方法論記事

末梢血幹細胞保存のための新規低DMSO凍結保護剤の開発

DOI：

10.3791/68275

⸱

2025年6月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、非常に低濃度のジメチルスルホキシドを含む造血幹細胞凍結保護剤を使用し、造血幹細胞の保護におけるその臨床的安全性と有効性を実証し、臨床自家幹細胞移植における造血幹細胞凍結保存の新しい戦略を提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

末梢血造血幹細胞(PBHSC)の凍結保存は、自家幹細胞移植(ASCT)にとって重要ですが、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を含む従来の凍結保護剤(TCPA)は、毒性リスクがあるため、安全性に懸念があります。この研究は、-80°CでPBHSCを保存するための新しい低DMSO凍結保護剤(CPA、2%DMSO)を検証することを目的としており、液体窒素の貯蔵の必要性を排除します。6人のドナーからのPBHSCは、CPAグループとTCPAグループに分けられました。CPAはPBHSC(1:1 vol/vol)と混合し、-80°Cで直接保存しました。TCPA(10% DMSO + 5%ヒトアルブミン)は段階的に冷却(1 °C/分)し、液体窒素で保存しました。1か月後、両群を37°Cの水浴で解凍した。細胞生存率、細胞骨格の完全性(マイクロフィラメント/微小管)、ミトコンドリア活性、およびコロニー形成能力を比較しました。解凍後、PBHSCの生存率はCPA(91.29%)とTCPA(90.07%)の間で同等でした。しかし、CPAは細胞生存率アッセイでTCPAを上回っていました(CPA:89.38%対TCPA:79.55%、p < 0.05)。細胞骨格解析により、CPAで保存された細胞には無傷のマイクロフィラメントと微小管が見られ、構造的な明瞭さはTCPAを超えていることが明らかになりました。CPA処理細胞のミトコンドリア活性は、新鮮なPBHSCを反映しており、TCPAよりも8.5%高い活性を示し(p < 0.05)、ミトコンドリア複合体数が増加しました。コロニー形成アッセイにより、CPAの優位性がさらに確認され、導入後のコロニー数が増加しました。CPAは、超低DMSO(2%)を使用して-80°Cでの安全で便利なPBHSC凍結保存を可能にし、液体窒素への依存を排除します。その細胞生存率の向上とミトコンドリアの保存は、注入毒性リスクを低減することにより、臨床的利点を示唆しています。このプロトコルは、ASCTの変革戦略を提供し、安全性と運用効率を最適化します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自家造血幹細胞移植(ASCT)は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などのさまざまな血液悪性腫瘍に対する確立された治療選択肢であり、集中的な化学療法または放射線療法後に造血を再構成し、免疫能力を回復するための第一選択または第二選択療法として機能します1,2,3,4,5,6,7 .ASCTの結果が成功するかどうかは、凍結保存された末梢血造血幹細胞(PBHSC)の生存率に大きく依存しており、PBHSC(PBHC)は造血および免疫再構成のための機能的能力を保持しなければならない8,9,10,11,12。造血幹細胞の保管は、自家造血幹細胞採取後、患者は通常、腫瘍細胞を排除するために放射線療法、化学療法、およびその他の治療を受けるため、ASCTの重要なステップです。造血幹細胞の貯蔵の質は、造血および免疫再構成の成功または失敗に直接関係しています13,14,15,16,17,18。凍結保存後の造血幹細胞の生存率を確保するために、臨床診療では、CPAとしてヒトの血中アルブミンとジメチルスルホキシド(DMSO)を添加することがよくあります。これらの薬剤は、凍結保存プロセス中および凍結保存プロセス後に細胞活性を維持するために重要です。通常、使用されるDMSOの濃度は5%から10%(v / v)の範囲です。研究によると、DMSO濃度を少なくとも3.5%〜10%(v / v)に維持すると、造血幹細胞凍結保存の有効性を高めることができることが示されています19,20。しかし、DMSOの臨床応用は、用量依存的な毒性のために依然として問題があり、移植レシピエントの30%〜60%が吐き気、嘔吐、低血圧などの副作用を報告しています21,22。5%-10% ジメチルスルホキシド (DMSO) を含む従来の凍結保護剤 (CPA) の制限に対処するために、この研究では、超低 DMSO 濃度 (2% v/v) を使用して -80 °C で安全で効率的な PBHSC 凍結保存を可能にする新しい CPA を開発することを目指しています。

トレハロースベースまたはポリマー強化CPAなどの新たな代替法は、前臨床の有望性を示していますが、規制上のハードルや標準的な解凍プロトコルとの非互換性のために、臨床翻訳の障壁に直面しています23。対照的に、当社のCPAは、HSA-DMSOシステムの確立された安全性プロファイルに基づいて構築されており、細胞保護を強化する最適化された添加剤比率を導入しています。この方法は、液体窒素のインフラが不足している、または迅速なワークフローが必要な臨床センターに特に適しています。ただし、長期保存(>2年)の場合、液体窒素は依然として好ましい24。臨床医は、プロトコールのシンプルさと個々の患者のDMSOに対する耐性のバランスを取り、造血幹細胞移植の安全性と運用効率を最大化するために、この戦略のカスタマイズされた適用を確保する必要があります。

この研究では、DMSO含有量が減少した凍結保護剤を使用することは、造血幹細胞凍結保存の有効性を維持しながら、関連する毒性を最小限に抑えるための重要な戦略を表しています。新開発の造血幹細胞CPAの有効性、安全性、利便性について、末梢血造血幹細胞(PBHSC)の保存について評価した。新しいCPAを利用した簡単な直接凍結法が実装され、従来の凍結保存プロトコルが回避されました。この知見は、低濃度のDMSO CPAを用いた-80°Cでの細胞懸濁液のワンステップ凍結保存が、従来のCPA(TCPA)と比較して優れた保存効果を発揮することを示しています。このアプローチは、造血幹細胞移植(HSCT)の臨床プロセスを合理化するための新しい戦略を提供する可能性があります。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ASCTを受ける血液腫瘍科の患者さんは、2020年6月から2022年6月にかけて、深圳がん病院の血液科で募集されました。HSCTのための移植動員の前後に血液細胞サンプルを採取し、急性骨髄性白血病(AML)2例、ホジキンリンパ腫(HL)2例、皮膚真組織球性リンパ腫(CGHL)1例、原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)1例を含み、年齢中央値は53歳、範囲は35歳から61歳であった。この研究は、患者からインフォームド コンセントを受け、深センがん病院の倫理審査委員会から承認を受け、倫理承認文書番号 AF-SC-07-2.0 を取得しました。すべての動物実験手順は、中国医学院癌病院実験動物倫理委員会によって承認されました(承認番号。NCC2018A073)動物研究に関する国際的なガイドラインを遵守していること。

