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方法論記事

移植のためのラット腎臓の正常性機械灌流

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DOI:

10.3791/68251

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2026年1月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Organ Donation and Transplant Immunology, 3Sun Yat-sen University & Huayue Bio-Artificial Kidney and Renal Regeneration Research Laboratory, 4Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, 5Yuxi Zhongshan Hospital

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ラットの腎臓を体内外 で正常母 熱機械で灌流し、その後のレシピエントラットへの移植を記述しています。

要約

ノーモモミック・マシン・パーフュージョン(NMP)技術は、体 外 臓器評価および介入プラットフォームを提供する有望な臓器保存技術です。臨床的に廃棄された臓器の入手可能性が限られ、大型動物モデルのコストが高いため、小動物NMPモデルは研究の有望な代替案と見なされています。ここでは、ラット腎臓の標準化されたNMPおよび移植プロトコルを確立し、腎臓調達、NMP保存、移植のステップバイステップガイドを提供しました。NMPの詳細とパラメータは記録されました。この手術およびNMP技術により、すべてのラット受容者は無事に生存し、移植後腎移植片の機能は正常なままでした。術後7日目に、NMPの生存率および移植片組織学は静的冷蔵(SCS)と比較して有意な差は認められませんでした。この新しいNMP戦略は、小動物モデルにおいて将来的に臓器保存、評価、介入に関する基礎研究に役立つ可能性があります。さらに、このモデルは治療薬、画像診断技術、灌流関連介入の前臨床試験のためのコスト効率が高くスケーラブルなプラットフォームを提供します。

概要

末期腎臓病(ESKD)は、世界中の医療および医療システムに急速に増加している負担です。1,2,3。透析は多くの国でESKDの主要な治療法ですが、腎移植は依然としてゴールドスタンダードであり、透析1、3、4、5と比較して生活の質が向上し、生存率と予後の向上に寄与します。しかし、ドナー腎臓の不足により腎移植のさらなる普及は制限され、循環死後に提供された移植片(DCD)や拡張基準ドナーからの移植片(ECD)の使用増加を招いています6,7,8。

静的冷蔵(SCS)は現在、臓器保存の標準的な方法ですが、長期間の冷性虚血は移植片機能遅延(DGF)のリスクを高め、特にDCDまたはECDの移植片9,10,11,12で急性および慢性拒絶反応を引き起こします。したがって、冷性虚血の損傷を最小限に抑え、移植片の予後を改善する臓器保存方法を探すことが極めて重要です。ノーマモミック機械灌流(NMP)は、加熱され酸素化された灌流液を臓器12,13,14,15を通じて循環させることで生理学的条件を模倣できる、臓器保存のための新興技術です。これにより、ほぼ生理的な代謝状態を維持し、臓器の生存可能性を評価し、冷性虚血損傷の改善や臓器損傷の修復も可能となります(16,17,18,19,20)。SCSと比較して、NMPはDCDおよびECD両植毛でDGFの割合を減少させ、移植片の予後が良好です17,21,22。

豚の腎臓と臨床的に人間が廃棄した腎臓は、現在基礎NMP研究で使用されています。しかしながら、豚モデルには高い飼育コスト、大量の薬剤投与量、種特異的試薬の不足など大きな制約があることに注意すべきである。さらに、廃棄された人間の臓器の使用は入手可能性が限られ、倫理審査も複雑です。これらの制約が総じて、基礎研究における彼らの広範な応用を制限しています。対照的に、齧歯類小動物モデル(特にラットモデル)は、現在文献で十分に代表されていないものの、運用コストが大幅に低く、市販されている試薬が豊富にあります。これらの利点により、基礎研究の進展に有望なプラットフォームとして位置づけられています 26,27,28。この理論に基づき、本論文でラットを用いたNMPおよび移植モデルを開発・検証しました。

本論文は、ラット腎臓におけるNMP確立と移植に関する詳細なプロトコルを示しています。灌流液と灌流システムの準備、ドナーおよび受領者の腎臓の手術手順の包括的な説明が含まれます。このモデルは、特に関連医薬品の有効性を処理・モニタリングするプラットフォームとして、腎移植研究に理想的な動物モデルとなる可能性を示しています。

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プロトコル

動物プロトコルは、中山大学実験動物センターの動物ケア・利用委員会によって承認されました(番号:SYSU-IACUC-2023-000717)。本研究に参加したすべての動物は、生後7〜8週(250〜300g)のオスのスプラグ・ドーリーラットで、特定病原体フリー(SPF)で、実験動物の安全性の標準要件を満たしていました(補 足表S1の病原体除外リスト参照)。彼らは標準的な食事を与えられ、中山大学の実験動物センターの病原体のない部屋で飼育されました。
実験前にすべての手術器具をオートクレーブ(121°C、30分)で滅菌してください。処置中は使い捨て滅菌消耗品のみを使用し、すべての手術では無菌プロトコルを厳守してください。

