方法論記事

大腸菌BL21株における特異的外因性DNAに対する青色光誘導性半ランダム変異導入

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DOI：

10.3791/68283

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2025年6月20日

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

この記事について

サマリー

概説されたプロトコルは、大腸菌のそれらの外因性DNAにのみ突然変異を生成しながら、任意の外因性DNAを認識するための合理化された方法を説明しています。

要約

突然変異導入技術は、変異育種、指向性進化、およびタンパク質工学に広く使用されています。しかし、ほとんどの方法では、制御不能なランダムなゲノムDNA変異を誘発することしかできず、変形や致命的な影響さえも引き起こします。ここでは、シトシンベースエディター(CBE)、青色光誘導性p-Mag/n-Magエレメント、スプリットT7 RNAポリメラーゼの3つのシステムの融合を活用することにより、この概説された方法には、青色光制御可能なDNA領域特異的な半ランダム突然変異導入システムが組み込まれています。

このシステムは、T7プロモーターから始まり、T7ターミネーターで終わるDNA上のシトシンをチミンに変異させることができます。T7プロモーターの下流にある任意の外因性遺伝子は、潜在的に変異する可能性があります。これらのツールも、システムをブルーライトで制御可能にするために 2 つの部分から設計されています。最初の部分は、CBEとn-MagおよびN末端T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を融合させることによって作成されました。2番目の部分では、p-MagとC末端T7 RNAポリメラーゼを融合しました。青色光の下では、これら2つの部品は、T7プロモーターとT7ターミネーターの間のDNA上の突然変異ジェネレーターとして機能するように組み立てられました。青色光がない場合、p-Magはn-Magから切り離され、CBEはDNAの編集から解放されます。

このプロトコルの目的は、青色光制御により 大腸菌 に領域特異的なランダム変異を生成し、変異したプラスミドをさらに検証することです。このシステムは、目的の遺伝子の機能を選択でき、目的の突然変異をさらなる研究のために収集できる in vivo 進化システムに適合させることができます。

概要

ランダムな突然変異と自然淘汰は、進化を推進する主要な力であり、それが種間で大きな遺伝的多様性を生み出しています。この進化の過程は、最適化された機能や新規な機能を持つタンパク質を設計するための強力なツールとして利用されてきました1。DNA複製による自然突然変異率は、複数の原核生物および真核生物2の細胞分裂ごとに約10〜9塩基であると推定されています。自然突然変異率が低いため、実験室で大きな遺伝的多様性を生み出すことは現実的ではありません。研究は、妥当な時間内に特定の遺伝子のできるだけ多くの部位をカバーするために突然変異率を高める方法の開発に焦点を当ててきました。

実験室での進化研究において、より高い突然変異率を達成するために、複数のシステムが開発されてきた3,4,5,6,7,8,9,10。In vitro evolutionシステムは、エラーが発生しやすいPCR、部位特異的飽和突然変異誘発、または計算ライブラリデザインを活用して、目的の遺伝子に突然変異を導入します1。DNAライブラリーは宿主細胞に形質転換され、タンパク質産物がスクリーニングまたは選択されます。in vitro進化における突然変異誘発と選択のステップは結合されていないため、生成できる集団の効率と規模が制限されます11。In vivo進化システムは、突然変異システムを細胞に導入し、突然変異誘発と選択ステップを組み合わせて継続的な進化を可能にすることで、この制限を克服しました。初期のin vivo突然変異導入法では、化学変異原3,4および変異株5,6が用いられていました。しかし、これらの方法は、突然変異率が低く、制御が不十分で、突然変異スペクトルが狭く、または不均一であるという問題があります12。最近の研究では、直交エラーが発生しやすいDNA複製システムであるOrthoRepに代表される、新しく改良されたin vivo進化システムが開発されました7,8。MutaT7は、シチジンデアミナーゼとT7 RNAポリメラーゼ9の融合体です。EvolvRは、ニッカーゼCas9とエラーが発生しやすいDNAポリメラーゼ10の融合体です。これらの方法は、異なるホストセル、ターゲットコンテキスト、および実装の容易さを備えています。

