内皮細胞およびβ細胞相互作用の3D研究のための新しいアイレットモデル:細胞保護剤のスクリーニングにおける関連性

サマリー

このプロトコルは、マウス膵島の安定した球状体を生成する詳細な手順と、その小型サイズに適応した3D染色、クリアリング、マウントの詳細な手法を提供します。

要約

本プロトコルは、膵島の3Dモデルにおける内皮およびインスリン産生β細胞の相互作用を研究するための、小型安定球体の生成、培養、3Dイメージングの最適化方法を詳述しています。150〜200μmの球状体は、最小の膵島サイズ範囲を反映し、1つの島内内皮細胞(MS-1細胞)と20個のインスリン分泌細胞(β-TC-6)を組み合わせた選択された比率から調製されました。低融点アガロースおよびCUBICクリアリング技術を用いた小型球体の染色、クリアリング、マウントの課題、そして異なるプローブを用いた3D構造の効率的な解析のための重要なポイントが詳細に記載されています。データは、NTPDASE-エクトヌクレオチダーゼ3が球状モデルでインスリンと共局所化しないことを示しており、β-TC6の成熟度や機能レベルに異なり、完全な手順は孤立した膵島にも適用可能であり、島内血管の明確な探査が可能です。これらの発見は、膵島モデル内の複雑な膵細胞の組織と相互作用を明らかにする3Dイメージングプロトコルの有効性を強調しています。

概要

膵島移植はしばしば即時の血液媒介炎症反応(IBMIR)によって複雑化し、膵島内の内皮細胞(IEC)を著しく損傷し、移植片の灌流や機能に影響を与えます。長期的には、移植後4年で機能性膵島の質量減少とインスリン依存性の喪失が患者に報告されています^。マウスやラットを用いた膵島移植モデルは開発されていますが、IBMIRによって誘導されるサイトカイン駆動の移植片損傷の文脈で特に重要な、膵島の前調整のための薬理学的標的を調査するための標準化されたモデルは欠け^{ています。}実際、球状構造体は新たな薬理学的標的の同定や、サイトカイン誘発性細胞機能障害に対する細胞保護分子の評価に特に適しています。さらに、1型糖尿病および膵島移植の動物モデルの使用を制限する代替アプローチも提案しています。

島のサイズ範囲の小型球体に対して、適切な染色、光学的クリアリング、取り付け条件を見つけることは依然として困難です。文献では、小型球体の取り扱いやその主要な構造特性について記述した研究は非常に少ないです。また、組織の浸透性、信号保存、構造的完全性のバランスを取る必要があり、これらミニチュアな3D細胞構造の繊細な性質を維持する必要があることにも困難が生じます。さらに、従来の染色法では球体の均一な標識を得るのに苦労することが多いです。この問題は、抗体や染料の浸透が限られているため、密な細胞組織によって試薬の拡散が妨げられることによってさらに悪化^{しています。}最後に、光散乱背景を低減しイメージング深度を向上させるために不可欠な光学クリアリングのプロセスは、球体の構造を破壊したり生物学的特性を変化させたりしないよう慎重に最適化されなければなりません⁵。

3D顕微鏡観察のために小型球体を取り付けることもまた課題です。従来の取り付け媒体ではこれらの繊細な構造を十分に支えられず、画像撮影時に変形や崩壊を引き起こす可能性があります。さらに、最適なイメージング品質に必要な屈折率のマッチングは、球状体^6,7の深さ全体にわたる正確な可視化を確保するために精密に制御されなければなりません。小型球体に特化したプロトコルの開発は、球状培養で用いられる細胞タイプの多様性や実験条件によってさらに複雑になります^。最後に、染色およびクリアリングの過程で複数の細胞集団の完全性を維持するための専門的なアプローチの必要性は、細胞応答の評価に不可欠です。

