内で[Acquisition]タブの[Instrument Settings]で選択します。
9. この対物レンズが利用できない場合は、フィルターディスクの高さに対応する作動距離を持つ別の低倍率対物レンズ(5倍や10倍など)を使用してください。
   注:フィルターディスクのナノメンブレンを横切る初期ナビゲーションを容易にするために、低倍率の対物レンズから始めます。
10. フィルターディスクを顕微鏡ステージに置き、光路内に収まるようにします。
11. 上部のリボンの [ビデオ取り込み ] をクリックして、視覚化光学系をオンにします。
12. 装置の粗いフォーカスホイールと細かいフォーカスホイールを利用して、フィルターディスクのナノメンブレンに焦点を合わせます。
13. コンピュータ画面上のポイントカーソルラインで毛穴をほぼ正方形にします。
14. ステージ上でフィルターディスクをゆっくりと回転させてこの正方形のアライメントを実現するか、顕微鏡ステージでのフィルターディスクの使用に特化したアライメントスライドを使用します。
15. 右上の [Acquisition ]タブで、選択した イルミネーターモード が [Dark field ]になっていることを確認します。
16. ステッチされた画像を取得するには、[データ タブ] リボンの [ビデオ] タブに移動します。
17. 最初に目的の視野に移動し、ビデオ ウィンドウの右上にある [モザイク ] ボタンをクリックして、マップに追加します。機器のジョイスティックで目的のエリアの外側の反対側の隅に移動し、マップに追加します。
18. ViewSharpでモザイク撮影を実行し、最終画像ですべての領域に適切に焦点を合わせていることを確認します。
    注:倍率の低い対物レンズは画像モザイクの取得にかかる時間が短くなり、倍率の高い対物レンズは時間がかかります。
19. 画像モザイクが作成されたら、画像 を右クリックして [Send to ParticleFinder (ParticleFinder に送信)] をクリックします。
20. 右上のリボンの [ParticleFinder ]タブに移動して、しきい値設定を操作します。
21. 適切なパーティクルが選択されていることを確認するには、[ParticleFinder データ]タブの[イメージ]を左クリックして、[中心]、[パーティクル]、および[透過性]チェックボックスをオンにします。透明度スライダーを 50% に設定し、[中央] のピクセル サイズを 2px に設定します。
    注: [Center ]選択では、各パーティクルの中心にドットが配置され、[ Particle ]選択では、パーティクルと判断された各領域に50%の透明度でオーバーレイが配置されます。これらの設定により、各パーティクルが配置され、各パーティクルのエッジが定義されます。
22. 必要に応じて、プログラムの右側にあるParticleFinderタブで粒子のしきい値処理と形態/サイズ選択パラメータを編集し、すべての粒子とそのサイズ/形状パラメータが適切に識別されるようにします。形態学的パラメータの適用方法の例については、補足表S2を参照してください。
    1. 自動パーティクル検出が十分でない場合は、手動に切り替えて、正しいオブジェクトの大部分がパーティクルとして識別されるまでしきい値を段階的に調整します。
    2. 検出された粒子の形態をさらに詳細化する必要がある場合は、[形態学的フィルターを適用] の横にあるチェックボックスをオンにします。適切なパラメータとその強度を、結果のドロップダウンメニューで選択します。
       注: パラメータが選択される順序は、出力に影響を与える可能性があります。
23. 粒子 のサイズ、形状、またはその他の形態学的性質 が重要な要素である場合は、[ Apply particles pre-filter]の横のボックスをオンにし、必要に応じてパラメータを選択して編集します。
24. パーティクルが特定され、選択した形状/エッジが許容できるようになったら、[ 結果 ]セクションの下にあるパーティクル画像のスクロール可能なプレビューリストをナビゲートします。 関連する粒子画像をクリックして、目的の粒子を選択します。
25. 画面上部のビデオカメラボタンでライブビューをオンにします。
26. 倍率番号をクリックし、リボン下部のアプリケーション内のドロップダウンメニューで対応する対物レンズを選択することで、50x LWD対物レンズに切り替えます。
27. 必要に応じて、微調整ノブで粒子の焦点を戻します。
28. 個々の粒子の画像をキャプチャしてラマン分光法で分析し、適切な名前で画像を別々のファイルとして保存します。
29. ラマン分光法で分析する粒子の目的の領域が、レーザービームの位置の下に正しく配置されていることを確認してください。
30. 粒子の適切な領域を解析用に選択したら、ウィンドウの上部にある[STOP ALL]ボタンを押して、可視化光学系をオフにします。
31. レーザーを532 nmに設定し、未染色粒子の場合は1%の出力で、蛍光染色粒子の場合は785 nmまたは830 nmに設定します。
32. 集録時間を 10 秒に、アキュムレーションを 5 に設定します。
33. データタブメニューから [Spectra ]タブを選択し、再生ボタンを押して リアルタイムディスプレイ(RTD)を起動します。
    注意: RTD中に取得した情報を利用して、設定を最適化します。
34. 設定と結果に満足したら、STOP ALLを押してRTDを停止します。
35. 最終的な取得は、RTDボタンの横にある丸のSpectrum Aquisitionボタンを押すことで収集できるようになりました。
36. 収集したスペクトルを適切な名前で個別のファイルとして保存します。
37. 手順5.28〜5.36を繰り返します。対象の各粒子について。
38. サンプルの使用が終了したら、フィルターディスクを取り外し、スコープ上およびソフトウェア内で手動で対物レンズを20X LWDに戻します。
39. 新しいサンプルについて、手順5.10-5.37を繰り返します。