T7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)は、MutaT7システムの主要コンポーネントであり、合成生物学の分野で広く研究され、操作されてきました。T7 RNAPのフラグメントは、リソースアロケータ13を構築するために、異なる時点で異なるレベルで共発現されている。プロモーター特異性の異なるC末端フラグメントを持つスプリットT7 RNAPが構築され、ANDロジックゲート14が作成されました。T7 RNAPフラグメントが集合して機能的ポリメラーゼを再構成する能力は、T7 RNAPのN末端とC末端のそれぞれに融合した相互作用パートナーの二量体化が転写出力を生成する、光および低分子活性化バイオセンサーの開発につながった15。また、分裂したT7 RNAは、n-Magおよびp-Magドメインに融合し、 大腸菌16の光誘導性遺伝子発現制御を構築しています。青色光が活性化すると、Magnetドメインが二量体化し、分裂したT7 RNAPの2つのドメインが空間的に接近してポリメラーゼ機能を実行します。このシステムは、低い基礎発現と広いダイナミックレンジで遺伝子発現の精密な時空間制御を可能にします。

この論文では、青色光制御可能な in vivoのセミランダム突然変異導入システムを構築するためのプロトコルを紹介します(図1)。これは、n-Mag-N-T7 RNAに融合したrAPOBEC1デアミナーゼ上に構築されています。同じプラスミドからのp-Mag-C-T7 RNAの共発現により、ポリメラーゼの青色光制御と塩基編集活性が可能になります。このシステムは、rAPOBEC1の塩基編集能力と光制御されたスプリットT7 RNAPを組み合わせたものです。これは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を標的遺伝子として使用し、その強度が蛍光活性化細胞選別(FACS)によって選択される大 腸菌 で検証されています。従来のMutaT7システムと比較して、当社のブルーライト制御システムは、光間隔を調節することにより、標的遺伝子に半ランダムな変異を導入します。標的遺伝子のすべてのシトシンをウラシル塩基に変換する代わりに、光制御によってヌクレオチドのサブセットを編集することにより、より大きな突然変異プロファイルを生成します。このシステムは、GFPを他の目的の遺伝子に置き換えることができ、細胞の適応度または生存によって機能を選択できる in vivo 進化システムに容易に適合させることができます。

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プロトコル

以下のプロトコールは、CBE-Mag-T7ポリメラーゼ突然変異導入システム(ステップ1)を使用して外因性DNA突然変異導入設計を行う方法を概説しています。外因性DNAプラスミドが構築されると、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加し、続いて突然変異誘発を開始する青色光を照射することにより、 大腸菌 BL21株でCBE-Mag-T7ポリメラーゼ変異導入を発現するための2つのプラスミドの形質転換のステップが説明されています(ステップ2-9.2)。GFPまたは外因性DNAのいずれかで生成された変異の数を評価するための品質管理ステップは、サンガーシーケンシングを使用して実行されました(ステップ9.3-11.2)。

1. 外因性DNAの設計とCBE-Mag-T7ポリメラーゼ突然変異導入システムの構築

  1. オンラインツール(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene または https://www.uniprot.org/)を使用して、外因性DNAまたはcDNAシーケンシングを見つけます。
    注:ここでは、GFP配列をシトシン突然変異誘発のための外因性DNAとして使用しました。
  2. 適切なクローニングキットを使用して、 gfp DNAを目的のDNAに置き換えてください。
    注:DNAコロニーアセンブリキットの元のプラスミド中の gfp DNAを除去するためにNheIを使用します。別の方法は、DNA合成のために企業と協力することです。プラスミド配列については 、補足ファイル1 を参照してください。
  3. すべての遺伝子をCBE-Mag-T7ポリメラーゼ突然変異導入システムと一緒に合成し、アンピシリン耐性を持つpET-11a骨格に組み込みます。
    注:DNA合成会社と協力してこのプラスミドを作製し、ターゲットプラスミドを含むグリセロールストック細菌を入手しました。

2. 細菌株の活性化

  1. 10 μLのグリセロールストックバクテリアを、100 μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレートの端にピペットで移します。滅菌ループを使用して、この場所からプレート全体に細菌を縞模様にします。
  2. プレートを逆さまにして37°Cで一晩、バクテリアインキュベーターでインキュベートします。

3. プラスミド増幅

  1. プレートから1つのコロニーを選び、100 μg/mLのアンピシリンを含む15 mLのLB培地を50 mLのコニカルチューブに接種します。
  2. 培養物を37°C、180rpmの振とうインキュベーターに14〜16時間置きます。