1. 基本混沸液の調製

  1. 2.5gの牛血清アルブミン(BSA)、50mLのRPMI 1640、2%ペニシリン・ストレプトマイシン、0.6mgのクレアチニンを組み合わせて基本的なパーフューゼートを調製します(補足表S2)。
  2. 5%の重炭酸ナトリウム溶液(0.5-1.2 mL)を加え、pHを~7.3に調整し、塩基過剰(BE、灌流系の酸塩基バランスを測定する重要な指標)を~0に調整し、合計体積は~60 mLとなります。
  3. 0.22μmのフィルターで溶液をろ過し、粒子や細菌を除去します。
    注:完全な灌流液には塩基性灌流液50 mLとドナー血液10 mLが必要です(ステップ2.13参照)。

2. 腎臓調達

注意:8-0を使用してくださいすべての結紮部には外科的縫合が必要です。

  1. 麻酔チャンバーで3%イソフルランを投与し、手術中は1.5%イソフルランで全身麻酔を維持します。
  2. 手術前の準備。
    1. ステップ2.12で採取した腎臓を保存するために、ペトリ皿に20mLの予冷生理食塩水を加えます。
    2. シリンジに10mLの冷水高張クエン酸アデニン(HCA)溶液と1,250 Uのヘパリンを注ぎます。注射器を注入延長チューブと24Gの浸留針で接続します。
  3. ドナーラットを選び、イソフルランで麻酔します。後足反射がないことを確認することで、十分な麻酔深度を確認する。2.3.麻酔誘導後、電動バリカンを使って腹部の毛を剃ります(範囲:剣突起から恥骨結合まで、両側から腋中線まで)。
  4. 医療用テープを使って、ラットを手術用のボードに伏せて温熱パッドを敷いて固定します。ヨウ素浸しの綿球で腹部皮膚を消毒し、その後アルコール浸しの綿球で追加の消毒を行います。消毒済みの腹部皮膚に滅菌ガーゼを広げます。
  5. メスと鉗子を使って、楔突から膀胱までの正中切開(長さ約8cm)を行います。腹部の皮膚と筋肉層を順次開いていきます。
    注意:必要に応じて腹壁の血管をクランプして出血を防ぎます。
  6. 腹部壁をプルフックで引き戻し、手術部位を露出させます。
  7. 顕微鏡鉗子を使って結合組織を解離し、左腎臓と尿管を隔離します。
  8. 左の尿管の周りに結紮(結紮I)をつけます。腎門の遠位で左腎尿管を0.5〜1.0cm離れたところで切開し、長さ26G~0.5cmのチューブでカテーテルを挿入し、結紮Iを締めます(図1A、B)。
  9. 左腎血管を分離してください。腎動脈(結紮II)と腎静脈(結紮III)に結紮をします(図1A,B)。
  10. 連句IIとIIIを順次締め付けます。結紮部位の遠位にある血管と尿管を切開します。腎周結合組織を解剖し、腎臓を準備したペトリ皿に移します。
  11. 左腎動脈に組み立て済みの24G留置針をカニューレします。カニューレを結紮(IV型)で固定し、100 mL/hの流量で腎臓が白くなるまで灌流します(図1A)。
    注意:空気泡を防ぐために、灌流チューブと留置針に溶液をあらかじめ充填してください。
  12. 灌流された腎臓をペトリ皿内の氷の上で保管し、NMP開始まで保管します(ステップ2.1.1参照)。
    注:SCS群は、灌流された腎臓は15mLの遠心分離管に4°CのHCA溶液で3時間保存され、NMP群の腎臓は3時間灌流されました。
  13. 24Gの留置針と20mLの注射器を使い、腹部大動脈から1,250 Uのヘパリンを注射します。その後、上記の留置針を使って10mLのヘパリン化血液を採取し、完全な灌流液の準備を行います。ドナーラットを維持ガス麻酔下での大量出血による安楽死。
    注:完全なパーフューセイトはヘマトクリット(HCT)レベルを6〜8%に維持します。

