自動サンプル交換ロボットを用いたハイスループットシリアル断層撮影

Summary

ダイヤモンド光源(DLS)I13-2イメージングビームラインの自動サンプル交換ロボットを用いたシンクロトロンベースのX線断層撮影の実装の詳細とデータ収集手順をここで示し、議論しています。これにより、ビームラインのスループットとデータ収集効率が大幅に向上します。

Abstract

本論文は、ロボットアームを用いたサンプル交換の自動化データ収集ワークフローを説明しており、データ収集の効率を大幅に向上させています。このセットアップは、ダイヤモンド光源(DLS)I13-2イメージングビームラインでのシンクロトロンX線イメージング用に実装されており、ロボットを用いて高スループットのシリアルトモグラフィー(3D)またはイメージング(2D)を実現します。現在、多くの実験では、手動のサンプル交換やアライメントにかかる時間は、断層撮影自体の時間と同等かそれ以上にかかっています。利用可能なビーム時間の効率的活用を最大化し、実験スループットを向上させるためには、サンプル交換とアラインメントの自動化が不可欠です。ロボットをサンプルチェンジャーとして使用することで、選ぶピクセルサイズによっては手動手順に比べてスループットを少なくとも4〜10倍向上させることができます。ダイヤモンドII装置とI13Lビームラインの Operando Coherent TOモグラフィーおよび P型 I型マギング(OCTOPI)アップグレードにより、X線フラックスの増加により実験スキャン時間がさらに短縮され、システムの効率がさらに向上します。さらに、この自動化によりリモートデータ収集が可能となり、ユーザー向けのオプションの郵送サービスも提供されます。自動サンプルセンタリングにより、完全な無人スキャンが可能で、遠隔で実施可能です。これはシステムの独自で革新的な特徴を表しています。この原稿では、サンプルの準備、特殊なホルダーへの取り付け、ビームラインへの輸送、ロボットサンプル交換用の専用トレイへの配置を含む全手順が記載されています。自動サンプルセンターリングおよびその後の断層再構築パイプラインの手順が提示されています。

Introduction

自動化は数十年にわたり重工業で広く利用され^{てきました。}しかし、ロボットのハードウェアとソフトウェアの開発は十分に成熟しており、ゲノムシーケンス、病院での医療手術の実施、化学実験の支援など非常に繊細な作業もこなせるよう^{になっています。}自動化は人的ミスを排除するだけでなく、スループット^と効率も向上させます。

シンクロトロンX線源は、赤外線から硬X線までの広範囲で非常に明るく高コヒーレントな電磁放射を生成します。これらのソースは、非常に短いスキャン時間と高い統計で高スループットかつ高解像度のイメージング実験を可能にします。部分コヒーレンスは、ポリマーや^{組織サンプルなどの}弱い吸収性の軟体材料に対して、実験室ベースのX線ソースと比べてより良いコントラストを得るために利用可能です。完全なX線トモグラフィーデータセットは、物体を実際の3Dで可視化することを可能にしますが、サンプルの異なる角度からの投影の取得が必要です。光源の明るさ、実験機器、制御の進歩により、データ収集時間は数十秒から⁸分の範囲に及びます。その結果、サンプルのローディングとアライメントは断層撮影自体よりも時間がかかるようになりました^11,12。シンクロトロン断層撮影実験でサンプルを手動で交換するには、実験ハッチの出入り時に放射線安全手順を踏む必要があるため(スキャン時間と比べて)かなりの時間がかかることに注意が必要です。この処置は通常数分かかります。さらに、サンプルのアライメントにも数分かかることがあります。

このサンプル交換とサンプルアラインメントのプロセスを自動化すれば、大幅な時間の節約になります。そのため、DLSシンクロトロン施設のI13-2イメージングビームラインにサンプルチェンジャーロボットが実装されています。本稿は、I13-2イメージングビームライン^11,12で複数のサンプルを用いてシンクロトロンX線マイクロトモグラフィー実験を行う全プロトコルを記述しています。この実装により、実験時間の効率が向上し、遠隔で実験が実施されることも可能になりました。代替案は手動または半自動運転で、どちらもかなり遅いです。ここでの半自動化とは、サンプルアライメントなしにロボットのみをサンプル交換に行うことを指します。