4. プラスミド抽出

  1. 5〜15 mLの一晩の細菌培養物を取り、遠心分離管に移します。18,894 × g で1分間遠心分離します。
  2. バクテリアペレットを収集し、すべての上清を慎重に取り除きます。ボルテックスまたはピペッティングにより、細菌ペレットを500 μLの再懸濁バッファーに再懸濁します。
  3. 500 μLの溶解バッファーをチューブに加え、チューブを8〜10倍反転させて穏やかに混合し、室温で5分間放置して細胞を溶解します。
    注:目に見える白い凝集性物質が残っていないことを確認して、完全な溶解を確認します。
  4. 200 μLの平衡化バッファーを、コレクションチューブに入れたスピンカラムに加えます。18,894 × g で2分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。カラムを回収チューブに戻します。
  5. 500 μLの中和バッファーを細菌溶解物に加え、チューブを8〜10倍反転させて白色の沈殿物が現れるまで穏やかに混合し、室温で5分間放置します。
  6. 18,894 g×gで5分間遠心分離し、上清をフィルターカラムに移します。18,894 × gで1分間遠心分離し、溶液をろ過します。
  7. ろ過した溶液に0.3倍の量のイソプロパノールを加え、反転させて混合します。混合物を平衡化したスピンカラムに移します。
  8. 18,894 × g で1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄して、カラムを収集チューブに戻します。
  9. カラムを 750 μL の洗浄バッファーで洗浄し、18,894 × g で 1 分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  10. カラムを 18,894 × g で再度 1 分間遠心分離し、残留洗浄バッファーを除去します。
  11. スピンカラムを新しい遠心分離チューブに入れます。100-200 μLの溶出バッファーをカラムメンブレンの中央に加えます。室温で2〜5分間放置し、18,894 × g で2分間遠心分離します。プラスミドDNAを-20°Cで保存します。

5. プラスミド形質転換(大腸菌 BL21ケミカルコンピテントセル)

  1. 解凍したBL21ケミカルコンピテントセルを氷上で50μL取ります。ステップ4.11のプラスミドDNAを2 μL加え、穏やかに混合します。氷上で30分間インキュベートします。
  2. 42°Cで45秒間ヒートショックを受けた後、すぐにチューブを氷に2分間戻します。
  3. 各チューブに500 μLの滅菌LB培地を加えます。37°C、180 rpmで1時間インキュベートして、回収します。
  4. 1,000 × g で5分間遠心分離し、余分な上清を捨て、約100 μLを残します。細胞を再懸濁し、100 μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天上にプレート化します。37°Cで逆さまにして一晩インキュベートします。

6. CBE-Mag-T7ポリメラーゼ変異生成剤(不活性型)の発現

  1. 手順 5.1 から 5.4 に従います。細胞を広げる前に、アンピシリンを用いてLB寒天培地の表面に1 mM IPTGを均一に塗布します。脱イオン水をコントロールとして使用して、IPTG処理群と比較します。
  2. すべてのコロニーを成長させた後、10〜20コロニーを選び、フェノールスクリューキャップとゴムライナーを備えた100 mLの丸底ガラス管に1 mM IPTGを含む5 mLのLB培地で培養します。
    注:すべてのコロニーは、ステップ7に進む前に、4°Cで短期間保存することができます。

7. CBE-Mag-T7ポリメラーゼ変異ジェネレーターを活性化します

  1. フェノール製スクリューキャップとゴムライナー付きの丸底ガラス管100mLに細菌を採取し、18,894 × g で2分間遠心分離します。
  2. ミディアムをIPTGなしのLBミディアムに変更します。
    注:この手順は、CBE-Mag-T7ポリメラーゼ変異ジェネレーターがそれ自体を編集できないようにするために重要です。私たちは、CBE-Mag-T7ポリメラーゼ遺伝子クラスターを保護するためにlacI / Oシステムを設計しました。
  3. プレートに青色光照射器(470nm、4mW/cm2)1個を照射し、37°Cで所定時間培養します。サンガーシーケンシングを実施して突然変異を確認し、長時間の曝露により突然変異の頻度が増加するかどうかを確認します。
    注:ここでは、青色光の露出を0、8、16、および24時間に設定します。

8. タンパク質機能亢進と変異導入継続のための変異の選択

注:ここでは、突然変異誘発のための外因性DNAとして gfp 遺伝子を使用し、GFPタンパク質の蛍光強度を高めることができる突然変異を探しています。

  1. コロニーをピックし、プレート上の位置にラベルを付け、収集したコロニーを100 μLのddH2Oに接種します。
  2. 100 μL の細菌懸濁液を 96 ウェルプレートに移し、Ex/Em = 488/510 nm で GFP 強度を読み取ります。
  3. いくつかの明らかなコロニーが特定されるまで、手順6.3から9.2を繰り返します。