3. NMPシステムの調製と灌流

  1. 灌流システムを組み立てます(図2)。
  2. 水浴をオルガン室を37°Cに保つように設定してください。 動物膜酸素供給装置に酸素を供給するために、90%酸素ガス の流入を起動してください。
  3. 細胞篩を通した後、臓器チャンバーでドナー血液10mL(ステップ2.13)と塩基性パーフューゼート(ステップ1)を混ぜて完全なパーフューゼートを得ます。ベースラインサンプルとして、混合試料の~2mLを残します。
  4. 蠕動ポンプを起動し、灌流(3 mL/min)を開始し、混合液を灌流管に充填します。クランプで無菌の丸糸をチャンバーに固定します。
  5. 混合物がチューブを満たして流れ出た後、腎臓(ステップ2.12)を灌流システムに接続し、灌流を開始します。パイプラインを固定するためにクランプを使用します(図1A、C)。
  6. 尿管カニューレを延長チューブで接続します。灌流中にマイクロ遠心分離機管で尿を採取してください。
  7. 灌流中は灌流圧を~80 mmHg、腎温を~37°Cに保ちます。 灌流流量、圧力、血管抵抗(灌流圧を灌流流量で割ったもの)を監視・記録してください。
  8. 30分ごとに1.0mLの滅菌水と酸素を20秒(3L/分、90%O2)加え、1時間ごとに1mLの液体と尿を採取してサンプルを保持し、血液ガスや血液生化学を測定します。
  9. 灌流終了時に、灌流液の血液生化学を測定し、ナトリウムとカリウムの排泄分量(FE)を計算します。前述の指数の計算式は以下の通りです。
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    ここでPNaは香料中のナトリウム濃度を表します。UCrは尿中のクレアチニン濃度を表します。ウーナは尿中のナトリウム濃度を表します。PCrは灌流液中のクレアチニン濃度を表します。は香水中のカリウム濃度を表します。UKは尿中のカリウム濃度を表します。
    1. 灌流中のpHは血液ガスの結果に基づいて監視してください。呼吸アルカローシス(過呼吸)の場合は換気を制限してください。
    2. 代謝性アシドーシスの場合は、パーフューセートに適切な量の炭酸水素ナトリウム溶液を加えます。
  10. NMPを3時間行った後、尿管延長管を外して尿サンプルを採取します。
  11. 腎臓を灌流システムから取り出してください。インドウェルをマイクロポンプに接続します。冷蔵庫で4°Cの冷蔵庫で適切な量だけ抽出し、腎臓が白くなるまで冷却したHCA溶液で腎臓を灌流します。
  12. 腎臓を留置針から取り出します。移植前に4°CのHCA溶液に保存してください。