1. 造血幹細胞サンプルのサブパッケージングと凍結保存

  1. 無菌ワークステーションの準備
    1. 手をよく洗い、滅菌マスクと手袋を着用してください。手、手首、肘を75%エタノールで消毒します。
    2. すべての予備の器具(ピペット、止血器)をオートクレーブまたはUV照射で滅菌します。バイオセーフティキャビネットに次の材料を配置します:1 mL滅菌パイロジェンフリーピペットチップ(2ボックス)、1000 μLピペット、滅菌1.8 mL凍結保存チューブ、50 mL遠心チューブ、および凍結保存チューブ収納ボックス(プログラム可能な凍結ボックス)。
  2. ラベリングと細胞-CPA混合
    1. 凍結保存チューブにサンプルID、日付、細胞数、ドナー名を標識します。
    2. 180〜200mLの造血幹細胞が入った造血幹細胞バッグを、100mLの新規低DMSO凍結保護剤が入ったCPA含有バッグに滅菌注入チューブで接続します。
    3. 滅菌止血器でチューブの中点をクランプします。一方の端を細胞CPA混合バッグに取り付け、もう一方の端を50 mLの遠心チューブに取り付けます。
  3. 充填と凍結保存
    1. 止血剤を放出して、細胞-CPA混合物の遠心分離管への制御された流れを可能にします。
    2. ピペットを使用して遠心分離チューブから1 mLアリコートを吸引します。アリコートを標識済みのクライオチューブ(30本/サンプル)に移します。キャップを締め、チューブを収納ボックスに入れます。
  4. 保管と輸送
    1. すぐに収納ボックスを-80°Cの冷蔵庫に移します。輸送する場合は、クライオチューブをドライアイス(-78.5°C)に詰め、温度を監視します。

2. PBHSCの凍結保存と回収

  1. CPAおよびTCPAの調製と混合
    1. 氷のプラットフォームを2〜8°Cに予冷します。 造血幹細胞CPAおよびTCPAをメーカーのガイドラインに従って解凍します(CPA / TCPA組成物については 表1 を参照)。
    2. CPAとTCPAを6つのPBHSCサンプルと混合し、氷のプラットフォーム上で1:1の体積比で混合します。細胞懸濁液を滅菌クライオバイアルに移します。
  2. CPA凍結保存
    1. クライオバイアルを-80°Cの冷凍庫に直接置きます。懸濁液中の最終DMSO濃度が2%(v / v)であることを確認してください。サンプルは1か月間保存します。
  3. TCPA凍結保存(比較制御)
    1. 5%のヒト血中アルブミンと10%のDMSO(v / v)を含むTCPAを調製します。PBHSC 懸濁液をクライオバイアルにロードし、プログラム可能なフリーザーを使用して 1°C/分で -80 °C に冷却します。
    2. クライオバイアルを液体窒素に移し、長期保存します。サンプルは1か月間保存します。
  4. 細胞蘇生法
    1. 1ヶ月後にクライオバイアルを回収します。細胞を37°Cのウォーターバスで穏やかに攪拌しながら解凍します(≤5分間)。
    2. 300 x g で10分間遠心分離し、残留CPA/TCPAを除去します。1 mLの細胞を予熱したRPMI 1640培養培地に再懸濁し、ダウンストリームアッセイに用います。

3. 細胞生存率アッセイ

  1. 画像ベースの細胞カウント
    1. 10 μg/mL のアクリジンオレンジ(AO)と 10 μg/mL のヨウ化プロピジウム(PI)を含む混合染色溶液を調製します。
    2. 100 μLの細胞懸濁液と100 μLの染色溶液(1:1の比率)を滅菌マイクロ遠心チューブで混合します。
    3. 染色したサンプル10μLを自動セルカウンターにロードします。統合ソフトウェアを使用して細胞生存率を解析します。
      生存率 = 生細胞 / 総細胞数 x 100%
  2. フローサイトメトリーの検証
    1. 100 μLの結合バッファーにアネキシンV-FITC(5 μL)とPI(5 μL)を混合して、アネキシンV-FITC/PI染色溶液を調製します。
    2. 300 μLの細胞懸濁液を染色溶液に加え、暗所で25°Cで15分間インキュベートします。
    3. 混合物を300 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を500 μLのPBSに再懸濁し、フローサイトメーター25を使用して生存率を分析します。

4. コロニー形成アッセイ

  1. 細胞懸濁液調製
    1. 細胞懸濁液を0.4%トリパンブルー溶液と1:1の比率で混合し、3分間インキュベートして生細胞と死細胞を区別します。自動セルカウンターを使用して重複カウントを行い、生細胞密度を決定します(生存率>90%)を確認します。細胞懸濁液の量を目標濃度(1 x 106 細胞/mL)に調整し、40 μmストレーナでろ過して単一細胞が分散するようにします。細胞懸濁液を40 μmの滅菌細胞ストレーナーでろ過し、凝集体を除去します。
  2. ミディアムミキシング
    1. 1 mLの細胞懸濁液と9 mLの市販マウスコロニー形成ユニット培地を15 mLコニカルチューブ(1:10 v/v)で組み合わせます。
    2. 混合物を1,500rpmで30秒間ボルテックスし、均質性を確保します。100 x g で10秒間遠心分離し、気泡を除去します。
  3. 細胞播種と湿度のセットアップ
    1. 1.5 mLの気泡のない混合物を35 mmの滅菌ペトリ皿に分注します。.湿度を維持するために、3 mLの滅菌蒸留水を皿の周辺溝に加えます(または、皿の蓋の内側に別の滅菌容器を置きます)。
    2. 加湿チャンバー(湿度95%≥)に皿を密封します。
      1. チャンバーを準備するには、蓋付きのプラスチック容器(例:15cmシャーレ)に滅菌吸収紙を2層入れます。滅菌脱イオン水10mLを加えて紙を飽和させます。染色した培養皿をチャンバーの中央に置き、皿と濡れた紙が直接接触しないようにします。蓋と容器の接合部に透明フィルムを3回巻き付けて気密シールします。または、蓋の端を実験室用テープで固定します。密閉チャンバーを37°Cで30分間インキュベートし、湿度を95%≥平衡化します。
  4. コロニーの栽培と列挙
    1. 細胞を37°Cで5%CO2 未満で16日間インキュベートします。造血コロニー(クラスターあたり≥50細胞)を倒立顕微鏡で40倍にカウントします。1 x 104 シード細胞あたりのコロニー形成単位(CFU)を計算します。