IBMIR介在の膵島ストレス研究の特有の課題に対応するため、2000細胞の球状体モデルが設計されました。これはマウスのIECとインスリン分泌β細胞を組み合わせ、膵島で観察されるものと同様の1:20の比率でIECとβ細胞の比率を備えました。さらに、以前の実験ではこの構造が96時間持続することを確立しており、短時間(1時間範囲)または長いストレス誘発細胞反応(日数)とその薬理学的調節を観察するための生理学的に関連性の高い3Dモデルを提供しました。球状体モデルは、MS-1マウスの膵島内内皮細胞、膵島微小血管の特徴、およびβ細胞のインスリン分泌構造β-TC-6⁸で構成されています。膵島の最小寸法範囲(直径50〜200μm)とその平均細胞番号⁹を密接に模倣するよう設計されました。

直径150〜200μmの小型球体取り扱いに特化した新しい収穫・染色法が報告されており、蛍光染料や抗体を球状体構造全体に最適に浸透させ、背景を最小限に抑えることが可能となっています。プロトコルは、低融点アガロース(LMPA)を用いた取り付け手順を取り入れ、繊細な球体に優しい構造的支持を提供しつつ、最適な屈折率のマッチングを可能にします。LMPAは、ゲリングを約27°C、融点(約65°C)を低減したアガロースの改良形態で、埋め込み時に試料の完全性を保ち、自己蛍光が最小限の光学的に透明なマトリックス^{を作成します。}最後に、透明な遮蔽のない脳・身体イメージングカクテルおよび計算解析(CUBIC)¹⁰法が光学クリアリングに用いられ、内部構造の最大限の可視化と繊細な細胞間相互作用の完全性の維持を可能に^{しています。}

プロトコル

ヒト膵臓組織の使用およびすべての実験プロトコルは、フランス政府高等教育研究省(研究・イノベーション総局、生命倫理ユニット)によって承認され、番号DC-2019-3439で登録されました。すべての対象者の法定後見人からインフォームド・コンセントが得られました。

1. 球状体調製

注:マウスのIEC系統MS-1とマウスβ膵細胞株β-TC6は同時に培養され、球状培養に必要な細胞量を得ました。MS-1は、4.5 g/LのDMEM高グルコース培地でT75付着細胞フラスコで培養し、5%の胎児牛血清と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含み、湿度37°Cの大気で培養しました。 パッセージは、トリプシンEDTA 1xおよびハンクバランス溶液(HBSS)での3回洗浄を用いて、剥離後のコンフルエンシー(2日間培養)で実施されました。β-TC6は、4.5 g/Lの高グルコースを含むDMEM高グルコース培地で、15%胎児用牛血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを用いて、湿度37°Cの湿度の大気中でT75で培養しました。 トリプシンEDTA1xおよびハンクバランス溶液(HBSS)での3回洗浄後、トリプシンEDTA1xによる剥離後、β-TC6コンバージェンシー(10日間培養)でパッセージが実施されました。

1. 球状培養プレートを準備してください
2. 製造元が提供した500μLの接着防止洗浄液でプレートを洗浄し、細胞接着を防ぎ球状形成を促進します。
3. プレートを1,300 x g で室温で5分間遠心分離し、プレートホルダー付きのスイングバケットローターで行います。
4. マイクロウェル内に気泡が残っていないか、光学顕微鏡でプレートを観察してください。もしそうなら、1,300 x g で2回目の遠心分離機で5分間加熱してください。
5. アンチアタッチメントのすすぎは捨て、温かいHBSS1mLで3回洗います。
6. HBSSを廃棄し、500μLの温かい球状ミディウム(DMEM高グルコース、4.5g/Lグルコース、10%胎児用牛血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む)に置き換えます。
7. 球状懸液を準備する間、プレートは湿度の高い大気で37°Cに保ちます。
8. MS-1とβ-TC6をトリプシン溶液と同時にインキュベートし、各系統の生細胞数を数えます。
   注:種子授粉時に、球状体は膵島に典型的な1 IEC 対 20 β細胞比で形成されます。24ウェルの球状培養プレートを使用し、各ウェルには300個のマイクロウェルがあり、それぞれ2000個のセルからなる1つの球状体を収容できます。合計で1ウェルあたり600,000個のセルとなります。本研究では、48時間球体培養後、選択されたβ-TC6およびMS1細胞株が占める球状体体積が同一であることが測定されました。
9. 2つの細胞株を1対20の比率で24ウェルに合わせ、24mLの球状培地に懸濁します。
   注意:10 mLまたは25 mLのピペットを吸引流動で均質化してください。
10. 各ウェルごとに1 mLのピペットを使い、吸引-フローの動作で細胞懸濁液を均等に分散させます。
11. プレートを130 x g で室温のスイングバケットローターで5分間遠心分離します。
12. 顕微鏡でプレートを観察し、細胞がマイクロウェルに均等に分布しているか確認してください。
    注意:この遠心分離工程では、加速と減速速度を高い速度(加減速度スケールの70%〜90%)で行うと、セルの塊がマイクロウェルの側面にずれてしまいます。
13. プレートを37°C、_CO25%でキュベートします。
14. 光学顕微鏡を用いて球状体の形成と成長を監視します。
    注:β-TC6 / MS-1球体は培養24時間後に形成を開始し、48時間後には球状になります。トリプシンによる球状体破壊後、トリパンブルーによる生存可能性は重複サンプルで96時間(80%-90%)維持されました。