自動化の重要性は、他のシンクロトロンイメージングビームラインでの自動化プロジェクトによって強調されており、最も類似したプロジェクトはAPS¹³の2BMビームライン、SLS TOMCATビームライン¹⁴、PETRA III¹⁵のEMBL P14ビームライン、カールスルーエ工科大学(KIT)光源¹⁶のIMAGEビームラインなどです.2-BM APSでは、ロボットによるスキャンが必要な試料は標準的なキネマティックマウントに取り付けられ、最大60個の試料交換トレイに設置されます。その後、グリッパーアームで試料をピックアップし、回転ステージに取り付けます。ただし、サンプルのアライメントはオフラインでステレオスコープで行われます。同様のシステムがSLSのTOMCATビームラインにも設置されましたが、ここではプロセスが完全自動化されており、サンプル荷重アンロード、アライメント、適切な関心領域のスキャン、再構成が可能です。一度にスキャンできるサンプルの総数は60枚です。最近、PETRA III¹⁵ のP14ビームラインには、約1mmサイズの軟らかい生物サンプルを扱える試料交換システムが設置されました。位置決めとセンタリングは3クリックセンタリング手順で行われます。KIT の IMAGE ビームラインでは、高スループットの画像診断/断層撮影エンドステーションにより、^2日間で最大1,500点の標本を測定できます。前述のロボットシステムとは異なり、I13-2イメージングビームラインシステムは現在、直径最大8mmのサンプルを扱い、8時間のシフトで最大112個のサンプルを人工介入なしに測定でき、自動サンプルのセンタリングも含まれます。

現在のI13-2における断層撮影セットアップ、ダイヤモンド・マンチェスターイメージングのビームラインは、¹⁷号の出版物で報告されています。完全性のために、断層撮影実験の重要な側面をここにまとめます。図 1もご参照ください。トモグラフィーステージスタックは、サンプル操作および回転軸の傾き合わせのための六脚(PI miCos)で構成されています。エアベアリング回転段がヘキサポッドの上に取り付けられています。回転段は優れた揺れ(<2.4 μrad)と軸方向誤差(<100 nm)運動を有しています。断層撮影検出器システムは4つの異なる倍率(視野角)を備えています。本研究では、1.25×(2.6μm有効ピクセルサイズ、6.7mm x 5.6mmの視野)および4×(0.81μm有効ピクセルサイズ、2.1mm x 1.8mmの視野)の対物レンズが使用されました。1.25×対物レンズは500μmのLuAg:Ceシンチレータを搭載し、4倍の対物レンズは100μmのLuAg:Ceシンチレータ(Crytur)を搭載していました。sCMOS検出器(pco.edge 5.5)は、追加の2倍フォトアイピース(すべての顕微鏡光学機器はオリンパス製)を通じて拡大されたシンチレーションスクリーン画像を記録します。有効ピクセルは2.6μmから0.33μmの範囲で、最大倍率で約1μmの解像度です。検出器チップは2560×2160、ピクセルサイズは6.5μmで、ピクセルアレイの最大読み出し速度は100Hzです。

Protocol

注:本研究は、ロンドン自然史博物館(NHM)の昆虫標本を用いて表現型比較分析を行っています。標本は自然史博物館が取得し、標本が合法的に収集・寄贈されたことを確認するための標準的な取得手続きに従って取得されました。

1. 実験の計画

1. I13-2ビームライン上で対象のサンプルでトモグラフィーやイメージング実験を行う可能性は、以下のリンクからビームラインスタッフに連絡して確認してください:https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html 。
2. 計画された実験を行うための時間枠を取得するための提案書は、以下のリンクから提出してください:https://www.diamond.ac.uk/Users.html。
3. 提案が受理され実験が予定されたら、試料準備や試料測定プロセスについてビームラインスタッフと話し合ってください。ロボットを用いた実験には一定の要件があり、それは次のセクション(第2節)で説明されています。
4. 試料の寸法と組成をビームラインスタッフと相談し、実験がビームライン上で成功裏に実施可能かどうかを確認しましょう。
5. ウェブサイト(https://www.diamond.ac.uk/Users.html)の指示に従い、事前に実験的な訪問の準備を始めてください。
6. 実験セッション前に安全訓練を完了してください。

2. 試料準備(ロボット実験用)

