方法論記事

心筋細胞のアライメントの変化を促進するためのマイクロパターン化された磁気レオロジーエラストマー

DOI：

10.3791/68271

⸱

2025年6月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

鉄粒子が埋め込まれた超軟質シリコーンエラストマー(ポリジメチルシロキサン、PDMS)を使用して製造された動的で可逆的な剛性アッセイプラットフォームを紹介します。この新しいアッセイは、コンタクトガイダンスを含む、細胞表現型における創発的な時間依存的な物理的変化の研究に適しています。ここでは、マトリックス硬化時の新生仔ラット心筋細胞の整列をマグネティクスを用いて測定します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

機械的およびトポグラフィーなどの基質関連の手がかりは、細胞応答に深く影響します。ただし、基礎研究の多くは、静的または孤立した効果を採用しています。これらの機械的影響が創発的な細胞応答に及ぼす影響の方向性と時間スケールは、まだほとんど解明されていません。時間とともに変化する基質関連刺激が生理学的および病理学的プロセスをどのように駆動するかを調べるツールは、機械生物学的洞察を次のレベルに引き上げることができます。ここでは、外部磁界に応答して急速に硬化および軟化できるマイクロパターン化された磁性流体エラストマー(MRE)を使用しており、新生仔ラットの心筋細胞の配向とアライメントに対する機械的(剛性)および接触誘導(トポグラフィー)刺激の影響をより厳密に調査することができます。機械的剛性の動的制御を時間的に調整および逆転させることにより、(1)同一条件下でのプレコンディショニング、および(2)心筋梗塞などの臨床的に関連する現象を適切に模倣するために in vitro バイオメカニクスを急激に変更することにより、負荷の影響を厳密にテストできます。このアプローチにより、負荷が細胞応答に与える影響をより現実的かつ制御された方法で研究することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心臓が効率的に血液を送り出す能力は、心筋の構造と機械的特性(剛性)に依存しており、細胞と組織の正確な組織化は協調的な収縮と全体的な機能に不可欠です。心筋は主に心筋細胞(CM)で構成されており、成人では、細胞の長さに沿って整列したサルコメア(CMの収縮単位)を備えた細長い、ほぼ棒状の形態を示します。対照的に、胎児または人工多能性幹細胞(iPSC)由来のCMは、成人のCMとは大きく異なります。それらは、より丸みを帯びた形状、単一の核、無秩序または整列していないサルコマー体構造、および不規則な鼓動周波数を持つ傾向があります。心筋の生体内組織の構造的類似性により、収縮と力の伝達の同期が可能になります。これは、in vitroモデルを通じて天然の心筋を再現するために重要かつ不可欠です。成熟心筋と同様の構造特性を持つCMを生成するために、以前の研究では、基質剛性の操作1,2、機械的ひずみの適用3、接触ガイダンス4,5の利用、または電気的ペーシング6,7の採用を含む、成熟を促進するための成功した戦略が実証されています。

細胞外環境の硬さが細胞に影響を与えることは、以前から理解されてきました。人体には、脳内の数百パスカル(Pa)から骨8,9,10の数十ギガパスカル(GPa)まで、非常に多様な硬さが存在します。発生中に組織は硬直を変化させ、この変化が細胞レベルの分化と正常な機能に必要な成体表現型への成熟を調節することがわかっています11,12,13,14。こわばりの変化は、病状や特定の病状の進行にも関連しています15,16,17,18。具体的には、心筋の硬さは病気の発症と進行とともに変化します。例えば、健康な心筋の弾性率は~10kPaであるのに対し、心臓の障害は35-70kPa以上の弾性率である19。さらに、多数のin vitro研究により、天然の心筋硬直に類似した基質で培養された心筋細胞は、より優れたサルコメア組織20、最適な収縮1,19を生成し、および最も長い活動電位持続時間21を有することが報告されています。