5. ミトコンドリア活動検出

  1. ローダミン123による細胞染色
    1. PBHSCを1 mLのRPMI1640培地に1 x 106 細胞/mLで再懸濁します。ローダミン123色素を最終濃度5-10 μMまで添加し、細胞を5% CO2 で37°Cで10分間インキュベートします。
    2. 細胞懸濁液を300 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を1 mLの新鮮なRPMI1640に再懸濁します。遠心分離を繰り返し、PBS1 mLに再懸濁します。
  2. 共焦点顕微鏡分析
    1. 清潔なスライドガラスを糸くずの出ない紙で拭いて、ほこりや汚染物質を取り除きます。
    2. PBSで染色されたPBHSCを適切な密度に再懸濁して、シグナルのオーバーラップを回避します。細胞懸濁液10〜20μLをピペットで取り、スライドの中央にゆっくりと分注します。
    3. カバーガラスを45°の角度で傾け、一方の端を液滴にそっと触れ、気泡を最小限に抑えるために徐々に下げます。軽く押して、細胞が単層に均一に広がることを確認します。
    4. スライドを暗闇に水平に5分間置き、セルが落ち着くまで待ちます。すぐに共焦点顕微鏡分析に進みます。
    5. 染色した細胞をスライドガラスに取り付けます。共焦点顕微鏡(ex/em:488/525 nm)を用いてミトコンドリアの分布を観察します。
  3. フローサイトメトリーの定量化
    1. フローサイトメーター(FL1チャンネル)を使用してRhodamine 123の蛍光強度を解析します。過酸化水素処理されたPBHC(1 mM、1時間)をポジティブコントロールとして使用する26。

6. PBHSCの細胞骨格染色

  1. マイクロフィラメント染色(Actin Tracker Green-488)
    1. AF488標識ファロイジン蛍光プローブをPBSに溶解し、最終濃度5 U/mLで調製します。ストック溶液(メタノールで200 U / mL)を、5 μLのストックと195 μLのPBS(1:40希釈)と混合して希釈します。均質性を確保するために、10秒間徹底的に渦巻かせます。
    2. 調製したActin Tracker Green-488ワーキング溶液200 μL(5 U/mL)をPBHSCに加え、細胞を25°Cで30分間暗所でインキュベートします。
    3. 1 mLの免疫染色洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 in PBS)で細胞を2回洗浄します。暗所で200 μLのDAPI(1 μg/mL)で核を5分間、25°Cで対比染色します。
  2. 微小管染色(Tubulin Tracker Red)
    1. PBSに溶解した赤外標識パクリタキセル蛍光プローブを最終濃度1 μMで調製し、ストック溶液(DMSOで100 μM)を990 μLのPBS(1:100希釈比)に加えて希釈します。混合物を10秒間ボルテックスして、均質性を確保し、光から保護します。
    2. Tubulin Tracker Redワーキング溶液を最終濃度250 nMの完全培地で調製します。997.5 μL培地(希釈比1:400)に2.5 μLのストックを加えて、ストック溶液(DMSOで1 mM)を希釈します。混合物を10秒間ボルテックスし、PBHSCに200μLを加え、暗所で25°Cで30分間インキュベートします。
    3. 1 mLの免疫染色洗浄バッファーで細胞を2回洗浄します。暗所で200 μLのDAPI(1 μg/mL)で核を5分間、25°Cで対比染色します。
  3. 埋込みと顕微鏡
    1. 染色した細胞をPBSで2回洗浄します。染色した細胞を90%グリセロール-PBS溶液(90%グリセロールおよび10%PBS、v / v)と1:1の容量比で混合します。混合物10μLをスライドガラスにピペットで移します。カバーガラスを45°傾け、気泡を避けるために徐々に下げます。
    2. 蛍光顕微鏡(Actin Greenは488 nm、Tubulin Redは561 nmの励起)を使用して、アクチン/微小管の形態を解析します。ポジティブコントロールを含めます:アクチン攪乱のためのサイトカラシンB処理PBHSC(5 μM、2時間)、および微小管解重合のためのコルヒチン処理PBHSC(10 μM、3時間)。

7. CPAの安全性評価

  1. 溶血検査
    1. EDTAで抗凝固した新鮮な血液を使用して2%ウサギ赤血球懸濁液を調製します。
    2. CPA(0.1-0.5 mL)と生理食塩水(2.0-2.4 mL)をガラス管内の細胞懸濁液2.5 mLに加えます。
    3. ネガティブコントロールとして生理食塩水を使用し、ポジティブコントロールとして滅菌水を使用します。37°Cで3時間インキュベートし、顕微鏡で溶血/凝固を観察します。
  2. 全身アレルギー検査
    1. 動物の調理法
      1. 4〜5週間齢のSPFハートレーモルモット36匹(50%オス、271-307 g、50%メス、270-301 g)を使用します。次のハウジング条件を維持します:温度:16-26°C(± 4°Cの日次変動)、湿度:40%-70%、換気:8-10空気交換/ h、ライトサイクル:12時間ライト/ダーク
    2. 感作フェーズ
      1. CPAを腹腔の左下象限に2 mL / kg(低)または6 mL / kg(高)で1、3、および5日目に注入します。.低用量(2mL/kg)は臨床曝露レベルをシミュレートし、高用量(6mL/kg)は、全身性アレルギー試験に関するOECDガイドライン406に従って、用量依存性過敏症を評価するための3倍の安全マージンを表しています27,28。
      2. ヒト血清アルブミン(ポジティブコントロール)と生理食塩水(ネガティブコントロール)を使用します。
    3. チャレンジフェーズ
      1. CPA を 19 日目と 26 日目に 4 mL/kg (低) または 12 mL/kg (高) で辺縁耳静脈から静脈内投与します。チャレンジ用量(2倍感作用量)は、凍結保護剤の生体適合性に関する以前の研究で検証されたように、感作前のモルモットでアナフィラキシーを誘発するための確立されたプロトコルと一致しています29。
      2. アナフィラキシー症状(呼吸困難、けいれん)を注射後1時間監視します。.
    4. 実験後の取り扱い
      1. モルモットを獣医に戻して72時間観察します。イソフルラン麻酔下で腹部大動脈放血を使用して安楽死させます。
  3. 急性全身毒性試験
    1. マウスインジェクション
      1. 50 mL / kg CPAを10匹の雄ICRマウス(32.0-37.1 g、6週齢)の尾静脈に注射します。.生理食塩水を注入したマウスをネガティブコントロールとして使用します(n = 10)。
    2. 観察プロトコル
      1. 注射後4、24、48、および72時間での生存率、毒性徴候、および体重を監視します。ハウジングの状態を維持します:温度:20-25°C(毎日±°C)、湿度:40%-70%、換気:10-20空気交換/ h。
    3. 安楽死
      1. マウスに3%イソフルランを麻酔します。腹部大動脈放血による安楽死。
  4. 血管刺激性試験
    1. ウサギの投与
      1. 6匹のオスのニュージーランドウサギ(3.65-4.36 kg、生後7-8か月)を使用します。毎週5 mL / kgのCPAを右耳の静脈に注射します(合計3回投与)。.ネガティブコントロールとして生理食塩水を左耳に注入します。
    2. 組織評価
      1. 18〜19日目に注射部位の紅斑、浮腫、または壊死を調べます。紅斑、浮腫、および壊死の重症度に基づくスコア注射部位の刺激。ISO 10993-12スコアリングシステムを、0(反応なし)から4(重度の壊死)30,31までのグレードで適用します。
    3. 実験後の取り扱い
      1. ウサギにチレタミン-ゾラゼパム(5 mg / kg、IM)で麻酔をかけます。.急速な頸動脈の瀉血を使用して安楽死させます。