2. 球状体の収穫と染色

1. P1000ピペットで球体を優しく再懸浮させてください。
2. 球体を15 mLのファルコンで小容量に排出し、室温で130 x g の遠心分離機で5分間
3. 球状体を含むペレットは避けつつ、培地を優しく吸引してください。
4. 球体の解離を防ぐために、2 mLのHBSSで優しく2回洗浄し、130 x g で5分間遠心分離します。
5. 化学フードの下でHBSSを廃棄し、球体を4°Cで1mLの4% PFA溶液に一晩再懸浮させて固定します。
6. チューブを130 x g で5分間遠心分離し、4%のPFA溶液を捨て、2mLの1x PBS(実験室用超純水で調製)で3回洗浄します。
7. 2.5mLのHBSSに再懸濁します。
8. 球状懸流を6ウェルプレートに供給します。
9. 両眼虫眼鏡の下で、P200ピペットで20〜30個の球体を手でピックし、1.5mLのチューブに入れます。
   注:1.5mLのチューブは20〜30個の球体を含む染色状態です。20個未満の球体が収穫されると、その後再懸浮させると見えにくくなります。
10. 1.5mLチューブの体積を平衡させ、遠心分離機を800 x g で5分間保持します。
    注:ここ以降、溶液吸引工程はすべて虫眼鏡を使って行われます。人工光の下で球状体を見るのは非常に難しいです。以下の手順は必ず日中に行い、チューブを日光に当てて行ってください。すべての溶液はP1000の先端にP10の先端を重ねて吸気します。
11. 球体を再懸浮させずにできるだけ多くのHBSSを除去してください。
12. 球状体を400μLの焼入れ液(0.5 Mグリシン、1x PBS(pH 7-7.4))に再懸濁し、PFA固定による残留アルデヒドによる将来の背景ノイズを防ぎます。37°Cで2時間培養します。
13. 800 x g で遠心分離機で5分間加熱し、ピペットで焼入れ液を除去します。
14. 浸透バッファー400μL(0.2%トリトンX-100、0.3Mグリシン、20%DMSO1xPBS)に再懸浮します。これにより抗体や核プローブの浸透性が向上します。37°Cで2時間培養します。
    注:この段階以降、球体は自ら静止し、管壁にしがみつかなくなります。球状ペレットを乱さずに体積を穏やかに吸引すれば、遠心分離は不要になります。必要に応じて、800 x g で5分間遠心分離機にしてください。
15. 浸透バッファーを廃棄し、400μLのブロッキングバッファー(0.2% Triton X-100、1% BSA、1% DMSO、5% Goat serum in 1x PBS)に37°Cで一晩インキュベーションします。
16. ブロッキングバッファーを廃棄し、37°Cで300μLの一次抗体溶液(0.2% Tween 20、1% BSA、5% DMSO、5% Goat serum 1x PBSに含めて)で一晩培養します。
    注:使用された一次抗体は、抗CD31(最終濃度2.2 μg/mL)、抗インテグリンβ1(1.43 μg/mL)、抗インスリン(0.66 μg/mL)、および抗マウスNTPDase3¹¹ (希釈1:1000)(材料 表参照)です。同一アイソタイプの対照IgGを同一構造上で検証し、蛍光顕微鏡による正標識を確認する必要があります。
17. 一次抗体溶液を捨て、400μLの洗浄バッファー(0.2%トゥイーン20、1%BSAを1xPBSに溶かして)で3回洗浄します。洗う間に5分間シェイクしてください。
18. 二次抗体溶液300 μL(DAPI(2 μg/mL)、0.2% Tween 20、1% BSA、5% DMSO、5% Goat Serumを1x PBSに含めて37°Cで一晩インキュベートします。 チューブはアルミホイルで保護してください。
    注意:染色条件には必ずDAPIを加えるべきです。これにより顕微鏡撮影中に球状体を見つけやすくなり、異なる蛍光色素や染料の漂白を防ぐのに役立ちます。すべての二次抗体の最終濃度は2 μg/mLです( 材料表参照)。
19. 二次抗体溶液を廃棄し、400μLのセカンドウォッシュバッファー(0.2%トゥーン20、1%BSA、1xPBS)で3回洗浄します。最後の洗浄液を保管し、チューブは37°Cで保管し、同じ日に取り付けられます。