さらに、in vivoの細胞は、その微小環境内で形状と機能を駆動する複雑で多様な地形的手がかりにさらされていることがよく認識されるようになっています。これらのトポグラフィーの手がかりは、分子レベルでのインテグリンのランダムな配置から、筋肉組織22,23の細胞のミクロンレベルの整列まで、さまざまなサイズと形状で提供されます。他の機械的調節因子と同様に、トポグラフィーは、広がり、伸長、整列、運動性、分化、およびアポトーシス24,25,26などの細胞形態にとって重要である。合成培養基質の導入により、細胞および組織培養のための制御された表面トポグラフィーを作製する方法が開発された27,28,29。例えば、マイクロパターン化されたナノグルーブやマイクログルーブは、哺乳類細胞の接触誘導に使用されており、細胞が培養基質のトポグラフィー構造に追従するように細胞骨格を方向付け、再モデル化しています。

ここでは、磁場の強度を調整することで硬化または軟化できる調整可能な材料であるパターン化された磁性流体エラストマー(MRE)基板を使用して、構造的(接触手がかり)と機械的(剛性)ガイダンスの両方を統合したin vitro培養方法を紹介します17,30,31,32.培養基質の近くに磁石を配置することで、サンプルと磁石の間の距離を変えることで硬化の程度を変更できるため、剛性を高めることができます。逆に、磁石を全て外すことで剛性を下げることができます。このアプローチは、in vivoのような機械的条件を再現するための堅牢で動的、かつ制御可能な方法を提供するとともに、表面のマイクロパターニングにより異方性を導入し、より生体模倣的な2D細胞培養基質の作成を可能にします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. パターン化されたPDMSスタンプの作製

注:PDMSスタンプは、その柔軟性に不可欠であり、パターン化されたMRE表面を準備する際に簡単な操作と正確な接触を可能にします。また、スタンプの柔軟性により、パターンを損傷することなくMRE PDMS層から簡単に除去でき、正確なパターン転写とMRE表面の保存の両方が保証されます。

  1. 10:1(塩基:硬化剤)184PDMSを10g調製します。
  2. 184 PDMS の 5 g を 35 mm のシャーレに注ぎ、すべての気泡が消えるまでデシケーターで 5 ~ 10 分間脱気します。
  3. 184 PDMS を 60 °C のオーブンで 30 分間部分的に硬化させます。
  4. 184 PDMS が部分的に硬化するまでに 5 分が残ったら、余分な 184 PDMS の薄層を回折格子に追加し、デシケーターで ~5 分間脱気します。
  5. 部分的に硬化させた184PDMSを入れた35mmディッシュをオーブンから取り出します。
  6. PDMSを装着した回折格子を、35 mmディッシュ内の部分的に硬化した184 PDMSにひっくり返します。
    注意: 回折格子が 35 mm ディッシュの部分的に硬化した 184 PDMS に下を向いていることを確認してください。
  7. 回折格子を軽く押して、回折格子を少量のPDMSが取り囲むようにします。
  8. 残りの未硬化の184 PDMSを使用して、グレーティングを囲む皿を埋め戻し、硬化中に所定の位置に留まるようにします。
  9. 回折格子が入った皿を60°Cにセットしたオーブンに1.5時間入れます。
  10. 184 PDMSが完全に硬化したら、回折格子付きの35mmディッシュをオーブンから取り出します。
  11. メスで回折格子の周りをスコアリングします。
  12. 回折格子の下に浸透するように少量のイソプロピルアルコール(IPA)を塗布します。
  13. グレーティングを 184 PDMS からパターンに平行な方向に引き抜きます。
  14. 余分な 184 PDMS を削除し、パターン化されたセクションのみを残します。
  15. 184 PDMSスタンプを必要なサイズにカットします。
    注:この研究では、デバイスに1cm×1cmのスタンプを使用しています。

2. PDMSスタンプの表面コーティング

注:シラン処理により、スタンピング中のPDMS層間の不要な付着を防ぐ表面コーティングが作成され、スムーズな分離が保証され、パターン転写の品質が維持されます。

  1. シラン治療(好ましい方法)
    1. 作製した184 PDMSスタンプを、パターン化された表面を上にしてO2 プラズマクリーナーに入れます。PDMS表面を45WのO2 プラズマで30秒間処理します。
      注意: プラズマクリーナーから取り外したら、すぐにスタンプに蓋(またはカバー)をかぶせて、クリーニングしたスタンプに破片が落ち着かないようにします。
    2. 184枚のPDMSスタンプをドラフトのデシケーターに入れます。
    3. 微量遠心チューブの蓋をはがします。
    4. 微量遠心チューブの蓋を、デシケーターの184 PDMSスタンプの隣に置きます。
    5. 20 μLのトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランを微量遠心チューブの蓋に加えます。
      注意: この化学物質は健康に有害であるため、化学薬品のヒュームフードでのみ使用する必要があります。
    6. デシケーターを閉じて、掃除機を引きます。
    7. シランがスタンプを1時間から一晩でコーティングします。