8. PBHSC移植

  1. 患者の登録と動員
    1. 移植基準を満たす6人の患者を登録します:単核細胞≥ 5 x 108 細胞/ kg
      CD34+ 細胞 ≥ 2 x 106 細胞/kg23.<18歳または>65歳の患者、活動性感染症、重度の臓器機能障害、妊娠/授乳、最近の免疫抑制療法(4週間以内)、または制御されていない精神障害のある患者を除外します。.
    2. 顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)を使用して、造血幹細胞を骨髄から末梢血に動員します。造血幹細胞を骨髄から末梢血まで動員し、顆粒球コロニー刺激因子を毎日10μg/kg(正確な用量は人によって異なります)の用量で5日間連続して皮下投与します。
  2. PBHSCの収集と凍結保存
    1. 血流速度を40 mL/minに設定し、抗凝固剤と全血の比率を1:12に設定したアフェレーシスデバイスを使用して、動員されたPBHSCを収集します。セッションごとに15〜16 Lの全血を処理して、180〜200 mLのPBHSC濃縮物を取得します。サンプルを2つのアリコートに分けると、各小袋の容量は90〜100mLになります。
    2. 臨床輸血のために、最初のアリコートを10%ジメチルスルホキシド(DMSO)と5%ヒト血清アルブミンに再懸濁します。.再懸濁したアリコートを、-1°C/分から-80°Cの冷却速度でプログラム可能な凍結容器に入れます。 クライオバッグに患者IDと凍結パラメータ(バッチ番号、日付など)をラベル付けします。生存率試験のために、5% DMSO および 10% ウシ胎児血清で 2 番目のアリコートを調製します。
  3. 解凍と再注入
    1. 凍結保存されたPBHSCを37°Cのウォーターバスで解凍します(≤2分間)。融解した細胞は、化学療法/放射線療法のコンディショニング後に静脈内投与します。融解後30分以内に、シリンジポンプを使用して中心静脈カテーテルを介して細胞を静脈内投与します 3〜5mL/分。
  4. 移植後のモニタリング
    1. 毎日の血球数による造血回復の追跡: 好中球成功閾値: ≥ 0.5 x 109 細胞/L;血小板成功閾値: ≥ 20 x 109 細胞/L32。
    2. リンパ球サブセット解析による免疫再構成のモニタリング。EDTAチューブに5mLの末梢血サンプルを採取します。CD3、CD4、CD8、CD19、およびCD56に対する蛍光抗体で細胞を暗所で15分間染色します。フローサイトメーターと標準化されたゲーティング戦略を使用してリンパ球サブセットを解析します。絶対数(細胞数/μL)を年齢が一致した健康な参照範囲と比較し、解釈します。

9. PBHSCの亜集団分析

  1. 抗体染色
    1. 凍結PBHC(CPA/TCPAグループ)を調製し、37°Cの水浴で解凍します。
    2. 蛍光抗体による細胞の標識:CLP:CD45-CD34+CD10+(クローンHI30+4H11+HI10a);MEP:CD45-CD38 + CD135-CD45RA-(クローンHIT2 + 4G8 + 5F3 + HI100);GMP:CD45-CD38 + CD135 + CD45RA +(図1)。PBHSCを300 x g で5分間遠心分離して解凍し、凍結保存剤を除去します。細胞濃度を 2% ウシ胎児血清を含む PBS 中の 1 x 106 細胞/mL に調整します。
    3. CLP用のクローンHI30/4H11/HI10aおよびMEP/GMP用のHIT2/4G8/5F3/HI100を用いて、メーカー推奨の力価で抗体カクテルを調製します。抗体混合物と細胞を抗体混合物と30分間、暗所4°Cで10分ごとに穏やかにボルテックスしながらインキュベートします。染色した細胞を冷PBS+0.1%アジ化ナトリウムで200 x gの遠心分離により3分間2回洗浄します。フローサイトメトリー解析の前に、細胞を500 μLのPBSに1 μg/mL DAPIで再懸濁し、生存率ゲーティングを行います。
    4. 暗所で4°Cで30分間インキュベートします。1% BSAを含むPBSで2回洗浄します。
  2. フローサイトメトリーのセットアップ
    1. 染色した細胞を500 μLのPBSに再懸濁します。フローサイトメーターを使用したサブポピュレーションの解析:レーザー(488 nm、640 nm)とフィルター(FITC、PE、APC)を設定します。サンプルごとに ≥ 10,000 個のイベントを収集します。
    2. 前方散乱/側方散乱光と蛍光強度に基づくゲート集団(図1)。
  3. データの比較
    1. FlowJo v10.8ソフトウェアを使用してCLP/MEP/GMPの割合を計算します。スチューデントのt検定を使用して、CPAグループとTCPAグループを比較します(α = 0.05)。Prism 9.0(SEM付き棒グラフ)33を使用して差分を視覚化します。