4. ラット腎移植

注意:8-0を使用してくださいすべての結紮に縫合し、腎血管および尿管の吻合を行うための11-0縫合線。腹部の皮膚と筋肉の吻合を行うには3-0縫合糸を使用します。

  1. 手術の前日に、すべての受容ラットにメロキシカム(2mg/kg)を腹膜内注射し、鎮痛効果を用いてください。麻酔チャンバーで3%イソフルランを用いて麻酔を誘導し、手術中は1.5%イソフルランで全身麻酔を維持します。術後、局所的な鎮痛のために腹部切開部に2%リドカインスプレーを局所的に塗布します。
  2. 麻酔室で受容者ラットを選択し、麻酔します。後足反射がないことを確認することで、十分な麻酔深度を確認します。
  3. 麻酔誘導後、電動バリカンで腹部の毛を剃ります(範囲:剣突から恥骨結合まで、両側から腋中線まで)。
  4. 医療用テープを使って、ラットを手術用のボードに伏せて温熱パッドを敷いて固定します。ヨウ素浸しの綿球で腹部皮膚を消毒し、その後アルコール浸しの綿球で追加の消毒を行います。上記の消毒手順を合計3回繰り返します。消毒済みの腹部皮膚に滅菌ガーゼを広げます。
  5. メスと鉗子を使って、楔突から膀胱までの正中切開(長さ約8cm)を行います。腹部の皮膚と筋肉層を順次開いていきます。腹壁の血管を挟んで出血を防ぎましょう。
  6. 腹部壁をプルフックで引き戻し、手術部位を露出させます。右腎臓を結合組織から分離し、露出させてください。右腎血管(結紮用V型)と尿管(結紮型VI)を解離・結紮します。右腎を結紮糸Vの遠位端と結紮糸VIの近位端で切除します(図1A、D)。
  7. 左腎血管を隔離して露出させてください。次に、左腎動脈と静脈を順に血管クランプで挟みます。腎血管と尿管を切断して左腎臓を切除します(図1A、E)。
  8. 動脈と静脈の血管の光を完全に露出させます。ヘパリン化された生理食塩水(補足表S2)で、残留腔液が残らなくなるまで投与者の左腎動脈と静脈を洗浄します。
  9. ステップ3.12でドナーの左腎臓を受血者の左腹腔に移します。移植後は、3〜5分ごとに腎臓に氷で冷たい生理食塩水洗浄を行い、代謝低下を維持し虚血損傷を軽減します。
  10. 腎動脈(吻合I)と静脈(吻合II)を11-0縫合線で端から端まで吻合します。縫合中は、接ぎ木表面に冷たい生理食塩水を灌流してください。
    1. 腎動脈の上極と下極の両方を断続的に閉鎖します。
    2. 腎動脈の腹側を連続的に閉鎖します。腎動脈の背側を露出させます。腎動脈の背側側を連続的に閉じます。
      注意:血管壁に隙間がないか確認するために縫合糸を締めてください。各縫合で血管壁の全厚接着を確保しつつ、反対側への貫通を防ぎます。
    3. 腎静脈の上極と下極の両方を断続的に閉鎖します。
    4. 腎静脈の背側部分を連続的に閉じます。次の閉鎖に進む前に、連続吻合縫合を固定してください。腎静脈の腹側側を連続的に閉鎖します。
  11. 血管クランプを外し、腎動脈と静脈を開けてください。
    注意:少量の出血がある場合は、きれいな綿団で押して出血を止めてください。
  12. ドナーの尿管の26Gの尿管カニューレを受付者の尿管に挿入します。尿管切断を左右両側で固定します(閉合III)。
  13. 結合組織を腎周脂肪組織に縫合して移植片を固定します(図1A,F)。
  14. 腹部閉鎖前の移植片の外観(図1A,G)をご覧ください。処置後は腹部の筋肉層と皮膚層を順に縫合し、腹腔を閉じます。吻合部にリドカインスプレーを塗布します。回復中は温熱パッドで体温を保ち、歩けるようになったら代謝ケージに入れてモニタリングします。
    注意:腹部壁の層状閉鎖を、正確な組織の配置と各縫合部位の張力を確保してください。皮膚を閉じる際は、下の筋肉層の一部を取り入れてデッドスペースの形成を防ぎましょう。

5. 周術期投与および術後検出

  1. 周術期薬物管理:以下の薬剤が腹腔内注射で毎日投与されました:メロキシカムを術前1日から術後3日まで、2 mg/kgの用量で術中鎮痛のために投与しました。同種移植拒絶反応の予防のために、メチルプレドニゾロン・ソジウム・スクシン酸を4 mg/kgの用量で、手術当日から術後7日目まで投与しました。手術後の受容ラットの生存率と1日の尿排出量を監視・記録します。
  2. 術後7日目にラットに麻酔をかけ、腹部大動脈から生化学的測定のために血液を採取します。腎臓移植片を採取してください。組織採取後、持続的なガス麻酔下でラットを放血して安楽死させる。
  3. 腎臓サンプルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に固定し、標準的な脱水、クリアリング、パラフィン埋め込み処理を行います(サプリメント表S3)。パラフィン埋め込みブロックを4μmの厚さで切断します。その後、組織学的評価のためにヘマトキシリンと嗜酸(H&E、 サプリメント表S4)および周期酸シフ(PAS、 サプリメント表S5)で染色します。
    注:詳細な染色手順は 補足表S3、補足表S4、 補 足表S5に示されています。

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結果

この方法により、単離ラットの腎臓は少なくとも3時間は生 体外 正常母熱機灌流に有効です。NMP中、腎臓の灌流抵抗性(図3A、図 3 および 図4 の完全な基礎データセットは 補足表S6に記載)は5.958±1.106 mmHg/(mL/min)と安定的に維持され、確立された灌流システムの安定性を示しています。灌流期間中は腎臓が正常に尿を産生し(図3B)、ナトリウムの排出分率は低く、カリウムの排出率が高い(図3C)。これは灌流期間中に腎臓が良好な生理機能を維持していたことを示しています。

移植後のデータは、確立されたモデルの安全性と安定性も示しています。NMP群は、冷灌流...