3. 磁性流体エラストマーの調製

注:チューナブルMREとリバーシブルMREを作成するために、カルボニル鉄粒子とエラストマーの正確な比率と磁場の印加を組み合わせることで、さまざまな値で剛性を調整できます。粒子分率、ベースエラストマー弾性率、磁場強度を変化させることで、材料の剛性を特定の要件を満たすように微調整できます。

  1. よりソフトなダイナミックレンジMRE調製(ウエイトの例については 表1 を参照)
    1. シリコーンシンナーとエコエラストマーパートBの所望の量を測定し、スピードミキサーで2500rpmで1分間混合します。
    2. エコエラストマーパートAとカルボニル鉄粒子を溶液に加え、スピードミキサーで2500rpmで1分間混合します。
      注:混合の順序は、目的の重合タイミングを確保するために重要です。
    3. 先端を切り落としたトランスファーピペットを使用して、新しい35 mmシャーレに5 gのMREを加え、デシケーターで~5分間脱気した後、60°Cのオーブンで~10分間部分的に硬化させます。
      注:オーブンとデシケーターが適切に水平になっていることを確認することは、フラットなサンプルを達成するために不可欠であり、これはイメージングを容易にするために重要です。
    4. 残り5分になったら、トランスファーピペットを使用して未硬化のMREを追加し、184 PDMSスタンプの表面をコーティングします。コーティングされたstampをデシケーターに入れて5分間脱気します。
      注意: MREがstampの端を覆っていると、MREが完全に硬化した後にstampを取り除くのが難しくなるため、MREを使用しすぎないように注意してください。また、MREからスタンプを取り外すときに、パターンに平行な方向に引っ張ることができるように、すべてのステップでパターンの方向を示すようにしてください。
    5. MREをオーブンから取り出し、一対の鉗子を使用してコーティングされたスタンプを慎重に動かします。部分的に硬化したMREに裏向きを戻し、軽く押します。MREとコーティングされたスタンプを60°Cのオーブンに戻し、さらに25分間待ちます。
    6. 完全に硬化したら、メスを使用して、パターンに対して垂直にスタンプの下部にあるMREにスコアを付けます。
    7. スタンプ周りの切り口にIPAを少量塗布します。
      注:IPAはカットに浸透し、スタンプの下に移動し始めるはずです。
    8. 鉗子を使用して、パターンに平行な方向にMREからスタンプを引き抜きます。
  2. より剛性の高いダイナミックレンジMRE調製(ウェイトの例については表を参照)
    1. 30:1 184 PDMSを準備します。
      注:混合容器にくっついたままになるものもあるため、余分に作成してください。
    2. 必要な量の 527 PDMS パート A とパート B を加算し、次にカルボニル鉄粒子と 30:1 184 PDMS を表の例に基づく比率で追加します。
    3. 2500rpmでスピードミキサーで1分間混合します。
    4. 先端を切り落としたトランスファーピペットを使用して、新しい35mmシャーレに5gのMREを加え、デシケーターで~5分間脱気した後、60°Cのオーブンで~40分間部分的に硬化させます。
    5. 残り5分になったら、トランスファーピペットを使用して未硬化のMREを追加し、PDMSスタンプの表面をコーティングします。コーティングされたstampをデシケーターに入れて5分間脱気します。
      注意: MREがstampの端を覆っていると、MREが完全に硬化した後にstampを取り除くのが難しくなるため、MREを使用しすぎないように注意してください。また、MREからスタンプを取り外すときに、パターンに平行な方向に引っ張ることができるように、すべてのステップでパターンの方向を示すようにしてください。
    6. MREをオーブンから取り出します。
    7. 一対の鉗子を使用して、コーティングされたスタンプを慎重に動かし、部分的に硬化したMREに裏返して、軽く押します。
    8. 一番上のラックにコーティングされたスタンプが付いたMREを60°Cのオーブンに一晩入れます。
    9. 完全に硬化したら、メスを使用して、スタンプの下部にあるMREをパターンに対して垂直に切断します。
    10. スタンプの周りの切り口にIPAを塗ります。
      注:IPAはカットに浸透し、スタンプの下に移動し始めるはずです。
    11. 鉗子を使用して、パターンに平行な方向にMREからスタンプを引き抜きます。
剛性範囲料重量の例
柔らかい10〜80 kPaエコ(A + B)11.25 グラム (A)11.25グラム(B)
シリコーンシンナー22.5 グラム
鉄粒子45グラム
硬 め60〜120kPa527 PDMS (A+B)18.75 グラム (A)18.75 グラム (B)
鉄粒子37.5グラム
184 PDMS(ベース+キュア)14.5 g (ベース)0.5g(キュア)