6. スペクトルの識別

1. 購入済みまたは自作のラマンスペクトルデータベースが利用できない場合は、次のオープンソースの分光法ライブラリにアクセスしてください https://www.openanalysis.org/openspecy/
   注:OpenSpecyは、オープンソースのラマンおよびIR分光データベースであり、環境MPおよび繊維の同定に適用可能な276のポリマーおよび材料の3つの異なるライブラリからの636スペクトルが含まれています²¹。前処理されたスペクトルデータと後処理されたスペクトルデータは、このリソースで同様に使用できます。
2. ラマンスペクトルを個別の.csvファイルとして保存します。
   1. 列Aには、スペクトルの波数が続く波数としてラベル付けし、列Bには、Intensityに続いて波数ごとのピーク強度値を付ける必要があります。
3. スペクトルを開くには、 .csvファイルを左上の 参照 バーにドラッグアンドドロップします。
4. 前処理と識別をオンにします。
5. [Preprocessing] で、[Threshold Signal Noise]、[Min-Max Normalize]、[Smoothing/Derivative]、[Conform Wavenumbers]、および [Baseline Correction] をオンにします。
   注:その中の特定の設定は、分析されるスペクトルの個々の特性に応じて調整できます。
6. [Identification] で、スペクトル タイプとして [Raman] を選択し、[Library Transformation] として [Derivative] を選択します。
   注:このライブラリは、IR分光法にも使用できます。分析ウィンドウには、分析用にアップロードされたスペクトルである白いスペクトルと、識別一致の疑いがある赤いスペクトルが表示されます。
7. 0.70 >一致を返さないスペクトル、または妥当なピーク形状の相関を返さない場合は、上位 5 つの推奨結果を、必要に応じて潜在的な一致の調査を開始する場所として活用してください。
8. 測定されたピーク値が、選択した参照スペクトルの対応するピークから±10波数以内にあることを確認してから、そのピークとの一致を確認します。
9. スペクトル相関、それらの相関値、および疑わしい一致の発生元データベースを記録します。
10. 個々のニーズに応じてファイルをダウンロードします。