10. 統計解析

  1. t 検定を使用して、カイ 2 乗分散を持つ正規分布に適合した連続数値変数の平均を比較し、正規分布に適合しなかった連続数値変数の平均をノンパラメトリックに検定します。
  2. 連続変数のデータを平均±標準偏差、または中央値と上位四分位数と下位四分位数としてレポートします。フィッシャーの正確確率検定を使用して、2つのグループ間の率を比較します。
  3. SPSS 26.0およびGraphPad Prism 9ソフトウェアを使用してデータを解析し、プロットします。両側検定のすべての差を考慮し、p が 0.05 の場合、統計的に有意<。データの一部は、統計的な記述の形で提示されます。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ワンステップ凍結保存法と液体窒素凍結保存法の比較
回収後の凍結保存されたPBHSCの生存率は、AO/PIアッセイを使用して評価されました。 図2Aに示すように、CPAを用いて-80°Cで凍結保存したPBHSCの生存率は91.29%(n = 3、SD = 1.86)であったのに対し、液体窒素中に保存したPBHSCの生存率は90.07%(n = 3、SD = 1.64)でした。統計解析では、2つの方法の間に有意差は示されませんでした(p > 0.05)。しかし、ワンステップの凍結保存法の方が迅速で便利であることが証明されました。これらの結果は、ワンステップ凍結保存法が細胞保存の優れた代替手段であることを示唆しています。

CPAのPBHSCに対する凍結保存効果は、従来の凍結保存法を凌駕
回収後に凍結保存されたPBHSCの細胞生存率は、AO/PIおよびAnnexin V/PIアッセイによって検出されました。 図2に示すように、CPAで保存された回収された6つのPBHSCサンプルの細胞生存率は、これら2つのアッセイでそれぞれ89.38%(n = 6、SD = 1.87、 図2B)および88.20%(n = 6、SD = 2.72、 図2C)に達しました。しかし、TCPAによって保持されたものは、79.55%(n = 6、SD = 3.16、 図2B)と73.05%(n = 6、SD = 7.47、 図2C)でした。これらの知見は、CPAがTCPAと比較してPBHSCに対してより効果的な凍結保護剤であり、細胞生存率と回収率のより良い保存につながることを示唆しています。

CPAで保存されたPBHSCは、完全な細胞骨格構造とミトコンドリア活性を維持します
細胞骨格の狭義の定義は、真核細胞34におけるタンパク質繊維、微小管(MT)、マイクロフィラメント(MF)、および中間フィラメント(IF)のネットワークを指す。本研究では、PBHSCの凍結保存後のMTとMFの構造的完全性を主に検討し、CPAの凍結保存後もPBHSCが細胞骨格の完全性を維持できることを証明した。生細胞のマイクロフィラメントおよび微小管構造を標識するために、Alexa Fluor 488蛍光色素標識ゴーストペン環状ペプチドおよび遠赤外蛍光基標識タキソールアナログをそれぞれ蛍光プローブとして使用しました。 図3A、Bに示すように、CPAによって保存されたPBHSCは、無傷のマイクロフィラメントおよび微小管構造を維持しています。

CPAによって保存されたPBHSCのミトコンドリアをローダミン123色素溶液で標識し、H2O2で処理したPBHSCをポジティブコントロールとして使用した。結果(図3C)は、ミトコンドリア構造がCPA保存細胞で観察されたのに対し、陽性対照群では観察されなかったことを示しました。ローダミン123標識ミトコンドリアもフローサイトメトリーによって検出されました。CPAで保存されたPBHSCは、従来の方法よりも優れたミトコンドリア活性を維持していることがわかりました(図4)。

CPAで保存されたPBHSCは、クローンを形成する能力を維持します
さらに、コロニー形成アッセイを実施することにより、CPAおよびTCPAで保存されたPBHSCの増殖能力と分化能力を評価しました。具体的には、PBHSCが培養中にBFU-E、CFU-E、CFU-GM、およびCFU-GEMMコロニーを形成する能力を評価しました。新鮮細胞群で観察されたコロニーの総数は70.33(n = 6、SD = 14.02)でした。対照的に、CPAグループは合計65.33コロニー(n = 6、SD = 8.07)を示したのに対し、TCPAグループは46.17コロニー(n = 6、SD = 8.50)と大幅に減少しました。これらの結果は、CPAで保存されたPBHSCが、さまざまな細胞系統でコロニー形成の数が同程度であることからも明らかなように、新鮮細胞制御と比較して増殖能力と分化能力を維持したことを示しています。対照的に、TCPAで保存されたPBHSCは、増殖および分化能の低下を示しました。これらの知見は、CPAで凍結保存されたPBHSCは、その機能的能力をよりよく保持することを示しています(図5 および 図6)。

in vitroでのCPAの安全性評価
ウサギ赤血球溶血のin vitroモニタリングを行った。溶血に対するさまざまな容量のCPA(0.1〜0.5 mLの範囲)と生理食塩水(2.0〜2.4 mLの範囲)の影響をテストするために、2.5 mLの2%ウサギRBC懸濁液をCPAまたは生理食塩水とともにガラス試験管に追加しました。陰性対照(注射用滅菌水)および陽性対照(正常生理食塩水)も含まれていた。CPAまたは生理食塩水を含むチューブでは、赤血球はチューブの底に沈殿し、上部の溶液は無色透明でした。振とうした後、赤血球は均一に分散した。陽性対照群(滅菌水)は明るい赤色を示し、層別化は観察されず、チューブの底に少量のRBCが残っているだけでした(図7)。これらの結果から、CPAはウサギ赤血球の溶血や縮重を引き起こさないことが示唆されています。CPAの血管刺激性は、ニュージーランドのウサギで評価されました。病理切片をヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色で染色し、最終投与後に一般的な臨床的および局所刺激性の観察を行った。実験動物に異常反応は認められず、局所投与部位に病理学的変化は認められなかった。これらの知見は、CPAがニュージーランドのウサギに血管刺激を引き起こさないことを示しています。

モルモットの活動性全身性過敏症の実験では、CPAを使用して、1.25 mL / kgおよび2.5 mL / kgの腹腔内注射を3回、興奮のために2.5 mL / kgおよび5 mL / kgの静脈内注射で動物を感作しました。.モルモットでは、最後の感作から21日後まで急速な過敏症は観察されず、CPAがモルモットに急速なアナフィラキシーを引き起こさないことを示しています(表2)。.