表1:より柔らかいMREとより硬いMREの両方を製造するためのすべての材料の重量例。 表のウェイトは、合計90gのMRE材料を作るためのものです。表の例の重量と同じ比率ですべての成分を混合することで、より少ない調製で達成できます。

4. 細胞培養の準備

注:細胞培養の準備には、適切な細胞株の選択、必要な栄養素と成長因子を含む培地の調製、および汚染を防ぐための無菌状態の確保が含まれます。細胞を培養容器に播種し、最適な条件(通常は制御されたCO2で37°C)でインキュベートします。定期的なモニタリング、培地交換、継代などを行い、細胞の増殖を健康に維持します。

  1. MREの表面を70%エタノールで3回洗浄して滅菌し、3回目の洗浄を20分間放置します。
  2. MRE表面を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、皿を完全に覆うのに十分な量を加えてから、すべての液体を吸引します。
  3. MREの表面をPBS中のフィブロネクチン(10 μg/mL)で37°Cで1時間コーティングし、デバイスへの細胞接着を促進します。
  4. 手順4.1.2と同様に、MRE表面をPBSで3回洗浄します。
  5. 新生児ラット心筋細胞に20,000細胞/cm2の密度で播種します。
  6. 細胞培養中にマトリックスを硬化させるために、デバイスに磁石を一時的に追加します。
    注意: インキュベーターに磁石付きのデバイスを配置するときは注意してください。磁石が相互作用しないように、デバイスを遠く離して配置する必要があります。この研究では、相互作用が少ないため、銅で裏打ちされたインキュベーターよりもステンレス鋼で裏打ちされたインキュベーターの使用を推奨しています。