1. SPINE互換サンプルベース¹⁸ をサンプルマウントのために準備してください。各サンプルを、データマトリックスバーコードを備えたSPINEスタイルの標準サンプルベースに取り付け、自動サンプルトラッキングを可能にします。
2. サンプルをベースに2つの構成のいずれかで取り付けます。ピン取り付け:サンプルをSPINEスタイルのサンプルピンに固定します(図1C、 挿入図参照)。容器または直接マウント:サンプルをマイクロ遠心分離機管やポリイミド管などの互換性のある容器内、または試料ベースに直接置く方法。
3. ロボットグリッパーとの寸法互換性を確認し、取り付けられたサンプルが許容サイズの範囲内に収まるかを確認し、安全なロボット取り扱いを確保します( 図2参照)。
   オプションA:直径8mm×高さ20mmの円筒の中に収まる。
   オプションB:直径3.5mm×高さ33mmの円筒の中に収まります。
4. 両方の構成がサンプルベースを中心にしていることを確認しましょう。全体の高さ(サンプル+マウント+ベース)が27mmまたは40mmを超えないようにしてください。配置によって異なります。
5. サンプルをSPINEのサンプルピンに取り付ける際は、サンプルがピンの上に位置し、ピンシャフトによって隠れる部分がないようにしてください。試料はロボットグリッパーとの接触を防ぐために、ピンベースに垂直かつ中央に取り付ける必要があります。これは特にプロトコルセクション2.3で説明されているオプションBのマウントや、サンプルピンの上に取り付けられる細長いサンプルの場合に重要です。
6. 容器やチューブ内に取り付ける際は、輸送やロボット操作中にサンプルがずれないようにしっかりと容器内に固定してください。容器自体がサンプルベース上で垂直に揃っていることを確認してください。
7. 選定された取り付け要素(ピンまたは容器)を試料ベースに安全かつ垂直に固定し、実験全体を通じて位置安定性を確保します。
8. 輸送中の剥離を防ぐために、信頼性の高い接着剤や固定方法を用いてください。これらの工程は機械的応力をもたらす可能性があるためです。
   注:一般的な接着剤にはシアノアクリレート(瞬間接着剤)、パラフィンワックス、ホットメルト接着剤があります。素材の互換性に不安がある場合はビームラインスタッフに相談してください。
9. すべてのサンプルが容器の上端から一定の高さまたはサンプルピン上に配置されていることを確認してください。容器内に取り付けるサンプルの場合、すべてのサンプルで容器の壁からの横距離が同じであることを確認してください。
   注意:安定した位置取りは、信頼性の高い自動アライメントに不可欠です。視野に対してサンプルが小さいほど、許容範囲が高まります。
10. 各サンプルに関連付けられたデータマトリックスコードを文書化し、データ分析時に正確なサンプル識別を確実にしてください。
11. 各サンプル名をそのサンプルベースデータマトリックスコードに関連付け、トモグラフィースキャンを実行するためのパラメータを渡すためのsamples.csvファイルを生成します。

3. サンプルの包装と配送

1. 実験セッションの15営業日前までに、実験リスク評価(ERA)を提出し、すべてのサンプルをそこで申告してください。このERAは、サンプルの輸送・搬送を許可する前に、DLSの健康安全(HSE)グループによる承認が必要です。
2. ユニバーサルサンプルベースと、サンプルピンに取り付けられたコンビネーションストレージおよび/または輸送コンテナ(Uni-puckとも呼ばれる)を組み合わせて使用してください。郵送で送る場合、これは非常に重要です。
3. 試料がステップ3.2で述べた貯蔵容器のスロットに収まない場合は、磁気保護キャップを用いて試料ベースに合うなど、代替のマウント方式を設け、直接サンプルを測定に持ち込むようにしてください。

4. 実験的セットアップ

1. 試料のコントラストを最大化するためにX線光源のパラメータを調整します。これを実現するには、全スペクトルをシフトしたり、X線スペクトルをフィルタリングしたりします。
2. X線スペクトルと、与えられたサンプルに対して望む位相差の度合いに基づいて、カメラとサンプル間の距離を最適化します。
3. サンプルサイズと必要な視野に基づいて顕微鏡の倍率を選択し、対応する顕微鏡対物レンズを選択します。
4. カメラの水平位置(実験室のX軸)をX線ビームに対して合わせます。