7. 走査型電子顕微鏡

注:SEM分析の前にフィルターディスクを金属コーティングしていない場合は、セクション7.2にスキップしてください。

1. SEM用試料の金属コーティング
   1. カーボンテープを使用して、フィルターディスクをスチールSEMスタブに取り付けます。
   2. スパッタラーに挿入し、チャンバーを50mTorrまでポンプダウンします。
   3. スパッタリングAr(Argon)アイソレーションバルブを開きます。
   4. ニードルバルブを介してArをチャンバーに300 mTorrの圧力で導入してシステムをパージし、チャンバーを50 mTorrまで排気します。3回繰り返します。
   5. ニードルバルブで最終圧力を100mTorrに調整します。
   6. Auターゲットを使用して、スパッタリングを介してフィルターディスクにAuを堆積させます。
      注:他のターゲットソース(Pt、Ir、Siなど)をAuの代わりに使用できます。20mAの電流は、100mTorrで0.1オングストローム/秒の堆積を生成します。
   7. システムの通気孔を通気し、フィルタディスクを取り外します。フィルターディスクをステンレス鋼のスタブに接着しておきます。
2. SEM画像キャプチャ
   1. スタブをマルチステージZeiss Aurigaホルダーに止めネジで固定します。
   2. SEMとそれを実行するコンピューターの電源を入れ、それぞれが起動するのを待ちます。
   3. SEMに添付されているソフトウェアを開きます。
   4. システムが真空状態にあることを確認します(5e-6 Torr)。
   5. ロードロックチャンバーの本体にあるベントを押してロードロックをベントし、ロードロックを開きます。
   6. 多段ホルダーをテフロンコーティングされた挿入治具に取り付け、付属のネジプレートでトランスファーアームを固定します。
   7. ロードロックを閉じ、ロードロックチャンバー本体の Store を押してロードロックをポンプダウンします。
      注意: 完了は、ストア ボタンの緑色のライトの点滅が止まったときに発生します。
   8. トランスファーゲートを開いて、多段ホルダーをメイン観察室のステージにセットします。
   9. ロードロック本体の Transfer を押します。ゲートが落下し、内部チャンバーが露出します。
   10. ロードロックアーム(マルチステージホルダーにねじ込まれている)を挿入し、マルチステージホルダーをステージに固定します。
   11. ロードロックトランスファーアームを緩め、アームを完全に引っ込めてロードロック内に収まるようにします。
   12. Transferを押して、トランスファーゲートを閉じます。
   13. ソフトウェアの右下隅にある EHT を押して、アイソレーションバルブを開きます。
   14. ソフトウェアのデータゾーンで作動距離を5mmに調整し、加速電圧を20kVに調整します。
   15. XYジョイスティックとZジョイスティックを使用して、フィルターディスクメンブレムの位置を特定します。
   16. Zジョイスティックを使って、像にピントが合うまでステージを上げます。
   17. 乱視を矯正するには 、中央コンソールの XYスティグメーター ノブとフォーカスホイールを調整します。
   18. 中央コンソールの倍率ホイールを調整して、サンプル粒子を希望の倍率で画像化し、2,048 x 1,536 解像度の画像を 8 ビットまたは 16 ビットの tiff 形式でキャプチャします。
3. EDX粒子解析
   1. SEMコンピュータのデスクトップでChamberScope CCDの電源を切ります。
      注意: この手順が完了していない場合、EDX検出器は信号で圧倒され、データは記録されません。
   2. EDXコンピュータでAPEX EDXソフトウェアを開き、右上隅のメニューで検出器の電源を入れて、EDX検出器を冷却します。
   3. マッピングに使用できる低解像度の SEM 画像を取得するには、[Capture Image] をクリックします。
   4. ソフトウェア画面の上部にある [マッピング]タブ メニューを開きます。
   5. [設定] で、解像度 (256 x 256) とピクセル滞留時間 (0.16 μs)、フレーム番号 (32-64) を調整して、キャプチャの推定時間を ~5 分にします。
   6. メニューの左上隅にある[ マップの作成 ]をクリックします。
   7. 「Confirm Element Preview(元素プレビューを確認)」を選択して元素検索を手動で調整するか、ソフトウェアからの自動同定されたピークに頼ります。
   8. 完了時に、マッピングソフトウェアの右上にある AutoReport 機能を使用してレポートを生成します。

Results

プロセスブランクとバックグラウンド汚染
許容可能なブランク結果とは、粒子が含まれていないか、粒子が非常に少ないため、バックグラウンド(つまり、プロセス)汚染(存在する場合)が実験結果を混乱させたり混乱させたりする可能性が高くない結果です。最適でないブランクの結果は、対象の粒子がバックグラウンド汚染と区別するのが難しい多くの粒子を含む結果です。

プロセス汚染の許容レベルは、可能な限りゼロまたはゼロに近いレベルにする必要がありますが、ゼロを達成できない場合は、観察されるバックグラウンド粒子の数の一貫性が重要です。いくつかのブランクサンプルを分析して、結果の一貫性を判断します。品質管理プロトコル(セクション1を参照)、汚染の軽減、および処理中の適切な環境条件の注意は、バックグラウンド汚染レベルを低く維持するために最も重要です。バックグラウンドコンタミネーションの結果と許容性は、使用するナノメンブレンのカットオフ、および実験室条件の全体的な清浄度にも大きく依存する可能性があります。カットオフ膜が低い(例えば、< 8μm)小さな粒子を分析する場合、対象の粒子の相対的な存在量と同様のサイズのバックグラウンド汚染物質の両方が指数関数的に増加するため、品質管理により高いレベルの厳格さを適用する必要があることを考慮に入れてください²²。どのようなレベルの汚染も許容されませんが、条件が厳密に制御され、高度な一貫性が達成されている限り、環境マイクロプラスチックの良好な分析または関心のある分析は引き続き実施できます。

サンプルのろ過
忠実なマルチモーダル分析を生成するには、 図3のデータカスケードの例に示すように、理想的なサンプルろ過が必要です。このようなサンプルろ過により、ナノメンブレン表面全体に粒子が十分に分散します(たとえば、メンブレン表面積の約3分の1をカバーします)。粒子凝集(重なり合う粒子の大きな塊)の場合など、分散が不十分な粒子は、重なり合う粒子を確実に区別しにくいため、手動と自動の両方の粒子計数方法を混乱させます。このようなデータは通常、分析から除外されるため、関心のある貴重な情報が失われる可能性があります。 図4A、Bに示すように、十分に分散した粒子は、さまざまな組成の粒子が積み重なったり重なったりして、分光分析や定量分析が複雑になることがないようにします。これにより、正確な解釈、同定、定量化が困難な結果が得られる可能性があります。