5. 染色とイメージング

  1. 固定細胞イメージング
    注:固定細胞イメージングには、特定の細胞成分を視覚化するためのいくつかの重要なステップが含まれます。まず、細胞はその構造を維持するために固定されます。次に、細胞膜を透過処理して染色が浸透し、続いてブロッキングステップが実施され、抗体や染色が他のタンパク質や細胞の破片などの意図しない部位に特異的に結合するのを防ぎます。その後、細胞を特定の分子を標的とする色素または抗体で染色し、余分な汚れは洗浄によって除去します。最後に、染色された細胞を蛍光顕微鏡を用いて画像化し、細胞構造を解析します。
    1. 皿を完全に覆うのに十分な量を追加して1x PBSで1回洗い、その後、すべての液体を吸引します。
    2. 4%(v / v)パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定します。
    3. 1x PBSで3回洗浄します(手順5.1.1と同様)。
    4. 0.1% Triton X(1x PBS中)を添加し、5分間インキュベートして透過処理します。
    5. 1x PBSで3回洗浄します(手順5.1.1と同様)。
    6. NH4Cl(1x PBS中に50 mM)を添加し、15分間インキュベートして急冷します。
    7. 1x PBSで3回洗浄します(手順5.1.1と同様)。
    8. ブロッキングバッファー(1x PBS中の5% BSA)を添加し、室温(RT)で1時間インキュベートします。
    9. 一次抗α-アクチニン一次抗体を1:200で5% BSA(1x PBS中)に組み合わせます。
      注:抗体を十分に混合します。
    10. 一次抗体溶液をサンプルに加えます。
      注:サンプル全体をカバーするのに十分な量を追加しますampル。
    11. 4°Cで一晩インキュベートします。
      注意: 溶液が混ざり合うのを助けるために、サンプルをロッカーに低速で置くことを検討してください。
    12. 1x PBSで3回洗浄します(手順5.1.1と同様)。
    13. 二次抗体(555 Alexa Fluor goat anti-mouse)を1x PBS(1:2000)で希釈します。
      注:二次抗体は光感受性(蛍光色素)です。直接使用しないときは、蓋をして光が当たらないことを確認してください。
    14. 二次抗体溶液をサンプルに加えます。
    15. RTで2時間インキュベートします。
    16. 1x PBSで3回洗浄します(手順5.1.1と同様)。
    17. DAPI(滅菌した脱イオン水に1 μg/mL)を加え、暗所で5〜10分間インキュベートします。
    18. 20倍ディップインレンズを備えた正立顕微鏡で細胞を画像化します。
    19. デバイスごとに50枚の画像を撮影します。
    20. Directionality という ImageJ プラグインを使用して画像を処理します。
      注:指向性オプション:この研究では、ラッピング効果を防ぐために、0°から176°の範囲のn = 45ビンを使用しました。採用された方法は局所的な勾配配向であり、表示テーブルが選択されました。方向出力は平均ベクトル角度 (整列角度を示す) に対応し、良さ出力は平均ベクトル長 (整列の度合いを示す) を表します。
  2. ライブセルイメージング
    注:ライブセルイメージングは、細胞を自然な生きた状態に保ちながら、動的な細胞プロセスをリアルタイムで追跡することができます。この手法では、インキュベーションチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して、細胞が成長、分裂、または刺激に応答する際の高解像度の画像またはビデオをキャプチャします。細胞の挙動と相互作用の経時的な研究を可能にし、細胞の機能とダイナミクスに関する貴重な洞察を提供します。
    1. SiR-アクチン比1:1000の細胞を培地と37°Cで1時間インキュベートします。
    2. メディアを吸引し、1:2000(SiR-actin:Media)と交換します。
      注:この希釈は、長時間のライブイメージングのための細胞毒性を低減するためのものです。
    3. インキュベーションチャンバー、自動ステージ、20倍ディップインレンズを備えた直立顕微鏡で、15分ごとに5時間免疫蛍光画像を収集します。
      注:ライブセルイメージング実験では、MREをライブイメージングシステムに配置するとすぐに磁石を追加しました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

超軟質シリコーンベースの磁性流体エラストマー(MRE)は、磁場を印加することで正確に調整できる弾性率を持っています。これにより、生理学的範囲内での迅速な双方向の調整が可能になり、変化の速度と大きさの両方を正確に制御できます(図1)。ゲル力学は、前述のように弾性率を測定することによって評価され、平均弾性率は、よりソフトなダイナミックレンジのMREでは磁石ありで36.3±5.2kPa、磁石なしで9.3±1.2kPaであり、より硬いMREは磁石ありで51.3±7.0kPa、磁石なしで40.2±3.7kPaの範囲であることがわかりました(図1)30、33,34.MREマイクロパターンは、市販の回折格子を使用した成形技術を使用して作成され、高さは約5.5μm、ピッチ(ピーク間の...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この手法は厳密にテストされていますが、実験を成功させるには、いくつかのステップに細心の注意を払うことが不可欠です。