5. 試料の負荷とアラインメント

1. 各実験セッションの開始時に、損傷や緩く取り付けられていると思われるサンプルやサンプルマウントを徹底的にチェックしてください。そのようなサンプルがあればユーザーに知らせてください。
   注:現在、ビームラインには最大7個のパックを搭載できるマウントが装備されており、各パックは最大16個のサンプルを収容可能です。1回のロボットランで合計112個のサンプルを測定できます。パックスロット(ピン)位置の識別方法を示す 補足図2を参照してください。
2. サンプルはsamples.csvファイルで指定されたパックおよびパックスロット(ピン)にマウントします。ロボットの動作をテストし、必要な仕様内かどうかを確認するために、いくつかのサンプルに対してロボットサンプル交換手順の予行実行を行います。
3. サンプルピン付きのサンプルベース(サンプルなし)を使い、回転ステージの回転軸を検出器の中心に水平方向に合わせます。
4. ピンの上部をX線カメラの中心に移動させます(図3A)。望遠鏡カメラ(TC)は、画像(図3)に示されているようにビームに対して90°に配置されており、視野(FOV)の中心に位置します。この位置の座標をTCピクセル座標で求めます。
5. サンプルアライメントを処理するスクリプト内のサンプルターゲット位置を更新します。
6. 代表的なサンプルを設置してください。自動サンプルアライメントスクリプトを実行し、サンプルをTCの回転中心に配置します。スクリプトへのリンクは 補足ファイル1に記載されています。
7. 試料の関心領域(ROI)がX線カメラの視野(FOV)の中心にあるかどうかを確認しましょう。
8. ROIがFOVの中心でない場合は、ステップ5.5から5.7を繰り返し、ターゲット位置の座標を変更してサンプルアライメントを細かくします。
   注:セクション4および5はローカル担当者が担当しますが、セクション4.2は例外です。

6. データ取得のセットアップ

1. DLSファイルシステム上で、生データ、メタデータファイル、解析結果を保存するための必要なファイル/フォルダ構造が作成されているか確認してください。
2. samples.csvファイルをステップ6.1で言及されたフォルダにコピーします。
3. 試料構造と望むコントラストに基づいて、カメラの露光時間とsamples.csv内で取得する投影数を更新します。
4. モーター位置を、負荷位置(LP)と走査位置(SP)という2つのグループを定義します。LPは試料負荷に最適化されたステージのセットであり、SPは試料の断層撮影用です。
   注:セクション6はローカル連絡先によって実行されるか、DLSシステムによって自動的に作成されます。

7. データ収集の実施

1. samples.csvファイルの指示通り、すべてのサンプルを正しいパックとピンの位置にマウントしてください。
2. データ収集には、DLS(https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html)が開発したオープンソースソフトウェアであるGeneric Data Acquisition(GDA)ワークベンチを使用してください。これはDLSで実験の制御やデータ収集に使用されるJavaベースのシステムです。補 足図1にスクリーンショットが掲載されています。
3. GDAでトモマティックというオブジェクトを使って、サンプルの自動交換、サンプルアライメント、断層撮影測定を行います。
4. tomomatic.load コマンド(/dls/i13/data/year/...GDA端末でsamples.csv)ファイルを読み込むために。その後、トモマティックを発行してください。コマンドを実行するためのscan()です。
5. ロボットはまずローディングトレイからサンプルを取り、レーザーバーコードリーダーに持っていきます。バーコードが読み取られたら、サンプルをトモグラフィー段階に移動させてマウントします。全体のプロセスが円滑に進むようにしましょう。
   注:ここでは、社内開発のフレックスグリッパーを搭載したヤスカワ製ロボットを使用しています。
6. 試料の装填が行われると、各段はSP位置に移動します。その後、トモマティックスクリプト内でautoCentrePin関数を実行し、サンプルを回転中心(COR)に配置します。ロボットサンプルチェンジャーによるX線断層撮影の測定が準備完了しました。
   注意:トモマティック文字の疑似コードについては 補足ファイル1 をご確認ください。
7. 断層撮影測定のためのTomoFlyscan関数を実行してください。この関数はまずX線ビームを使わない40枚の投影画像(ダークイメージ(DI)と呼び、X線ビームを持つがビームにサンプルがない40枚の画像をフラットフィールドイメージ(FI)と呼びます。これらの画像はデータ再構築中の画像正規化に使用されます。
8. samples.csvファイルに示されているように、サンプルをビーム内に含んだ投影画像(PI)をサンプル回転角間隔で収集します。今回の場合、3001枚のPI画像があります。
   注意:7.5から7.8までのすべてのステップは、人間の介入なしに順に進行します。