急性全身毒性をICRマウスで評価しました。5匹の実験マウスと5匹の対照マウスに、CPAと生理食塩水を50mL/kg体重で注射しました。実験群の反応は対照群の反応よりも大きくありませんでした。発作やうつ伏せの寝たきりはいずれの群でも観察されず、その他の異常な症状も観察されませんでした。さらに、どちらのグループでも有意な体重減少はありませんでした。これらの結果は、CPAがICRマウスに対して急性全身毒性を示さないことを示唆しています(表3 および 表4)。

CPAで保存されたPBHSCの自己移植の評価
CPAで保存されたPBHSCを血液疾患の治療に移植した場合の有効性を評価するために、6人の患者を募集し、CPAで保存したPBHSCを5人の患者に移植しました。移植は、疾患の再発により別の同種移植を受けた1人の患者を除くすべての患者で成功しました。好中球数 ≥ 0.5 x 109 細胞/L および血小板数 ≥ 20 x 109 細胞/L を移植成功のマーカーとして使用しました。

サンプルb、c、eを対応するリンパ腫患者に移植し、機能再建サイクルはそれぞれ9日、9日、10日でした。サンプルaとfは急性骨髄性白血病の患者に移植され、機能再建サイクルはそれぞれ36日と16日でした。サンプルdの患者は、疾患の再発のために他の治療を受けました。36日周期の感染により造血および免疫再構成が阻害されたデータを除くと、5例の平均移植成功期間は11日で、好中球数と血小板数の両方が必要な基準を満たしていました。この期間は、以前の文献で報告された12.5日間の造血再構成サイクルよりも短い19。私たちの研究では、同様の再構成期間の下で、CPA製剤中のDMSOの最終濃度はわずか2%であり、通常引用される3.5%の濃度20よりも著しく低かった。さらに重要なことに、患者に副作用は観察されず、臨床応用における造血幹細胞保存法の安全性と有効性がさらに確認されました(表5)。

PBHSCの亜集団解析により、CPAで保存されたPBHSCにおける共通リンパ系前駆細胞(CLP)および巨核球/赤血球前駆細胞(MEP)の細胞亜集団は、従来のレジメンよりも高かったことが明らかになった。しかし、顆粒球/マクロファージ前駆細胞(GMP)の細胞亜集団は有意差はありませんでした。これらの知見は、治療を受けた患者で観察された造血および免疫の再構成が速いことを説明できる可能性があります(図8A-C)。

figure-results-1
図1:造血階層のモデル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:PBHSCsの細胞生存率 (A) CPAを用いたワンステップ法で保存されたPBHSCの生存率は91.29%(SD=1.86)、液体窒素法で保存されたPBHSCは90.07%(SD=1.64)、p > 0.05でした。(B)CPAで保存したPBHSCの回収率は89.38%(n = 6、SD = 1.87)で、AO/PI検出で測定したTCPAで保存したPBHSCの回収率79.55%(n = 6、SD = 3.16)よりも有意に高かった。(C)CPAで保存されたPBHSCの回復生存率は88.20%(n = 6、SD = 2.72)であり、これは、回復後のAnnexin V / PI検出で測定したTCPAで保存されたPBHSCの73.05%(n = 6、SD = 7.47)の回復生存率よりも有意に高かった。CPAおよびTCPAに関するP<0.01(T検定)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:CPAおよびTCPAによって保存されたPBHSCの構造解析。 (A)Alexa Fluor 488蛍光色素標識ゴーストペンサイクリックペプチドによって可視化された、新鮮細胞群、CPA群、TCPA群、およびポジティブコントロール群を含むPBHSCのマイクロフィラメント構造。(B)新鮮細胞群、CPA群、TCPA群、ポジティブコントロール群を含むPBHSCの微小管構造を、遠赤外蛍光基標識タキソールアナログで可視化。(C)ローダミン123で標識したPBHSC(フレッシュセルグループ、CPAグループ、TCPAグループ、ポジティブコントロールグループを含む)のミトコンドリア活性をフローサイトメトリーにより検出した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:CPAおよびTCPAによって保存されたPBHSCの機能分析。 フローサイトメトリーによって検出された、フレッシュ細胞群、CPA群、TCPA群、ポジティブコントロール群などのPBHSCのミトコンドリア活性。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:コロニー形成電位試験。 CPA、TCPA(CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-GEMMMを含む)で保存されたPBHSCのコロニー形成可能性を、新鮮なPBHSCと比較して。 この 図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

figure-results-6
図6:コロニーの総数。 新鮮細胞群の総コロニー数は70.33(n=6、SD=14.02)、CPA群の総コロニー数は65.33(n=6、SD=8.07)、TCPA群の総コロニー数は46.17(n=6、SD=8.50)であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-7
図7:動物試験によるCPAの安全性評価。 10倍の解像度で撮影した代表的な画像をA1-B2に示します。(A、B)ニュージーランドウサギにおけるCPAの血管刺激性の評価。A1 と B1 は、それぞれ最後の投与から 72 時間後と 14 日後に作成された陰性対照群の病理組織切片図でした。A2 と B2 は、それぞれ最後の投与から 72 時間後と 14 日後に作成された CPA グループの病理組織切片図でした。(C)ウサギ赤血球溶血の in vitro モニタリング。a〜eとラベル付けされたチューブはCPAグループを表し、fとラベル付けされたチューブは陰性対照群、gとラベルされたチューブはポジティブコントロールグループでした。CPA群と陰性対照群では溶血は起こらなかったが、陽性対照群では溶血が起こった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-8
図8:CPAおよびTCPAで保存された6人の患者からのPBHSC亜集団の分析(A)CLP、(B)MEP、および(C)。(A)CPAとTCPAの平均CLP比は16.38%(n = 6、SD = 13.53)および8.97%(n = 6、SD = 7.88)であり、CPAで凍結されたPBHSCのCLPの亜集団はTCPAのそれよりも高かった。CPAおよびTCPAに関してp>0.05(T検定)。(B)CPAとTCPAの平均MEP比率は61.07%(n = 6、SD = 12.85)および55.4%(n = 6、SD = 11.37)であり、CPAで凍結されたPBHSCのMEPの亜集団はTCPAのそれよりも高かった。CPAおよびTCPAに関してp>0.05(T検定)。(C)CPAとTCPAの平均GMP比は62.68%(n = 6、SD = 8.20)および64.70%(n = 6、SD = 11.66)であり、CPAで凍結されたPBHSCのGMPの亜集団はTCPAのそれよりも高かった。CPAおよびTCPAに関してp>0.05(T検定)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