3. 溶液調製

1. 光学クリアリング溶液の調製
   注:光学クリアリング溶液はCUBIC¹⁰ 手順に従い、Gunasinghら4によって提案された方法で調製^{されました。}成分比率は最終溶液の重量(w/w)のパーセンテージで示されています。これは、クアドロール/N,N,N′,N′-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンは粘度が高すぎてピペットで処理できず、計量が必要だからです。
   1. ガラス瓶に、N,n,n′,n′-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン9%(水/水)、尿素22%(水/水)、ショ糖44%(水/水)、トリトンX-10000000000000水/水0.1%、実験室用超純水24.9%(水/水)の重さを含みます。
      注:24ウェルプレートをクリアするには約60gの溶液が必要です。
   2. ボトルの直径に合わせてマグネットバーを追加してください。
   3. 溶液を加熱し、56°Cまでかき混ぜます。 同じプレートに水を入れたコントロールガラスボトルを置いて温度上昇を監視してください。
   4. 攪拌速度を調整して液体の滑らかな渦を保ち、溶液をすべての化合物が完全に溶けるまでかき混ぜます。溶液は完全に液体で透明であるべきです。これには最大1時間かかることもあります。
   5. 室温で保管し、光から守ってください。
      注意:クリアリング溶液は、光学クリアリングの少なくとも24時間前に準備し、溶液が脱ガスされ、含まれる気泡を除去する時間を確保する必要があります。気泡が入らないように、二度と溶液を振らないでください。冷蔵保管は絶対にしないでください。
2. 2% LMPA溶液の調製
   1. 精密天秤でLMPA0.5gを重み、100mLのエルレンマイヤーフラスコに入れます。
      注意:少量のアーレンマイヤーはあふれると火傷のリスクがあるため服用しないでください。
   2. 室温で1xPBSを25mL溶かします。
   3. 粉末を1倍PBSに丁寧に混ぜて、エルレンマイヤーフラスコを優しくかき混ぜます。
      注意:次のステップでは、目や顔の防護具、手袋とマスクを着用し、飛沫や火傷から守ることが不可欠です。
   4. エルレンマイヤーフラスコを電子レンジで加熱します。
   5. 溶液が沸騰し始める(液体中に泡の存在)を観察し、沸騰しすぎる直前に取り除いてください。
   6. エルレンマイヤーを優しくかき混ぜて粉末を混ぜます。
      注意:あまり強くかき混ぜないでください。液体があふれたり沸騰したり、はねてしまう恐れがあります。
   7. エルレンマイヤーを電子レンジに戻し、LMPAが完全に溶けるまで繰り返します。
   8. エルレンマイヤーを取り外し、LMPAが固まる前に、2%のLMPA溶液1 mLを1.5 mLのチューブに素早く抽出します。常温で保存してください。
      注意:この手続きは時間がかかります。溶液は事前に準備して保存し、後で使うために保管してください。