ナイルレッドとトリパンブルーの染色
最適な蛍光粒子染色インスタンスの代表的な画像を、20 μmカットオフSiNフィルターディスク上の 図3B に示します。ナノメンブレン表面のNRまたは結核染色のすすぎ不足は、偽陽性の結果を引き起こす可能性があります。すすぎが不十分なためにメンブレンの表面に保持されたいずれかの汚れで構成される残留微粒子は、汚れた粒子と誤って解釈される可能性があります。リンスが不十分であることを示す兆候は、 図5Aに示すように、粒子やろ過されたサンプルから検出可能な残留膜/残留物がないナノメンブレンの領域が観察中に蛍光を発している場合です。イメージング後、フィルターディスクがクリーンな状態に保たれている限り、個々のナノメンブレンフィルターディスクを真空ろ過装置(ガスケットを除く)に戻し、真空をオンにし、別の容量の超高純度99%IPA(NR用)または超純水(TB用)をフィルターディスクのナノメンブレンにろ過することにより、再すすぎを行うことができます。使用した追加のすすぎメディアの総量を記録します。最良の結果を得るには、再リンスを行う前にナノメンブレン表面全体の顕微鏡画像を撮影し、再リンスステップによって発生する可能性のある汚染を考慮します。

ラマン分光法
コーティングされていないSiNに対して行われるラマン分光法は、レーザー波長に応じて顕著なピークを生成する可能性があり、このピークは、約520cm-1の波数領域²³内の低存在量の信号を覆い隠す可能性があります。対象のラマンスペクトルがシリコンまたは窒化ケイ素バックグラウンドピークから十分に分離されている場合、コーティングされていないSiNフィルターディスクを使用すると、適切なラマン分光結果が得られるはずです。このレポートでは、パイプラインBとCの両方がAu-SiNフィルターディスクを使用しました。Au-SiNの金コーティングは、固有のSiピークをマスクし、520 cm-1波数の近くまたは520 ^cm-1波数で低存在量のスペクトルをより確実に収集できるようにします。また、ラマンが利用できない場合、Au-SiNは赤外分光法と併用することができます。常に機器の最低出力設定(つまり、レーザー強度)から始めて、酸化した粒子など、対象の粒子の一部が壊れやすく、レーザーによって損傷または破壊される可能性があるため、徐々に増やします。

選択した粒子をラマン分光法で分析する場合、戻ってきたスペクトルの信頼性を判断することが重要です。一部の粒子は自家蛍光を発することがあり、この蛍光はスペクトル測定にノイズを追加し、粒子信号の解釈を覆い隠したり複雑にしたりする可能性があります。このノイズは、さまざまな波数にまたがる高強度のバンドの形をとり、基礎となるデータを統合します。図3Cと図4C,Dで示されている適切なスペクトルは、ベースライン補正前であっても、波数の短いスパンにわたって明確に定義されたピークを持つことになります。周囲の信号の3倍以上大きいピークが見られない場合は、収集されたスペクトルがバックグラウンドノイズであるか、問題の粒子を分析するために異なる装置設定が必要である可能性があります。各サンプルに適切なレーザー波長が選択されていることを確認します。532 nmレーザーなどの低波長レーザーでは、蛍光によって生成された信号を十分に処理できません。782 nmや830 nmのレーザーなどの高波長レーザーは、スペクトルを返すのに十分な蛍光を十分に無視できます。サンプルの種類に応じて、異なるレーザーがさまざまな粒子タイプに適しており、可能であれば、単一のフィルターディスクでのデータ収集中に交換することができます。

粒子の組成を決定するために、収集されたスペクトルは参照スペクトルデータベース内のスペクトルと比較されます。特定の粒子スペクトルを確実に同定すると、ピアソン係数(r)が70%(r > 0.70)を超える結果が得られます。最適でないラマンデータを 図5Bに示します(<0.70)。MPの同定結果は、MP汚染の潜在的な原因を特定するのに役立ちます。粒子同定結果を表示するために、 図3C および 図4Cのように、分析された粒子の画像とスペクトルを表示することができます。

走査型電子顕微鏡
SiNフィルターディスク、Au-SiNフィルターディスクともに、ろ過による粒子捕捉直後のSEMに適合します。SEM前および粒子捕捉後にSiNフィルターディスクがAuまたはPtでコーティングされていない場合、一部の粒子はSEMのイオン化ビームによってより容易に「チャージアップ」され、粒子が光ったり、画像内で非常に明るく見える可能性があります。この明るさ/光りは、粒子の形態をマスキングするなど、コントラストが悪いため、視覚化に問題を引き起こす可能性があります。緩和するには、SEMの前に光学/蛍光顕微鏡とラマン分光法を実施して、分析が困難な粒子や目的の小さな粒子を後でSEM/EDX分析のためにマークし、次にプロトコルセクション7で概説されているようにナノメンブレンをAuまたはPtでコーティングし、SEM/EDXを実行します。