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ディスカッション

NMPはグラフト虚血の期間を短縮し、16,17,18,19,20,32,33のグラフト質の評価と治療を可能にします。しかし、ラットモデルのNMPに対する統一された標準は存在しません。本論文では、NMPおよびその後のラット腎臓移植に関する動物モデルを開発し、腎移植分野におけるNMPの役割を探るための有用なツールとなり得ます。

現在、NMP研究で用いられている動物モデルは主に豚モデルですが、高額なコストのため関連実験の広範な開発は制限されてい...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(一般プログラム、助成金番号82470778)からの資金援助を受けました。中国国家自然科学基金(青年科学基金プロジェクト、助成金番号82201961);広東省自然科学基金(一般プログラム、助成番号2024A1515011447)、および広東省臓器提供・移植免疫学重点研究所(助成金番号2023B1212060020)、中山大学 - ARM腎臓再生・再建共同研究室(助成金番号:SYSU-50000-20240428-0001)。

著者らは、中山大学実験動物センターに実験動物、施設、機器を提供していただき感謝申し上げます。 図1 と 図2 は FigDrawで作成されました。Graphpad Prismはデータグラフ作成サービスを提供し、Biossci(湖北)バイオテクノロジーズ有限公司はパラフィンの断片および病理染色を担当しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルコール(75%)ムシヤンJJ-75-1
輸血装置佛山有展科技有限公司YZDW-15-5
牛血清アルブミン(BSA)アラジン・サイエンティフィック社。B265991-100g
セルストレーナー(70 & mu;m)コーニング生命科学(武江)有限公司352350
遠心分離機チューブ(1.5 mL)コーニング生命科学(武江)有限公司MCT-150-C- 1
遠心分離機チューブ(15 mL)ExCellの略歴CS015-0001
綿球河南旞安集團有限公司小型サイズ
綿棒佛山順徳康正衛生資材有限公司KZ3-12
クレアチニン上海元業バイオテクノロジー有限公司S20198-100g
二重円針ナイロン縫合(11-0)寧波医療針株式会社SYZ-11-0
電子スケールセンスンEHA17
フルードディスペンサー志宇医療YZ-00-0231
ガーゼジッターC11001-001
ヒートパッド広州徳威生物技術有限公司DK0032
ヘパリンナトリウム注射(12500 U、2 mL)成都赫帕屯製薬有限公司H51021209
赤外線温度計デリDL333380
注射用シリンジ(1 mL)ウィナー・メディカル(ヒューマン)株式会社ZT-ZS 1ml
注射注射器(10 mL) ウィナー・メディカル(ヒューマン)株式会社ZT-ZS 10ml
注射用シリンジ(20 mL)ウィナー・メディカル(ヒューマン)株式会社ZT-ZS 20ml
イソフルランRWDライフサイエンス株式会社R510-22-10
i-STAT 1 血液分析機アボット04P75-03(米国)
i-STAT CG4+カートリッジアボット03P85-25
i-STAT CHEM8+カートリッジアボット09P31-25
液体延長チューブ江西洪大医療機器グループ有限公司ZJ983
マイクロ1ラット酸素供給装置東莞科偉医療機器有限公司マイクロモーション
マイクロポンプエドキャプテンSYS-3011
ニードルフィルター(0.22 & μ;m)メルク・ミリポールSLGPR33RB
オルガン保存ソリューション長江製薬グループHCA II
オキシゲネーターオーゲルズオズ-3-02HWO
ペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/mL)サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社15140122
蠕動ポンプカモエル流体技術(上海)有限公司LLS Plus V2
蠕動ポンプチューブ佛山有展科技有限公司LG-1-14
ペトリ皿BKMAMBKM001
圧力センサーエドワーズ・ライフサイエンス・コーポレーションジプト-A-01-EDW
圧力センサー受信機シンギュラリティ・メディカルCB-202309001
RPMI 1640(1回、500 mL)コーニング生命科学(武江)有限公司R10-040-CV
生理食塩水YXH薬局A1001346
SDラット中山大学実験動物センターNA
シェーバービヨタイムFS600
シングルアングルニードルナイロン縫合(3-0)寧波医療針株式会社DJZ-3-0
単一円針ナイロン縫合(8-0)寧波医療針株式会社DYZ-8-0
小動物麻酔装置RWDライフサイエンス株式会社R500
小動物多臓器灌流装置ライフ Perfusor 医療PU-100金属製の皿、水浴、ヒーティングポンプ、温度センサーを含めてください
小動物手術キットビヨタイムFS500
炭酸水素ナトリウム溶液(NaHCO3、5%)東莞プジー医療技術有限公司H20064480
無菌手術用シート恒高テクノロジーSKR-BY-DD0001
無菌水海王略歴H35021140
ストレートハンドの点滴カテーテル(24 G)佛山有展科技有限公司20230816-1
外科手術顕微鏡マージダーMSD203
テープミネソタ鉱業製造会社。有限会社1527C-0
ティーコネクター佛山有展科技有限公司WGST-10
Y型留置型静脈カテーテル針(24 G)江西鳳林YZDW-7-5
Y型留置静脈カテーテル針(26 G)江西鳳林YZDW-7-6

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