8. データへのアクセスと分析

1. 保存されたデータにアクセスすると、適切なファイルシステムとフォルダに移動します。前節で述べたスキャンデータは、*.nxsファイルと*.hdfファイル(例えば123456.nxsと123456.hdf)という2つの異なるファイルに保存されます。NXSはスキャン用のメタデータを含み、HDFはすべての投影画像データ(NXSからのリンクデータ)を含みます。
2. 投影画像から2Dスライスを生成するにはSavu再構築パイプライン¹⁹ を使いましょう。
3. AVIZO/ImageJなどの3Dレンダリングソフトウェアを使って再構築画像にアクセスし、可視化します。
   注:セクション7および8の完了には、ユーザーとローカル連絡先の双方が連携して行動し、それぞれが個別のサブステップを実行します。

Results

図1 は、ダイヤモンドI13-2イメージングビームラインに設置された安川GP7サンプルチェンジャーロボットを示しています。 図1A はロボット(1)と社内設計のフレックスグリッパー(2)を示しています。このグリッパーは直径8mmの試料を保持≤可能です。 図1B は、トモグラフィーデータの取得に使われるロボット(1)と光学/X線カメラシステム(4)および(6)を示しています。ロボットグリッパーはサンプルトレイ(3)からサンプルを採取します。このトレイは7個のユニパックを収容でき、それぞれに16個のサンプルを収容できます( 図1C参照)。サンプルはアルミニウムダウエル(5)に取り付けられ、断層撮影データの取得は検出器システム(6)で行われます。(5)および(6)の詳細は、導入部の最後の段落に記載されています。 図1B の赤い切れ線はX線ビームの方向を示しています。

試料の取り付け方式とフレクチャーグリッパー設計の詳細は 図2に示されています。 図2A は、3Dプリントで製作された円筒形のプラスチックサンプルを試料ベースに接着している様子を示しています。試料の境界は最大試料高さと直径の包絡線を表します。赤い矢印は、フレクチャーグリッパーがサンプルベースを保持し、サンプルトレイからトモグラフィーステージへ、またはその逆に移動させる位置を示します。フレクチャーグリッパーの3D設計は 図2Bに示されています。グリッパーのフィンガーは空気圧制御駆動管によって作動されます(図1B、項目2)。グリッパーの中央空間の直径は8.9mmで、図 2Cに示されており、最大サンプルサイズは8mm、マージンは~1mmです。 図2D はトモグラフィーステージの上部の写真を示しています。アルミニウムのダウエルが2つの直交するステージの上に取り付けられ、磁気ディスクはサンプル底部の凹みがぴったり収まる正確な直径を持っています。このディスクは磁性であるため、断層撮影中は搭載されたサンプルベースをしっかりと固定します。

この代表的な実験のために、ロンドンの自然史博物館(NHM)から提供された64点の昆虫サンプルが選ばれました。標本は、グリッパーのサイズ制約内に収まりつつ、節足動物の表現型を表現する範囲を代表するものとして選ばれました。節足動物、特に昆虫は既知の種多様性の大部分を占めており、100万種以上の命名種があるため、表現型の比較研究において特にサンプルを取るのは難しいです。したがって、本サンプルは、節足動物の3つのクラスレベルのクレード(クモ類、エントグナサ類、昆虫類)をサンプリングし、さらに昆虫内でより細かくサンプリングして7目、今日生存する最も種の豊富な目のうち4目に分かる変異を捉えることで、この方法の可能性を示しています。標本は接着剤でカードに固定されていました。カードはサンプルピンに取り付けられました。サンプル(昆虫)を直接サンプルピンに取り付けることは避けられます。なぜなら、吸収率の低いサンプルでビーム内の非常に吸収性の高い構造は再構成時に条痕のアーティファクトを生じさせるだけでなく、サンプルピンにしっかりと取り付けるのが困難だからです。 表1は、ユーザーがトモグラフィーに必要なパラメータ(A、B、C、E、F、G、H、K)を入力するテンプレートsamples.csvファイルを示しています。各列の説明は表に記載されています。input_fileのD、I、J、L列は、ビームラインのトモグラフィーパラメータの整列と最適化後に埋められます。64個すべてのサンプルは、最初に1.25倍の対物レンズ(FOVは6.7 mm x 5.6 mm)で、最適化されたX線伝播距離(試料から検出器まで)で測定され、その後、同じ試料は4倍の対物レンズで独自の最適化パラメータで測定されました。サンプルがサンプルトレイに積み込まれ、実験用ハッチが固定されると、GDAでスキャンが開始されます。