粒子捕捉後、SEM分析の前にSiNまたはAu-SiNをAuまたはPtでコーティングすると、粒子が配設された金属層の下でイオン化されにくくなるため、イメージング中のこのチャージアップ効果を防ぐことができます。このコーティングにより、コントラストと解像度が向上するため、 図3D (繊維とフラグメント)に見られるように、特定の粒子の形態学的理解を深めたり、酸化した粒子のピットや亀裂などの表面形態を得ることができます。SEM分析の前に金属コーティング粒子をコーティングすると、分光法や蛍光イメージングでさらに分析するのを永久に防ぎ、SEM/EDX分析のみが可能になります。したがって、粒子をコーティングし、SEM/EDXを実行することは、意図するならば、あらゆるプロセスの最終ステップであるべきです。

EDX測定は、金属コーティングの前後に捕捉された粒子に対して実行できます。EDX は、ラマン分析の検出サイズ限界よりも小さい粒子や、金属、合金、水飽和微粒子、使用可能なラマンレーザービームにさらされると強く蛍光を発する粒子など、特定のラマンレーザー波長では分析が困難な元素組成と相性の良い、特定の粒子または領域の特定の元素組成を明らかにすることができます。この研究では、粒子を厚さ6nmのAuの層でコーティングしました。SEMイメージングは、200 kVのビーム出力と5 mmの焦点距離で、200倍から3,000倍の倍率で行われました。選択した粒子のそれぞれのSEM画像を 図3Dに示します。

代表的なEDX結果を 図3Fに示します。重量が1%未満の元素は、機器の感度に応じて、微量または信頼性が低いと見なすことができます。したがって、しきい値を 1% に設定しました。EDX分析用に選択した粒子がコーティングされている場合、元素データレポートには検出可能な量のコーティングが存在します。コーティングされていないSiNフィルターディスクを使用すると、 図3Fに示すように、Si信号とN信号が観察されます。ほとんどの合成ポリマー粒子には、残念ながら、生物学的ソースからのほとんどの非合成粒子も同じ元素でできているため、C、H、およびOの元素も含まれますが、非合成粒子には、タンパク質の場合のようにSなどの元素も含まれる可能性があります。このような組成の類似性により、ナイルレッドとトリパンブルーによる対比染色法は、合成粒子と非合成粒子の区別に役立ちますが、ナイルレッドは特定のケースで非合成粒子を染色することもできるため、網羅的な同定ツールではありません。上記で提案されているような追加の分析パラメーターは、結果を確認するために染色手順と組み合わせて使用する必要があります。さらに、EDXは、ラマン分光法の検出サイズ限界を超える粒子(つまり、1 μm<ナノプラスチック)を特定するための有用なツールになる可能性があります。