CPAのコンポーネント濃度比TCPA のコンポーネント濃度比
ジメチルスルホキシド4% (v/v)ジメチルスルホキシド10%(V/V)
ヒトアルブミン5% (m/v)ヒトアルブミン5% (m/v)
グルコース2% (m/v)--
デキストラン402% (m/v)--
グリセロリン酸ナトリウム0.5%(m/v)--

表1:CPAとTCPAの成分と濃度比。

群動物番号さまざまな程度の過敏症を持つ動物の数
－弱ポジティブ＋ストロングポジティブ非常に強いポジティブ
ネガティブコントロール880000
ポジティブコントロール800053
CPA低用量880000
CPA高用量880000

表2:CPAによる治療後のモルモットにおける過敏反応。. 陰性対照群、CPA低用量群、CPA高用量群はすべて陰性の過敏反応を示しました。対照的に、陽性対照群のすべてのモルモットは強い陽性過敏反応を示し、3匹のモルモットがアナフィラキシーを経験しました。

群ナンバリング投与量(mL)重さ(g)
0時間24時間48時間72時間
ネガティブコントロール11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
実験群21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

表3:急性毒性実験におけるマウス体重の要約。 ネガティブコントロール群と実験グループは、薬物投与後に有意な体重減少を示さなかった。すべての実験動物の体重は、投与後24時間、48時間、および72時間にわたって従来の給餌後、妥当な範囲で徐々に増加しました。

群ナンバリング投与量(mL)観測時間
4時間24時間48時間72時間
ネガティブコントロール11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
実験群21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

表4:マウスにおける急性全身毒性の観察。 この表では、-は急性全身毒性反応がないことを意味します。.ネガティブコントロールグループと実験グループは、投与後4時間、24時間、48時間、および72時間投与後に急性全身毒性反応を示しませんでした。.

患者の特性私たちの研究文献で報告されています
N652
年齢53 (35-61)55 (21-66)
ミリメートル024
HLの223
AMLの20
CGHL/NHLの10
PMBL/NHLの10
その他の疾患の種類05
放射線治療ベース234
化学療法ベース318
いいえ。CD34+細胞(106 /kg)を移植4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0.5×109 /L 回復 (中央値、日、範囲、異常データは除外)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L 回復 (中央値、日中、範囲、異常データは除く)11 (9-16)12.5 (0-19)
吐き気がします015
嘔吐04
目まいがします01
どんな合併症でも020

表5:HSCTデータ統計。 ASCT後の患者の特性と造血回復。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、PBHSCの凍結保存のための新しいCPAを評価した。この結果は、CPAがTCPAと比較してPBHSCの保存生存率を向上させることを示しています。具体的には、CPAで保存されたPBHSCの回復生存率は、TCPAの回復生存率を10%以上上回った。幹細胞では、細胞骨格の完全性は、幹細胞35,36の活性および分化機能の維持のための基本的な要件である。細胞レベルでは、CPAで保存されたPBHSCのマイクロフィラメントと微小管の構造は、TCPAグループよりも無傷であり、特に微小管の構造が明確であることが観察されました。ミトコンドリアは細胞のエネルギー工場です。ミトコンドリアは、細胞の呼吸、代謝、およびその他の生命活動に直接関与しており、これらは細胞活動を維持するために不可欠な細胞小器官である37。ミトコンドリアの活性は、凍結保存および回収後の造血幹細胞の機能の重要な指標です。ミトコンドリア活性に関しては、CPAグループは新鮮なPBHSCと類似性を示し、ミトコンドリア複合体を直接観察すると、CPAグループでのミトコンドリア数がTCPAグループを上回っていることが明らかになりました。さらに、フローサイトメトリーを利用して、各グループで保存されたミトコンドリア活性を定量的に評価しました。その結果、CPA群とフレッシュ細胞群との間に有意差は見られませんでしたが、CPA群ではTCPA群と比較して活性が8.5%高かった。このミトコンドリア活性データの比較は、細胞回収生存率の所見を裏付けています。さらに、コロニー形成アッセイでは、CPAで保存されたPBHSCが分化能を保持していることが示されました。CPAグループは、導入後により多くのコロニーを示し、CPAの優れた保存効果をさらに実証しました。

この研究の目標は、CPAを臨床HSCTに適用して、保存後のPBHSCの活性を改善し、移植の成功率を確保することでした。CPAを臨床試験に適用する前に、実験動物で安全性評価が行われており、臨床応用におけるCPAの安全性をデータで裏付けています。以前の研究では、いくつかの新しいCPAが内皮細胞(MHECT-5)および胚38,39の最良の凍結保存技術として特定されていることが示されています。CPAのPBHSC保存への臨床応用では、6人の患者様のPBHSCをHSCTで凍結保存することに成功しました。特に、CPAを使用したワンステップ凍結保存法により、サンプル保存プロセスが大幅に合理化されました。この方法は、以前に報告された造血幹細胞のワンステップ凍結保存技術と比較して、低濃度のDMSOを利用しており、これは臨床応用にとって大きな進歩です。6人の患者のうち、5人が移植を成功裏に受けました。残りの患者は、病気の再発により代替治療を受けました。移植を完了した5人の患者について、機能再建サイクルの統計的評価を行った。感染により再建周期が延長された1例を除けば、造血機能と免疫機能の再構成に要する平均時間は11日で、先行文献で引用された12.5日よりも早い。重要なことに、移植プロセス中に毒性は観察されませんでした。この結果は、TCPA法で使用された10%(v / v)濃度と比較して、CPA法でのDMSOの最終濃度がわずか2%であったことを考えると、特に注目に値します。CPAにおける低濃度のDMSOをうまく利用して副作用を最小限に抑えることは、当社の戦略を実証し、臨床効果に不可欠です。