このプロトコルでは、パターニングのマスターモールドとして市販の回折格子を使用します。しかし、代替のパターン化されたモールド−シリコンまたはSU8マイクロ製造されたモールド−もまた、異なるサイズ33,35で多種多様なパターンを作成するために用いることができる。市販のPDMS材料の中には、あらかじめパターン化されたものもあり36,37、これは、機械制御環境をパターン化するための効果的なスタンプとしても機能します。スピードミキサーは、PDMSまたはシリコーンをカルボニル鉄粒子と混合するプロセスを簡素化しますが、スピードミキサーで使用される時間の約2倍の時間、手作業による混合と...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、デラウェア州筋骨格研究センターCOBRE(P20 GM139760)によって部分的に支援され、国立衛生研究所およびデラウェア州の国立総合医科学研究所からの助成金を受けました。Center for Composite Materials(CCM)のSagar Doshi氏とデラウェア大学Dhong研究室のAshika Singh氏には、レーザー共焦点顕微鏡の使用許可と材料の表面特性評価に必要な専門知識を提供してくださった貴重なご支援をいただき、心から感謝申し上げます。彼らの貢献により、私たちの仕事の質が大幅に向上しました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
555 Alexa fluor ヤギ抗マウス二次抗体 サーモフィッシャー・サイエンティフィックA-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Mouse-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-21422
20倍ディップインレンズツァイス421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
35mmアンテナサーモフィッシャー・サイエンティフィック130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&focusarea=Search%20All
抗アルファアクチニン一次抗体アブカムEP2528Yhttps://www.abcam.com/en-us/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
カルボニル鉄粉マイクロスフィアchemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
DAPI染色サーモフィッシャー・サイエンティフィックD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
乾燥器フィッシャー・サイエンティフィック08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
回折格子ソー研究所GR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
エコフレックスジェル パートA&Bスムース・オンEcoflex GELhttps://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
拡張卓上プラズマクリーナーシグマ・オルドリッチZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
牛血漿からのフィブロネクチンシグマ・オルドリッチF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer フラックテックDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJソフトウェアNIHhttps://imagej.net/ij/download.html
イソプロピルアルコールアマゾンhttps://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS
Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8
KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx
uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx
dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW
l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87
5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR
8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7
uIto.V3Vf62Lnprtq2u5PRO
SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU&
dib_tag=se&hvadid=598724400239
&HVDEV=C&hvlocphy=9007460&HVN
ETW=G&hvqmt=e&hvrand=1609157
209668794739&HVTarkGid=KWD-3203
62094308&hydadcr=5273_13
227703&キーワード=イソプロピル+アルコール+
amazon&mcid=9f9d3252906531
3ea89ab7766d9c244c&qid=1740
675756&SR=8-1-spons&sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&PSC=1
マグネットCMSマグニティクスND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
ニコン Eclipse 80i アップライト顕微鏡ニコンエクリプス80i
オーブンフィッシャー・サイエンティフィック15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
シリコーンシンナースムース・オンシリコーンシンナーhttps://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
サー・アクチン・ステイン細胞骨格CY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
シルガード184 PDMS(塩基+硬化剤)エルズワース接着剤2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
シルガルド527 PDMS パートA&Bエルズワース接着剤1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
トランスファーピペットフィッシャー・サイエンティフィック13-711-5AMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&searchTerm=13
-711-5AMD&searchType=
RAPID&matchedCatNo=13
-711-5AMD
トリクロロ -(1H、1H、2H-パーフルオロクチル)シラン シグマ・オルドリッチ448931https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
  2. Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D. Substrate stiffness influences structural and functional remodeling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Front Physiol. 12, 710619(2021).
  3. Dou, W., et al. A microdevice platform for characterizing the effect of mechanical strain magnitudes on the maturation of iPSCcardiomyocytes. Biosens Bioelectron. 175, 112875(2021).
  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
  5. Ahn, H., et al. Hierarchical topography with tunable micro and nanoarchitectonics for highly enhanced cardiomyocyte maturation via multiscale mechanotransduction. Adv Healthc Mater. 12 (12), 2202371(2023).
  6. Chan, Y. C., et al. Electrical stimulation promotes maturation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. J Cardiovasc Transl Res. 6 (6), 989-999 (2013).
  7. Hirt, M. N., et al. Functional improvement and maturation of rat and human engineered heart tissue by chronic electrical stimulation. J Mol Cell Cardiol. 74, 151-161 (2014).
  8. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  9. Swift, J., et al. Nuclear laminA scales with tissue stiffness and enhances matrixdirected differentiation. Science. 341 (6149), 1240104(2013).
  10. Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear mechanics and mechanotransduction in health and disease. Curr Biol. 23 (24), R1113-R1121 (2013).