4. 取り付けおよび光学クリアリング

1. 板の遠心分離機を40°Cまで予熱し、長いサイクルで試料板を準備します。
   注:LMPAゲルは30°Cで行われます。 遠心分離機は40°C以下で運転しないでください。 遠心分離機が許すなら、50°Cに増やしてください。
2. 2% LMPAのアリコットを70°Cの水浴またはチューブヒーターで5〜10分間液状化します。
3. 2%のLMPA温度を55°Cで下げて維持します。
4. イメージングプレートを50°Cに予熱した温め板の上に優しく置きます。
   注意:ウェルの基材として使われる繊細なポリマーを壊したり傷つけたりしないよう注意してください。
5. 2%のLMPAを加える前に、プレートが熱い状態であることに注意してください。この段階ではうまくいってはいけません。
6. 各ウェルに200μLの2%LMPAをピペットで注ぎます。支持体の底全体を覆い、最初の液体ベースを得て球体のより流動的な分布を可能にします。
7. 洗浄バッファーをチューブから外し、球体を2% LMPAの300μLに再懸浮させ、直接ピペットでウェルに入れます。気泡を避けるために、常に優しくリサスペンションを行いましょう。
8. 蛍光色素を保護するためにアルミホイルでプレートを覆います。
9. アルミホイルを貼らずに素早く皿の重さを測り、皿のウォーマーに戻します。
10. 24ウェルプレートを準備し、平衡のために水を加えます。
11. アルミホイル付きのプレートを素早く外し、二次抗体と結合した蛍光体を保護するためにプレートウォーマーから取り除きます。手に持って、冷たい場所に置かないでください。
12. アルミホイルを剥がして板式遠心分離機に入れます。
13. 遠心分離機で1000 x g 、40°Cで15分間加熱します。 ローターの温度を確認してください。室温であるべきです。
14. 遠心分離中に氷トレイを用意します。氷を平らにして平らな面に置きます。
15. 皿を取り除き、氷の上に置き、トレイや皿をアルミホイルで覆います。皿を氷の上に10分間置いてください。
16. プレートを氷から取り出し、アルミの中に置いて室温で20分間安定させます。
17. 1ウェルあたり1〜1.5mLのクリアリング溶液をピペットで抽出し、アルミホイルで覆い、室温で光を遮って少なくとも48時間光学的に透明化します。
    注意:プレートは決して4°Cで保管しないでください。 LMPAは収縮し、井戸の底から剥離し、クリアリング溶液中に浮かぶことがあります。画像は晴れてから1週間以内に。

5. イメージング

1. 共焦点回転ディスク顕微鏡を使い、最低でも30倍対物レンズを選びましょう。
2. クリアリング液は使い続けてください。これらは屈折率を均質化し、3Dイメージングを容易にします。
3. 他の蛍光色素の漂白を避けるためにDAPIチャネルを選択して球状体を見つけます。
4. Zスタック関数を使って画像を取得します。球体の上下を選び、光学スライスを10μm間隔で配置します。
   注:画像取得および画像解析は、CRBS(PIC-STRA UMS 38、Inserm、Unistra)のイメージングプラットフォーム上で実施されました。

結果

ラベリングと光学クリアリングの効果を評価するために、複数のモデルに同じプロトコルを適用し、その後固定化しました(図1)。上記の方法で、1 IEC から20 βセル、1 IEC 対 50 βセルの比率を持つ球状体が培養されました。注目すべきは、1 IEC 対 20 β細胞の比率は人間の膵島の比率に近似していることです。トリパンブルーを使って破壊された球体を染色した結果、96時間にわたって生存細胞(80〜90%の生きた細胞)を維持することが確認されました。この観察は、膵島移植の文脈でIBMIRサイトカインによって誘導される進行的な細胞変異や細胞保護剤の特定の研究において特に重要です。

サイトカインストレスの結果の一つがIECの形態と機能の変化であり、これがβ細胞生存やインスリン機能に影響を与えるため、GLP1類似体であるデュラグルチドを用いてサイトカイン誘発ストレスの3次元薬理学的調節の実現可能性をさらに裏付けました。過去の実験では、TGFβ-2またはIL-1...