図1:SNAPパイプライン(A)SNAPパイプラインの概略図で、一連の異なる分析技術を通じて同じナノメンブレン上の同じ粒子を特徴付けています。パイプラインA) 1)真空ろ過により飲料水サンプルから捕捉された対象粒子は、2)合成高分子粒子と非合成高分子粒子を区別するためにナイルレッドとトリパンブルーで染色し、続いて3)ラマン分光法による粒子同定、4)SEM/EDXによる粒子形態と元素同定を特徴付けることを示しています。パイプラインB) 1)Au-SiNへの粒子捕捉とそれに続く2)ラマン分光法を示します。パイプラインC)1)Au-SiNへの粒子捕捉とSEM/EDXの探索を実証。(B)真空装置のろ過装置におけるフィルターディスクとシリコーンガスケットの概略図、シリコーンガスケットで分離された20μmのMPSNナノメンブレン、次に8.0μmのMSSNナノメンブレンを介した連続ろ過を示しています。略語:SNAP =シリコンナノ膜分析パイプライン;SEM = 走査型電子顕微鏡;EDX = エネルギー分散型X線分光法;MPSN = 微多孔質窒化ケイ素。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:飲料水サンプルの収集源。 モンロー郡水道局が発行した地域地図で、ニューヨーク州グレーターロチェスター地域で4つの飲料水サンプルがそれぞれ収集された場所を示しています。サンプルは、オンタリオ湖(青)、ヘムロック湖(緑)、ヘムロック湖とオンタリオ湖(黄色)、カナンデーグア湖(紫)など、さまざまな地表水源から採取されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:飲料水サンプルから捕捉された粒子に対して実施されたSNAPパイプラインAの分析の要約(A)20μmのカットオフSiN上の1つの代表的な飲料水サンプルから捕捉された粒子のグレースケール画像。(B)ナイルレッド(偽色の赤色粒子)とトリパンブルー(偽色の青色粒子)を表す対比染色粒子の偽色オーバーレイ画像。(C)参照(赤)および収集された(白)ラマンスペクトルにより、ナイルレッド染色粒子がピアソンのr値が0.97のポリエチレンとして識別され、粒子の代表的な画像が分析されました。(D)トリパンブルー染色をとっている繊維(上面)とフラグメント(下面パネル)の粒子形態解析を示す2つの異なる粒子タイプの電子顕微鏡写真。(E)20 μmおよび8 μmのカットオフナノメンブレンに連続的に捕捉されたナイルレッド染色粒子の定量。(F)ランダムに選択したフラグメントのEDX元素分析の要約と、分析された粒子の代表的なSEM画像を使用した結果の分析詳細。略語:SNAP =シリコンナノ膜分析パイプライン;SEM = 走査型電子顕微鏡;EDX = エネルギー分散型X線分光法。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:飲料水サンプルから捕捉された粒子に対して実施されたSNAPパイプラインBの分析の要約。 20 μm MPSN および 8.0 μm MSSN Au-SiN フィルターディスクで捕捉された 4 つの家庭用飲料水サンプルから抽出された 3 つのランダム化粒子のラマンスペクトル分析。20 μmおよび8 μmのAu-SiNの全活性膜面積の代表的な暗視野像を それぞれA および Bに示します。このイメージングモードでは、背景が暗いままで粒子が黄色く表示されるため、粒子の自動カウントが容易になります。(C)20 μmおよび(D)8.0 μm Au-SiN上の合成粒子と非合成粒子の代表的なラマンスペクトル。(E) 20 μm および (F) 8.0 μm の Au-SiN の総粒子数は、自動粒子検出ソフトウェアによって決定されたサイズ範囲によってビン化されます。略語:SNAP =シリコンナノ膜分析パイプライン;SEM = 走査型電子顕微鏡;EDX = エネルギー分散型X線分光法;MPSN = 微多孔質窒化ケイ素;MSSN = マイクロスリット窒化ケイ素。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:最適でない蛍光イメージングとラマン分光法の結果(A)染色された粒子の最適でない蛍光画像(左パネル)で、膜がナイルレッドの汚れを保持していたのは、おそらくすすぎ不足によるものと思われる。トリパンブルー染色繊維とナイルレッド染色フラグメント(右パネル)の2つの粒子をラマン分光法に選択しました。(B)ピアソン係数(r)が70%未満(r < 0.70)の場合の最適でないラマン分光法の結果。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表S1:フィルターディスク内のシリコンナノメンブレンの特性。 この表に示されているのは、SiNフィルターディスク内のメンブレンの特性(最小細孔サイズ、多孔率の割合、Auコーティングの有無にかかわらずメンブレンの厚さ、メンブレンの活性領域、および設定された一定の圧力で正圧が加えられた場合のメンブレンを通るガス透過率を含む)です。カットオフ(つまり、細孔サイズ)、多孔性、厚さ、および膜面積は、SEM画像上の測定機能によって決定されます。ガス透過性データは、103.42 kPa で印加された N 2 正圧の平均±標準偏差 (n = 10) として報告されます。略語:Au = Gold;Si_x N_y = 非化学量論的窒化ケイ素。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S2: ParticleFinder の粒子数とパラメータ。 各サンプルの全膜領域画像モザイクを採取し、各画像モザイクを分析して総粒子数を収集しました。この表に示されているのは、各サンプル画像の合計粒子数、および特定のサイズ分数での粒子数を決定するために使用されるパラメータと順序です。パラメータは、粒子の種類、量、形状、およびイメージング中の各メンブレンの比反射率を考慮して、サンプルごとに異なります。この表のデータを 図 4 に示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

マイクロプラスチック汚染の緩和は、ますます懸念される対象となっています。そして、緩和の最初のステップは、汚染の存在を特定することです。効率的なキャプチャーと即時分析の方法は、研究者の時間を節約し、機密性の高いサンプルメトリクスを維持するために重要です。このレポートでは、液体サンプル中のこのようなMPsを分析するために、当社が開発したSNAP法のバリエーションに基づく柔軟なワークフローについて説明し、実施するすべての分析に単一の基質を使用します。サンプルは、粒子が捕捉され、フィルターディスク内に収容されたシリコンナノメンブレン上に分離されるように、真空ろ過する必要があります。バックグラウンドコンタミネーションを十分に軽減することは、有意義な結果を得るために重要です。ろ過中に分注シリンジまたはガラス真空漏斗に付着した汚染粒子は、サンプルを汚染し、同時に捕捉される可能性があるため、セクション1の品質管理プロトコルに熱心に従うことは、正確な結果を得るために重要です。個々のプロセスやラボの条件に特有のバックグラウンドコンタミネーションを研究者に知らせるために、培地のみのコントロールが推奨されます。本明細書に記載のプロトコルは、液体サンプルの真空ろ過、ならびに2つの異なるカットオフSiNフィルターディスク上のサンプルからの粒子の捕捉および分離に依存する。すべてのパイプラインで、粒子の捕捉と分離は他の方法よりも優先する必要がありますが、他のすべての同定方法は、研究者に最も適した順序で行うことができます。