9. 突然変異誘発を止め、突然変異を確認する

  1. 数時間の青色光照射を行った後、すべての細菌を4°Cの暗い場所にさらに15分間戻します。
  2. ステップ4で説明したのと同じプラスミド抽出手順に従います。
  3. サンガーシーケンシング用のフォワードプライマーとリバースプライマーを設計します。
    注:ここでは、ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGTGTをフォワードプライマーとして使用し、TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGをサンガーシーケンシングのリバースプライマーとして使用します。

10. データ解析と突然変異頻度の計算

  1. .ab1 ファイルを開いてミューテーションを表示し、手動でピークを確認します。
  2. オンラインツール(Mutation Surveyorツールなど)を使用して、突然変異の頻度を分析します。
  3. サンガーデータファイルをオンラインツールにアップロードし、突然変異率の解析を開始します。

11. 細菌性グリセロールストックの調製

  1. 5 mLのLB培地に100 μg/mLのアンピシリンを注入したチューブに、1つのコロニーを接種します。37°C、180rpmで12〜16時間インキュベートします。
  2. 細菌培養物を50%グリセロールと1:1の比率で混合します。1.5 mLの遠心分離チューブに分注します。-80°Cで保存してください。

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結果

このプロトコルで概説されている方法は、分割CBE-Mag-T7 RNAポリメラーゼ突然変異ジェネレータを使用して外因性DNA上の突然変異を作成するためのものです。CBE-Mag-T7 RNAポリメラーゼ変異系を構築するための遺伝子と突然変異誘発の標的遺伝子は、すべてpET-11aプラスミド骨格に組み込まれています。成功した形質転換と青色光照射は、LB寒天上の正常および同等のコロニー数で示される、細菌のゲノムDNAに損傷を与えることなく行われました(図2)。

外因性DNAの変異は、サンガーシーケンシングを使用して検出されました。 図 3 に示すように、クロマトグラムは 80 bp の部位に赤いピークを示しており、青色光照射後に CBE-Mag-T7 RNA ポリメラーゼ変異系のシトシン塩基エディターによって成功した変異が作成されたことを示しています。GFPの蛍光強度の変化は、 図4の実験群で示されており、G...

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ディスカッション

ポリメラーゼガイド下塩基編集ツールは、2021年にCravensらによって、タンパク質融合戦略17を用いて初めて作成されました。4つのDNAヌクレオチドの突然変異は、bpあたり10〜4 回を超える突然変異でうまく組み込まれました。しかし、T7プロモーターとターミネーターの間に変異が連続的に導入され、研究者による追加の制御がなかったため18、進行中の編集から「良い」変異を保存することはできなかった。この制限に対処するために、2 つの主要コンポーネントに基づく分割システムを組み込んでいます。最初のコンポーネントは、複数の研究で広く使用されているp-Magおよびn-Magシステムです19。第2の成分は、p-Magおよびn-Mag20によって制御できる分裂したT7 RNAポリメラーゼに依存しています。この構成により、突然変異誘発のタイミングと持続時間を光曝露によって正...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
50 mLコニカル遠心分離管隼CLS352070
アンピシリンサーモサイエンティフィックケミカルズJ60977.14
ブルーライト照射器ソーラブスLIU470A
DNAアセンブリクローニングキット NEBE5520S型
DNA/Prmers合成BGIゲノミクス
EndoFree プラスミド ミディ キット CWBIOのCW2106SバッファーP1:再懸濁バッファー、バッファーP2:溶解バッファー、バッファーE3:平衡バッファー、バッファーPS:中和バッファー、バッファーPW:洗浄バッファー、エンドフリーバッファーEB:DNA精製バッファー、RNase A Endo-Remover FM:エンドトキシン除去バッファー、スピンカラムDMコレクションチューブ付き
グリセロールフィッシャーケミカルG33-4
インキュベートシェーカーサーモサイエンティフィックSK2001CPKG
IPTG(イソプロピルチオ-&ベータ;-ガラクトシド)インビトロゲン15529019
マイクロプレートリーダーサーモサイエンティフィックバリオスカンLUX
顕微鏡 ライカDMI 4000B
マルチスカンFCサーモサイエンティフィックケミカルズ
ワンショット BL21(DE3) 化学的にコンピテントな大腸菌インビトロゲンC600003
PureLink Fast 低エンドトキシン ミディプラスミド精製キットインビトロゲンA36227
パイレックス 頑丈な丸底遠心分離管、フェノール製スクリューキャップとゴム製ライナー付きコーニング 8422CLS8422100

参考文献

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T7 DNA in vivo
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