ディスカッション

MS-1マウスのIECおよびマウスβ細胞β-TC6を組み込んだ球状体モデルが開発され、膵島の三次元構造を模倣しています。このモデルは、72時間にわたるストレス誘発IEC機能障害の解析と、β細胞の生存率および機能への影響を分析するのに適しており、膵島移植研究にも関連性があります。重要なのは、マウス細胞から構成された球状体は均質な性質を持ち、関連する島内内皮系譜を持っていたことです。

重要な成果としては、150〜200μmの小型球体を収穫、染色、光学的にクリアするプロトコルの開発と検証があり、三次元イメージングにおける課題、染色強化、LMPAによる構造支持、細胞の完全性を維持しつつ可視化を図るCUBIC光学クリアリング技術などに対応しています。このプロトコルの有効性は、IECとβ細胞比が異なる球状体(1:20および1:50)および単離されたヒト膵島で実証されました。

均一な染色、正確な細胞群区分、細胞間相互作用の保存、そしてヒトアイレットへの成功した応用が、その多...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
&マイクロプレート 24ウェル ブラック ID 14 mm	イビディ	82426
アグリウェル800(24井戸)	幹細胞	34815
粘着防止洗浄液	幹細胞	7010
抗CD31抗体[P2B1]	アブカム	AB24590	最終濃度:2.2&マイクロ;g/mL
アンチインテグリン&ベータ;抗体1、クローンMB1.2	メルク	MAB1997	最終濃度1.43とマイクロ;g/mL
細胞培養フラスコ、T-75、表面、表面 : Cell+、フィルトキャップ	サーステット	83.3911.302	β-TC6 文化
細胞培養フラスコ、T-75、表面:標準、2段階スクリューキャップ	サーステット	83.3911.02	MS-1文化
DAPIジハイドロ塩化物	サーモフィッシャー、	D1306	最終濃度2&微量;g/mL
ジメチルスルオキシド	シグマ	D8418-250ML
DMEM、高グルコース、GlutaMAX™サプリメント、ピルビン酸	サーモファイッシャー・サイエンティフィック	31966047
ドゥラグルチド
ドゥラグルチド	リリー	Trulicity 1.5mgペン
胎児用牛血清	バイオウエスト	S1810-500
グリシン	シグマ	G7126-1KG
ヤギ抗モルモットIgG(H+L)高交差吸着二次抗体Alexa fluor™555	サーモフィッシャー	A21435	最終濃度2&微量;g/mL
ヤギ抗マウスIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa fluor™488	サーモフィッシャー	A-11029	最終濃度2&微量;g/mL
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体Alexa fluor™633	サーモフィッシャー	A-21071	最終濃度2&微量;g/mL
ヤギ抗ラットIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor™555	サーモフィッシャー	A21434	最終濃度2&微量;g/mL
ヤギ血清	シグマ	S26-100ML
カルシウムなしのHBSS &マグネシウム &フェノールレッド	コーニング	21-022-CV
インスリン(C27C9)ウサギ抗体	細胞シグナル伝達	3014S型	最終濃度0.66&微量;g/mL
孤立したヒト膵島	センター・ヨーロッパ&エコート;en d'Etude du Diabete (CeeD)		カリム・ブザクリ博士からの親切な贈り物です。臨床グレードで、ガイドラインに従って隔離されています。
低ゲリング温度 アガロース	メルク	A9414-10G
MS-1セル	ATCC	CRL-2279
パラホルムアルデヒド溶液、PBS1%に4%	フィッシャー・サイエンティフィック	15670799
PBS 10x	ユーロメデックス	ET330-A	実験室グレードの超純水で1倍希釈した
ペニシリン・ストレプトマイシン	PANバイオテクノロジー	P06-07100
ポリクローナルモルモット抗マウスNTPDase3抗体およびnbsp;	mN3-1CI4;mN3-2C(I4,I5);mN3-3C(I4,I5)とnbsp;	https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.php	希釈 1:1000
クアドロール/N,N,N′,N′-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン	シグマ	122262-1L
スピニングディスクオリンパス IXplore SPIN	オリンパス・サイエンティフィック・ソリューションズ
分子生物学におけるショ糖	シグマ	S0389-1KG
Triton X-100 バイオクオリティ・ラボラトリーグレード	ユーロメデックス	2000-A
トリプシン/EDTA(10倍)	PANバイオテクノロジー	P10-025100
トゥイーン-20	ユーロメデックス	//
尿素	シグマ	U-5128
&β;-TC6細胞	ATCC	CRL-11506