この研究では、2台の蛍光顕微鏡を使用して、機器間での結果の再現性を実証しました。オリンパスのBX61は、蛍光顕微鏡の使用が主流であることから、蛍光顕微鏡の使用が主流であること、および明視野を用いたグレースケールイメージング、TRITCチャンネル(例:~543 nm;全角。~593 nm)をNR染色粒子イメージングに、Cy5チャネル(Ex. ~649 nm;全角。~667 nm)を結核染色粒子イメージングに使用します。染色の結果を表示するには、2,048 x 2,040ピクセルの解像度と16ビット深度で、チャネル画像のオーバーレイを構築することをお勧めします(画像処理にはFIJI/ImageJを使用し、以降、画像分析プラットフォームと呼びます)。全ナノメンブレン画像は、 図4A、B のように、または 図3A、Bに示すように選択した関心領域として表示することができます。

ナイルレッドは、合成ポリマーMPの染色に一般的に使用されますが、その親油性および疎水性のために生物学的源からの非合成ポリマーを染色する可能性があり、MP定量結果を歪める偽陽性を引き起こす可能性があります24,25,26。プロトコールセクション3で概説されているように、Trypan Blueの対比染色ステップは、偽陽性イベントの鑑別を支援するために推奨されますが、網羅的な解決策ではなく、結果を確認するために追加の分析指標と組み合わせる必要があります。粒子のナイルレッド蛍光は、バックグラウンドシグナルを大幅に増加させる可能性があるため、ラマン分光法分析の懸念事項です。しかし、本研究では、ラマン分光法に先立って、830 nmレーザーを用いてNile RedとTrypan Blueでポリマーを対比染色したところ、図3に示すようにノイズはほとんど観察されませんでした。

ラマン分光法に適したレーザーの一部の波長は、532 nmレーザーのように染色された粒子からの蛍光を無視できないため、目的の粒子の組成を正しく推定することが非常に困難になる可能性があります。捕捉後の粒子の金属コーティングは、SEMイメージング中のコントラストを高めるのに役立ちますが、その後の分光分析や蛍光分析とは相容れません。実験のセットアップの前に、必要なすべての測定値をメモして、プロセスフローとコーティングの種類が適切に考慮されていることを確認してください。Au-SiNフィルターディスクは、透過顕微鏡がワークフローにとって重要でない場合、またはラマン分光法またはIR分光法を使用する場合に、前述のすべての分析に利用できます。

ここで紹介した方法や、目的の粒子を捕捉して単離するために使用されるナノメンブレンは、個々の研究者のニーズに合わせて変更することができます。ナノメンブレンは、多数の分光分析に適しており、研究者は、濾過される培地を、消化された動物組織²⁷、注射可能な医薬品、および油サンプルを含むがこれらに限定されない、関心のある別の試料媒体と交換することができる。この研究では、2台のラマン分光装置を使用し、 図4に示すすべてのデータを収集および処理したHoriba XploRA Plusラマン装置の使用について具体的に詳しく説明しています。また、各ラマン顕微鏡の検出サイズ制限を認識し、目的の粒子を装置のレーザーのスポットサイズで適切に分析できるようにすることも重要です。ラマンによる粒子同定結果を表示するために、 図3C および 図4Cのように、参照スペクトルとサンプルスペクトル、および分析された粒子の画像を表示することができます。

プロトコルセクション6では、オープンソースのスペクトルライブラリを使用した粒子同定の手順を詳しく説明しています。均一に平らなメンブレン上に粒子を平坦に捕捉し、メンブレンの規則的な細孔配列により、予測可能な自動イメージングが可能になります。SiNの厚さが400 nmまたは1,000 nmであること、およびそれらの窒化ケイ素組成は、SiNに優れた光学的透明性をもたらしますが、一部の分光装置パラメータでは強いシリコンピークを返すこともあります。ラマン分析でベアの非金属被覆SiNを使用する場合は注意が必要です。Siピークはキャリブレーション信号として機能する場合がありますが、ピークの強度は、Siの信号と同じ波数領域の低強度スペクトルの信号をマスクすることもあります。このようなSiピークは、この研究で830nmレーザーを使用したときには観察されませんでした。

ここで使用されているSiN(厚さ400nmまたは1,000nm)とAu-SiN(厚さ520nmまたは1,120nm)の極薄の性質により、優れたろ過特性、光学特性、および分光特性がそれらに与えられました。ただし、これらのメンブレンは、過度の差圧(≥-206 kPa)、ピンセットや指による直接の接触、またはガスケットの不適切な配置などによる物理的損傷から保護する必要があります。メンブレンをハウジングするフィルターディスクは、メンブレンを保護し、通常の使用での取り扱いを容易にします。フィルターディスクを操作するときは、黒い外輪にのみ触れ、アクティブなメンブレン領域には触れないでください。ここでは定量的に報告されていませんが、捕捉された粒子を少量のメンブレン表面積(20 μmの場合は3 x 3 mm、8.0 μmカットオフメンブレンの場合は3 x 0.7 x 3 mm)に収集することで、目的の粒子を見つけて分析するために必要な時間が短縮され、サンプル分析の合計時間が短縮される可能性があります。この「濃度係数」は、将来の調査に値し、研究者にとってSiNフィルターディスクのユニークな利点を提供する可能性があります。MP特性評価¹⁵に広く使用されている他のメンブレンと比較して、表面積の正規化された流量が高いことと組み合わせることで、均一に平坦で焦点の合ったSiNの比較的小さな領域をイメージングするだけでよい自動粒子イメージングルーチンは、総分析時間をさらに短縮できる可能性があります。ただし、仮説上の濃度係数に関連する利点は、従来のフィルターディスクとSiNフィルターディスクでの合計処理時間(ろ過から画像分析まで)を比較することにより、経験的に実証する必要があります。