サンプルの自動アライメントはPythonで書かれたスクリプトによって行われました(GitHub上のファイルの位置:https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc)。 最初はサンプルベースとピンの組み合わせを用いて、サンプルを使わずにアライメントを設定します。 図3 は、側面望遠鏡カメラ(X線ビームに対して90°の位置にあるカメラ - 図1B、項目4)で見られたサンプルピンを示しており、標準的なアライメントサンプルとして使用されています。望遠鏡カメラの画像は二元化されており、背景から試料を検出できるようにしています。試料のエッジは図 3に示されるように白色境界として決定・マーキングされます。サンプルの基準座標位置は 、図3Aの挿入図にある白い円で示されたピンの上部です。X線画像を見ると、試料のROIがCOR上で位置し、必要なターゲット座標位置(青い両頭矢印に赤い点の十字(図3B)で示され、サイドカメラで決定されます。このターゲット位置設定により、サンプルをCOR上だけでなく、必要に応じて数mm高く・下がったり、少し中心から外れた位置に配置することも可能です。サンプルが断層撮影段階に積み込まれた後、自動センタリング機能が実行されます。スクリプトはまずサンプルを目標位置(図3B)に移動させ、0°にします。次に、試料を90°に移動させ(図3C)、試料を回転中心(COR)に移動させるためにどれだけの量を動かすべきかを決定します。これには通常15〜20秒かかります。サンプルは現在COR上に置かれており(図2D)、CORはすでにカメラの中心に整列しています。システムは現在、トモグラフィー取得の準備が整いました。

このNHM昆虫研究では、人間の介入なしに128件の断層撮影が行われました。測定には合計17時間かかりました。各スキャンは約8分でした。ロボットを使わずにこのような実験を行うと、断層撮影1回あたり約20〜25分かかる見込みです。これは、ロボットによる断層撮影は、本例において手動スキャンの3〜4倍の速さであることを意味しています。 表2は 、ロボットのバッチスキャン終了時に生成される典型的なログファイルを示しており、各スキャン番号を対応するサンプルにリンクさせるために必要なパラメータが含まれています。追加の詳細は 表2 の凡例に記載されています。

図4は、前述の断層撮影実験中に1.25倍および4倍倍で撮影された、昆虫(昆虫綱、コウチョウ目)の正規化投影画像を示しています。最上段の図4A-Cは1.25倍で撮影された試料を示し、同じ試料が4倍で撮影された図4D-Fです。図4 A–Fは、0°、90°、180°で取得した投影画像を示しています。黄色い長方形は、4倍対物レンズで取得したズームイン投影画像のFOVを示しています。図1Cに示されたトレイにサンプルを積み込んだ後、すべてのプロセスは人間の介入なしに進行したことに注意が必要です。これら2回のスキャンは8.5時間の間隔で取得されたことにご注意ください。これはセットアップの安定性と再現性を示しています。

図5 は、 図4に記載された試料の断層再構成スライス集合からの水平または横断スライスを示しています。1.25x(図5A) と4x(図5B)のスライスはどちらも画像をトリミングせずにプロットされており、2510×2510ピクセルです。スライスは視野内で適切に中心に配置されており、物理的な介入なしに高倍率の領域にズームできることを示しています。

ここで示した結果は、シンクロトロンマイクロ断層撮影実験におけるサンプル交換のためのロボットシステムの実装が、いくつかの重要な利点をもたらすことを示しています。これには、スループットの向上、運用効率の向上、そして人間の介入を必要とせずに複数倍率(ズームイン)でスキャンを行う能力が含まれます。ここで紹介されているNHMの研究のようにスキャンが必要なサンプル数を考慮すると、手動スキャンだけで統計的に堅牢かつ一貫した結論を得ることは不可能です。