  11. Wozniak, M. A., Chen, C. S. Mechanotransduction in development: a growing role for contractility. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).
  12. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
  13. Hazeltine, L. B., et al. Effects of substrate mechanics on contractility of cardiomyocytes generated from human pluripotent stem cells. Int J Cell Biol. 2012, 508294(2012).
  14. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  15. Deng, B., Zhao, Z., Kong, W., Han, C., Shen, X., Zhou, C. Biological role of matrix stiffness in tumor growth and treatment. J Transl Med. 20 (1), 540(2022).
  16. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 63-73 (2009).
  17. Vite, A., et al. Extracellular stiffness induces contractile dysfunction in adult cardiomyocytes via cellautonomous and microtubuledependent mechanisms. Basic Res Cardiol. 117 (1), 41(2023).
  18. Stowers, R. S., et al. Matrix stiffness induces a tumorigenic phenotype in mammary epithelium through changes in chromatin accessibility. Nat Biomed Eng. 3 (12), 1009-1019 (2019).
  19. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heartlike elasticity: scarlike rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  20. Rodriguez, A. G., Han, S. J., Regnier, M., Sniadecki, N. J. Substrate stiffness increases twitch power of neonatal cardiomyocytes in correlation with changes in myofibril structure and intracellular calcium. Biophys J. 101 (10), 2455-2464 (2011).
  21. Boothe, S. D., et al. The effect of substrate stiffness on cardiomyocyte action potentials. Cell Biochem Biophys. 74 (4), 527-535 (2016).
  22. Curtis, A., Wilkinson, C. Topographical control of cells. Biomaterials. 18 (24), 1573-1583 (1997).
  23. Martínez, E., Engel, E., Planell, J. A., Samitier, J. Effects of artificial micro and nanostructured surfaces on cell behaviour. Ann Anat. 191 (1), 126-135 (2009).
  24. Ravichandran, R., Liao, S., Ng, C. C., Chan, C. K., Raghunath, M., Ramakrishna, S. Effects of nanotopography on stem cell phenotypes. World J Stem Cells. 1 (1), 55(2009).
  25. Brunetti, V., et al. Neurons sense nanoscale roughness with nanometer sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (14), 6264-6269 (2010).
  26. Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S. G., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: I. Simple step cues. Development. 99 (3), 439-448 (1987).
  27. Nguyen, A. T., Sathe, S. R., Yim, E. K. F. From nano to micro: topographical scale and its impact on cell adhesion, morphology and contact guidance. J Phys Condens Matter. 28 (18), 183001(2016).
  28. DowellMesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1 (2), 78-90 (2004).
  29. Loesberg, W. A., et al. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28 (27), 3944-3951 (2007).
  30. Corbin, E. A., et al. Tunable and reversible substrate stiffness reveals a dynamic mechanosensitivity of cardiomyocytes. ACS Appl Mater Interfaces. 11 (23), 20603-20614 (2019).
  31. Bouhrira, N., Vite, A., Margulies, K. B. Distinct cytoskeletal regulators of mechanical memory in cardiac fibroblasts and cardiomyocytes. Basic Res Cardiol. 119 (2), 277-289 (2024).
  32. Lee, B. W., et al. Adult human cardiomyocyte mechanics in osteogenesis imperfecta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (4), H814-H821 (2023).
  33. Cao, Z., Ball, J. K., Lateef, A. H., Virgile, C. P., Corbin, E. A. Biomimetic substrate to probe dynamic interplay of topography and stiffness on cardiac fibroblast activation. ACS Omega. 8 (6), 5406-5414 (2023).
  34. Clark, A. T., et al. Magnetic field tuning of mechanical properties of ultrasoft PDMSbased magnetorheological elastomers for biological applications. Multifunct Mater. 4 (3), 035001(2021).
  35. Kim, Y., Kwon, C., Jeon, H. Genetically engineered phage induced selective H9c2 cardiomyocytes patterning in PDMS microgrooves. Materials. 10 (8), 973(2017).
  36. Fujiwara, Y., Deguchi, K., Miki, K., Nishimoto, T., Yoshida, Y. A method for contraction force measurement of hiPSCderived engineered cardiac tissues. Methods Mol Biol. 2320, 171-180 (2021).
  37. Dirar, Q., et al. Activation and degranulation of CART cells using engineered antigenpresenting cell surfaces. PLoS One. 15 (9), e0238819(2020).
  38. Kim, C., Kim, H., Park, H., Lee, K. Y. Controlling the porous structure of alginate ferrogel for anticancer drug delivery under magnetic stimulation. Carbohydr Polym. 223, 115045(2019).
  39. Fan, D., et al. Recent advances of magnetic nanomaterials in bone tissue repair. Front Chem. 8, 745(2020).
  40. GonzalezRico, J., et al. Tuning the cell and biological tissue environment through magnetoactive materials. Appl Sci. 11 (18), 8746(2021).
  41. AntmanPassig, M., Shefi, O. Remote magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Lett. 16 (4), 2567-2573 (2016).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

PDMS

関連記事