私たちは、地元の水道水サンプルでSNAPバリエーションの有用性をヒューリスティックに実証しました。ここで説明するプロトコルは、ニューヨーク州ロチェスター周辺の飲料水源からのMP捕獲に焦点を当てています。サンプル収集は次のように進行しました:各サンプル収集について、収集を開始する前に少なくとも1リットルの水が蛇口に流れました。新しい密封されたポリプロピレンボトルは、流動蛇口に運ばれ、収集直前にすぐに開けられました。ボトルは、収集が進む前に飲料水ですすがれませんでした。各サンプルは、500 mLボトルを2本ずつ、1本ずつ直接採取したものです。各水サンプルは、異なる家庭のパイプシステムから採取されたもので、サンプリング全体でパイプの材質が一貫していませんでした。最近の水使用量、収集時間、パイプの築年数、サンプルの出所となった家の築年数などの変数は、この研究では制御できませんでした。これは検証済みのサンプル収集プロトコルではありませんでした。各研究者は、独自の収集手順を開発および検証する必要があります。ただし、方法の完全な開示のために、上記の説明が含まれています。フィルターディスクは、多くの分析方法において、同じ基板上で繰り返し分析することができます。サブサンプリングや、標準の試行反復以外の複数のサンプルは必要ありません。サブサンプリングや複数のサンプルの必要性をなくすことで、存在量の少ないターゲットに関する情報を捕捉する信頼性が向上します。マルチモーダル分析法を可能にすることに加えて、SiNフィルターディスクは、単位面積¹⁵あたりのろ過速度が速いという時間節約品質により、他の類似のろ過媒体よりも明確な利点を提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L ガラスビーカー	パイレックス	1000-1L
1 L ガラス製真空収集フラスコ	ミリポア シグマ	Z290459-1EA
綿 100% 白衣	ランダウ	LA-3172
100 mL ガラスろ過漏斗	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99% イソプロピルアルコール	Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX		EDX ソフトウェアは、捕捉された粒子の EDX 分析を実行するために使用されます。
Denton Prep スパッタリング システム	Denton Vacuum	DESK II : 293618089	金コーティング システム
FIJI、画像解析プラットフォーム	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI は単なる ImageJ) - ImageJ  の分布;
ガラススクリューキャップボトル	Corning	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	堀場科学		ParticleFinder と ViewSharp 層流フードを含む堀場ラマン ソフトウェア
	サイエンス	VLF-72A
顕微鏡	オリンパス  / ニコン	BX61 / Ti2e	蛍光を備えた顕微鏡は、光学顕微鏡に利用できます。
MPSN SiNフィルター	SiMPore Inc.	FD25-8.0-金;FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au、FD25-20.0-NC
モノジェクト 60 mL シリンジ	Coviden	8881560265
ナイル レッド パウダー	TCI	N0659
ニトリル手袋	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		オープンソース、スペクトルライブラリ
ブン	VWR	1310	Gravity対流式ユーティリティオーブン
P20 ピペット	Brandtech	705872
ピペットチップ	プレミアムバイアル	GS 151140R
注がれるサポートフリット	Advantec	311000	バンドルの一部
ラマン装置	Horiba	Xplora PLUS
ラバーストッパー	Advantec	311000	バンドル
SEM 装置の一部	Ziess	Auriga	Auriga シリーズ、モジュラー クロスビーム ワークステーション
シリコン ガスケット	SiMPore	ガスケット-25-R	クリアキャスト PDMS ガスケット、厚さ 0.8 mm
シリコン ローラー	三岳	(ASIN: B07XDTNPS3)	シリコンローラー - 8 x 5 x 2 インチ
SmartSEM	Zeiss	V8	SEM ソフトウェアは、Zeiss Auriga
スプレー ボトル	Uline	S-7273
シリンジ フィルターの操作に使用されます	サーモサイエンティフィ	CH2225-PES	0.22 & マイクロ;M ルアーロックシリンジフィルター、25 mm 
シリンジポンプ	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	オプションですが推奨
トリパン ブルー - 0.4%	ミリポア シグマ	T8154-20ML
ピンセット	SiMPore	K6TWZR
真空ポンプ	ウェルチ	847-676-8800
真空チューブ	グレインジャー	ZUSA-HT-4037