図1:I13-2ビームラインに設置されたロボットと断層撮影実験装置の写真。(A) 社内設計のフレックスグリッパーを備えたロボット(1)(B)サンプルローディングトレイ(3)および断層撮影ステージ(5)。光学カメラ(望遠鏡カメラ)は(4)と示され、試料をCORに合わせるために使用されます。測定に使用される検出器システム(6)には、視野角を自動的に変更できる複数の電動対物レンズとpco.edge 5.5検出器が含まれています。赤い破線の矢印はX線ビームの方向を表しています。(C) 7つのパックを備えたサンプルローディングトレイの写真。各パックは最大16個のサンプルをサンプルベースとサンプルピンの組み合わせで収納可能です。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:サンプルマウント方式およびフレクシャルグリッパー設計の詳細。 (A) 3Dプリントされたプラスチックダミーサンプルがサンプルベースに取り付けられた画像で、フレックスグリッパーが扱える最大サンプルのエンベロープを表しています。赤い矢印は、グリッパーがサンプルベースを保持する位置を示します。(B)フレクチャーグリッパーの3D設計。グリッパーの指はサンプルベースを保持または離すために作動します。(C) 寸法付きのグリッパーの垂直断面図。中央の最大開口部は8.9mmです。したがって、最大許容サンプルサイズは≤ 8mmです。(D) 断層撮影ステージの上部の写真。アルミニウム製のダボ(青い矢印で示されています)は、2つの直交段の上部に取り付けられています。磁気ディスクは、グリッパーによってサンプルベース(サンプルを含む)を位置付けるダボの上部に固定されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:側面望遠鏡カメラを用いたCORアライメント手順のビデオグラフからのスナップショット。(A) アライメントルーチン開始直前のアライメントピンの写真。青い両頭十字と中央に赤い点が標的位置であり、これは断層撮影の回転段階のCORと一致します。挿入図には、検出されたサンプル中心の高さと幅の両方を示すピン上部の拡大画像が示されています。(B) ピンが目標位置に0°で整列。(C)ピンが90°回転し、目標から外れています。(D) ピンがターゲット位置に90度で整列。ピンは両方の直交方向に整列します。したがって、試料はカメラの中心で回転します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:1.25xおよび4x対物レンズで収集した昆虫の正規化投影画像。この昆虫は昆虫綱、甲虫目に属していました。これは128回の断層撮影のうち2回に相当します。昆虫は紙に接着され、サンプルのピンに取り付けられました。1.25倍の対物レンズで投影する画像は、(A)0°、(B)90°、(C)180°、4xは(D)0°、(E)90°、(F)180°です。1.25倍および4倍の断層撮影は、人間の介入なしに1回のセッションで収集されました。1.25倍の画像セットはサンプルの全体像を提供し、4倍の画像セットはズーム機能を示します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5。異なる2つの視野角で取得した同一のトモグラフィースライスの比較。図4に示された投影画像の断層撮影から復元された単一のスライスで、(A)1.25倍および (B) 4倍の倍率で表現されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1: トモグラフィーパラメータを含むユーザーが提供する典型的なsamples.csvファイル。このファイルは、データ取得に使用されるトモマティックPythonスクリプトによって読み込まれます。A列(サンプルの説明)、B(パックID)、C(パックのスロット)、E(断層撮影の回転ステップ)、F(FI数)、G(DI数)、H(使用する倍率)、K(スロット優先度)はユーザーが入力します。列D(露光時間)、I列(試料とカメラ間のX線伝播距離)、J列(カメラのビーム上での移動によるCORをカメラ中心に配置)、L列(試料ベースのバーコード)は、アライメントと予備最適化後に埋められます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表2:すべてのサンプルがスキャンされた後にOutput_file.txtとして保存される典型的な出力ログファイル。 このファイルはすべての入力パラメータを報告し、さらにスキャンされたサンプルのバーコード(列M)、スキャン済みメタデータや画像ファイルへの経路(列N)、そしてFIを収集するモーターの位置(列O)も提供します。基本的に、この出力ファイルはデータの再構築や分析に必要な情報を提供します。入力ファイルのA列には入力がなかったため、この列には現在のスキャン数とパック番号、ピン番号が記入されます。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル1:サンプルチェンジャーとしてロボットを操作するスクリプトを説明する擬似コード。 このファイルには、自動サンプルマウント、データマトリックスコード読み取り、自動サンプルアライメント、断層撮影スキャンの実行手順が説明されています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図1:汎用データ取得GUIのスクリーンショット。 このインターフェースにより、基本的なカメラパラメータの調整、サンプルのライブ可視化、断層撮影の開始が可能になります。スキャンは画面上のボタン(手動スキャンのみ)またはスクリーンショット下部中央の黄色い長方形で示されるコマンドラインインターフェースから開始できます。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:SPINE標準パック(左)とパックキャップ(右)の写真。 サンプルベースが取り付けられるピン位置(赤で示されている)は、中央ホールディングポストの切り欠きの反対側から番号が付けられています。数字7267(白で示されている)はパック識別番号です。パックキャップはパックに取り付けられ、輸送や保管時にサンプルを保護することができます。キャップを取り付ける前に、サンプルサイズが互換性があるか必ず確認してください。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