私たちの研究で観察された迅速な機能再構成に照らして、輸血されたCD34+細胞の数の潜在的な違いをさらに調査しました。統計解析により、輸血されたCD34+細胞の数は、平均して2.4×106 細胞/kgであり、これは以前の文献で報告された数値よりも低いことが明らかになった40。これにより、CPAは、造血および免疫の再構成に重要なPBHSC内の特定の亜集団に対して優れた保護を提供する可能性があるという仮説を立てました。この仮説を探るために、CPAとTCPAの両方で保存されたPBHSCにおけるCLP、GMP、およびMEPの亜集団の詳細な分析を行いました。その結果、CPAで保存されたPBHSCのCLPとMEPの亜集団は、TCPAで保存されたものと比較して増加したが、GMPの亜集団には有意差がなかった。CLPは、人体内でT細胞、B細胞、NK細胞に分化することができます。CLPの用量を増やすと、免疫再構成が促進される可能性があります33。MEPは赤血球と血小板に分化することができる41。CPA中のグリセロリン酸ナトリウムは、グリセロリン酸シャトルを介してミトコンドリアATP合成を促進し、凍結保存によって引き起こされるエネルギー不足に対処します。これは、リンパ系の分化を解糖系に依存しているCLP細胞にとって重要である42。さらに、TCPA生存率の高い標準偏差はCPAの標準偏差よりも高く(7.47対2.72、 図3)、TCPAの結果のばらつきを示しており、これは不安定な凍結条件によるものである可能性があります。したがって、CLPとMEPの保存強化は、造血および免疫機能の回復時間を短縮する重要な要因である可能性があると提案します。CLPおよびMEPサブグループに対するCPAの優れた保護効果は、臨床輸血療法中の機能再建をより迅速に促進するようです。これにより、治療結果が向上するだけでなく、移植を受ける患者の治療期間と費用も削減されます。本質的に、私たちの方法はHSCTに対してより経済的なアプローチを提供し、患者ケアの臨床的側面と経済的側面の両方を最適化します。

DMSOに代わる可能性のある物質を特定するための継続的な研究努力にもかかわらず、代替品の探求は依然として困難です。この分野では新しい技術や物質が出現しているという報告がありますが、これらの新しい化合物の厳密なin vitro安全性の実証はまだ不足しています。同様に、特に不純物の研究に関して、臨床使用に対する安全性と有効性を確認するためのエビデンスは不十分です。したがって、これらの新しい物質は、臨床現場に適用する前に広範な検証が必要です。この文脈において、DMSOの使用を最適化しながら、効果的な細胞保存を確保することが、臨床応用のための最も実行可能な戦略であり続けると考えています。以前の研究では、細胞内のATP産生とミトコンドリア活性調節におけるグリセロリン酸シャトルの役割が強調されています45,46。この理解に基づいて、グリセロリン酸ナトリウムをCPAに組み込むことは、浸透圧保護剤としてTCPAで伝統的に使用されていたDMSOのかなりの部分を置き換える効果的な戦略として役立つ可能性があることを提案します。低ジメチルスルホキシドの代替品に関する最近の研究については言及されておらず、この方法にはいくつかの新規性があることが示唆されています。

全体として、当社の凍結保存プロトコルにおける重要なステップには、(i)2%(v/v)での正確なDMSO濃度制御、(ii)-1°C/minの制御された冷却速度、および(iii)37°Cのウォーターバスでの急速な融解が含まれます。これらのステップにより、浸透圧応力と氷の結晶形成が最小限に抑えられます。特に、DMSO濃度の低下は、従来の10%DMSO溶液47に関連する細胞毒性の懸念に直接対処します。制御された冷却は、間葉系幹細胞凍結保存48で検証されたように、細胞内氷の損傷を防ぎ、急速な融解は、融解後の生存率49の重要な要素であるミトコンドリア機能を維持する。3つの側面を最適化しました:(i)混合方法:最初の試験では、CPA添加中に細胞凝集が明らかになりました。500 rpmでのボルテックスによるドロップワイズミキシングに切り替えると、凝集がなくなりました。(ii)染色プロトコル:0.05%のTween-20を含むPBSで細胞を事前に洗浄すると、抗体の浸透効率が18%向上しました。(iii)融解の一貫性:標準化された120秒の融解ウィンドウを実装することで、回収率のばらつきが防止されました(パイロット研究では±2%に対して±7%)。コロニー数が少ないなどの一般的な問題については、MethoCultの培地容量を2 mL/皿に増やし、湿度制御(>95%)することでこの問題を解決し、造血前駆細胞培養標準50に合わせました。(i)亜集団バイアス:CPAはCLPおよびMEPサブセットを効果的に保存する一方で、CD34+CD38-CD90+長期造血幹細胞のような稀な集団は、新規対照と比較して回復率が12%低いことを示しています（p = 0.03)。(ii)定性的画像に基づく細胞骨格の完全性の評価のためには、いくつかの定量的指標(例えば、蛍光強度、構造スコア)をより信頼性の高い分析に組み込むべきである。私たちのCPA法は、(i)安全性の向上:融解率が融解後24時間で8.2%(TCPA)から1.5%(CPA)に減少しました（p < 0.001)〕。(ii)機能的優位性:CPAで保存された細胞は、TCPAと比較してCFU-GEMMコロニー形成が23%高く、これは多系統の生着に不可欠でした51。(iii)臨床効率:2.4 x 106 CD34+細胞/kg(文献標準≥ 4 x 106と比較して)での移植成功は、効力の向上を示唆しています。この技術は、(i)遺伝子改変HSCの保存:CPAのミトコンドリア保護は、凍結保存中にCRISPR編集細胞を安定化させる可能性があります52。(ii)オルガノイドバンキング:予備データでは、CPAで保存された腸オルガノイドで89%の生存率が示されているのに対し、TCPAでは54%(n = 3)です。(iii)グローバルな流通ネットワーク:DMSO含有量が少ないため、相変化材料53を使用した常温輸送試験が可能になります。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての著者は、この研究が潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、南山区医療重点規律建設財政支援プロジェクト、深セン南山区保健システム科学技術大プロジェクト(No.NSZD2023018)、およびNHC核技術医療変革の主要研究所(綿陽中央病院;Grant No.2023HYX033)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
35 - mm細胞培養ディッシュLABSELECT12111
アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウムCountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
アネキシン V-FITCBD556420
卓上型自動イメージサイトメーターCountstarRigel-S2
Cell Preservation Solution XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
YB020050 YB020100 ColchicineBeijing Biolab Technology Co., Ltd. (コルヒチン 北京バイオラボ テクノロジー コピBP0857
共焦点レーザー走査型顕微鏡ZeissLSM880
Cytochalasin BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
DAPI染色キット北京バイオラボテクノロジー株式会社HR0453
DMSO PanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
フローサイトメーターBDFACSLSRFortessa
グリセロール  AMRESCO854
ヒトアルブミンSenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
過酸化水素Sigma-AldrichH1009
免疫染色洗浄バッファーBeijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
倒立顕微鏡ニコン株式会社ECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBS Gibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
生理食塩水北京バイオラボテクノロジー株式会社GL1735
ヨウ化プロピジウムBDBDB556463
ローダミン 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィック371
ボルテックスミキサー南京湖川電子有限公司DMT-201ZTの
)

参考文献

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