Discussion

サンプルの準備とサンプルの整列は、自動サンプルチェンジャーロボットが^{正しく効果的に動作}するための重要なステップです。サンプルサイズとマウント要件は第2節(プロトコル)に記載されています。基本的に、サンプル直径は8mm以下で、サンプル^ベース12にしっかりと中心に置かれている必要があります。この制約はグリッパー寸法によって決まります。また、単一の測定におけるすべてのサンプルは同じ高さである必要があり、回転中心のサンプルの位置がすべてのサンプルで一貫している必要があります。ロボットが実験のためにアライメントされていれば、サンプルチェンジャーロボットで別の実験を実行することは完全に自動化されますが、サンプルの関心領域の設定は不要です。これは代表的な結果のセクション( 図3)で説明されています。また、これはビームラインスタッフ(局所接触)によるアライメントプロセスの一部であることも重要です。これが設定されると、すべてのサンプル測定は人間の介入なしに行われます。ユーザーの視点から見ると、測定は完全に自動化されています。現在使用されているのはMolecular Dimensions Ltdのサンプルベースとサンプルピンのみです。しかし、MiTeGenやHampton Researchなど、SPINEスタイルのサンプルベースやサンプルピンを製造する他のプロバイダーも存在します。

直径最大12mmのサンプルを保持できる大型のサンプルグリッパーが現在開発・試験中です。これにより、マイクロ遠心分離機チューブ内に設置され、サンプルベースに取り付けられた大型サンプルを扱うことが可能になります。改良されたグリッパー設計には、試料に側面から近づく仕組みを設け、現在の試料サイズの制限を取り除くことが考えられます。さらに、ビームラインのアップグレードによりスループットが桁違いに増加し、1日あたり3,000以上のサンプルのスキャンが可能になります。これにより、ビームタイム開始10日以内に約30,000サンプルの統計的に有意なデータセットを収集することが可能になります。近い将来、HTTomoと呼ばれる新しい断層再構築パイプラインを導入する予定です。

ビーム伝搬距離(試料から検出器までの距離)、露光時間、投影回数などのパラメータは、他のすべてのシンクロトロンX線断層撮影実験と同様に、事前に最適化する必要があることに注意が必要です。もう一つの制約は、実験に関わる6軸サンプル操作、断層撮影、カメラ操作段階などが、サンプルのロードおよびアンロードのために特定の位置にある必要があることです。これは、試料の積み込みと放出の際に各段階を前後に移動させる必要があることを意味します。

結論として、高スループットトモグラフィーは試料交換ロボットの助けを借りて実施でき、手動操作に比べて少なくとも4〜10倍の速さを実現し、デッドタイムを削減または排除します。ロボットを用いた実験的な自動化は、測定に必要な人員が少ないため、より効率的に人員を配置することを可能にします。統計的に有意なデータセットの測定は、科学的ケースに対応するために信頼性が高く十分な量のデータが必要な多くの科学分野で重要です。ロボットを使うことは、こうした作業に大いに役立ちます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
エアベアリング回転ステージ	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	トモグラフィー回転ステージ
AVIZO	ThermoFisher scientific		商用データ可視化・分析ソフトウェア
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	代替CryoCapサプライヤー
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	代替CryoCapサプライヤー
Cryocaps( MD7-401)とCryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	サンプル取り付け用
検出器光学	オリンパス/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	対物レンズとフォトアイピース
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	汎用データ取得ソフトウェア
ヘキサポッド	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	トモグラフィーアラインメントとサンプル操作のための6軸ステージ
ImageJ	National Institutes of Health, University of Wisconsinで開発	https://imagej.net/ij/	オープンソースの画像処理・可視化ソフトウェア
pco.edge 5.5 sCMOSカメラ	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	トモグラフィ撮像に使用されるX線カメラ
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	トモグラフィー再構成パイプライン
シンチレータ	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	シンチレータ光学
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	サンプルはUni-puckに取り付けられ、ロボットがピックアップします