インビトロ H5N1特異的アヒルT細胞の培養と細胞内サイトカイン染色法による免疫応答の検出

T細胞の活性化、増殖、分化、およびメモリーT細胞への変換のプロセスは、抗原特異的免疫応答の中心です¹。最初に、T細胞は、T細胞受容体(TCR)が、主要な組織適合遺伝子複合体(MHC)分子^2,3によって抗原提示細胞(APC)の表面に提示された抗原ペプチドを認識するときに活性化されます。この活性化プロセスには、TCRのMHC分子への結合だけでなく、T細胞の機能を完全に活性化するために重要な共刺激シグナルの協調も必要です⁴。活性化されると、T細胞はすぐに増殖期に入り、元のT細胞と同じ抗原特異性を共有する多数のクローンを生成します。この増殖期には、T細胞はその機能に基づいてさらに分化し、主にCD8⁺ T細胞およびCD4⁺ T細胞⁵に分化します。これらの分化した細胞は、それぞれ細胞傷害性殺傷を媒介し、免疫応答を補助します。最初の感染後、活性化されたT細胞の一部は、長寿命のメモリーT細胞⁶に変化する。これらのメモリーT細胞は、免疫系に長期間持続し、再曝露時に同じ病原体に迅速に反応します。その結果、それらはより強力で効率的な免疫応答を生成し、宿主に長期的な免疫保護を提供します⁷。このプロセス全体は、ワクチンの有効性と耐久性の向上に役立つため、T細胞ワクチンの設計にとって重要です⁸。

このような状況では、抗原特異的T細胞をin vitroで培養することが不可欠になります。このプロトコールは、ヒトT細胞のin vitro培養のための確立された方法に基づいて開発され、鳥の免疫系⁹に必要な適応を伴います。これらの細胞を体外で増殖させることにより、研究者は、活性化、増殖、分化、記憶形成などのさまざまな免疫状態下でのT細胞応答を研究することができる¹⁰。このin vitroアプローチは、免疫応答においてT細胞が果たす役割を理解するために非常に貴重です。さらに、in vitro培養条件下では、T細胞によるサイトカイン(IFN-γなど)の分泌をモニターすることができる^11,12。このモニタリングは、免疫応答の質、強度、持続性を評価するため、またT細胞と他の免疫細胞との間の相互作用を研究するために重要です。さらに、抗原特異的T細胞のin vitroでの増殖により、大規模な濃縮が可能になり、検出感度が向上し、T細胞応答レベルの評価が向上します¹³。したがって、抗原特異的T細胞のin vitro培養は、免疫応答における家禽T細胞の役割をよりよく理解するための強力なツールとして機能し、検出感度を高め、T細胞応答レベルの評価を強化します。哺乳類のシステムでは、同様のin vitro法が十分に確立されていますが、鳥類種でのそのような技術の適用は依然として限られています。これは、T細胞応答を解析するためのツールが未発達な家禽免疫学に特に関係があります。特にアヒルは、いくつかの鳥インフルエンザウイルスの天然の貯蔵庫として機能していますが、その抗原特異的T細胞免疫についてはほとんど知られていません。したがって、鳥類システムに合わせた標準化されたin vitro T細胞培養プロトコルを開発することは、家禽の基礎研究と応用免疫学の両方を進めるために不可欠です。

これらのプロセスに関与する主要なサイトカインは、主にCD8⁺ T細胞、1型CD4⁺ T細胞、およびNK細胞¹⁴によって産生されるII型インターフェロンであるIFN-γである。IFN-γは、ウイルスの複製を阻害し、免疫応答を調節する上で重要な役割を果たします¹⁵。IFN-γの発現レベルは免疫状態を反映し、T細胞活性化のマーカーとして機能し、研究者はその発現を通じてT細胞の応答レベルを評価することができます^16,17。免疫細胞におけるサイトカイン発現を検出するための一般的な方法の一つは、細胞内サイトカイン染色(ICS)^18,19である。しかし、実験材料や技術の制約から、アヒルの研究は哺乳類の研究に遅れをとっています⁵。現在、多くの研究者がIFN-γの発現レベルを測定するためにqPCRに依存していますが、この方法には一定の制限があります¹¹。当研究室では、フローサイトメトリーに対応したduck IFN-γ抗体の開発に成功しました。この成功を基に、本研究では、アヒルT細胞におけるIFN-γタンパク質発現を検出するICS法を確立し、アヒルT細胞の応答に関するさらなる研究のための信頼性の高いツールを提供しました。

利用可能なすべての鳥インフルエンザA(H5N1)ウイルスを用いたすべての実験は、華南農業大学のプロトコル(CNAS BL0011)に従って、動物バイオセーフティレベル3の実験室および動物施設で実施されました。すべての動物研究プロジェクトは、華南農業大学の動物管理および使用委員会(識別コード2021f154、2021年7月29日)によって承認されました。すべての動物の手順は、この委員会によって確立された規制とガイドライン、および動物福祉の国際基準に従って行われました。この研究で使用された動物は、生後4週間の家畜マガモ(Anas platyrhynchos domestica)で、オスとメスの両方を含み、体重は500〜600gの範囲でした。

1. ダックPBMCの単離と単一細胞懸濁液の調製

1. 各アヒルの頸静脈から2 mLのヘパリン化血液を採取し、EDTA含有チューブに移して、個々のアヒルからの凝固を防ぎます
2. リンパ球単離キットまたはPBSから提供されたサンプル希釈剤を使用して血液を希釈します。パスツールピペットでピペッティングして穏やかに混合します。通常の希釈比は、血液と希釈液の1:1です。
3. 希釈した血液と同量のリンパ球分離溶液を遠心チューブに移します。リンパ球分離溶液の上に血液懸濁液を慎重に重ねます。混合物を400 x g、25°Cで15分間遠心分離し、落下加速度を1に設定します。
   注:リンパ球分離液の量は4mL以上でなければなりません。リンパ球分離ソリューションキットの成分は、 材料表に記載されています。
4. 遠心分離後、遠心分離チューブ内の4つの異なる層を上から下に観察します。最上層がサンプル希釈液、次に環状乳白色リンパ球層、次に分離溶液、最下層が赤血球で構成されています。
5. ピペットを慎重に使用して、2番目の層である環状の乳白色リンパ球層を採取し、新しい遠心分離管に移します。10 mLの洗浄液を加えて細胞と混合します。
6. サンプルを440 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨ててから、細胞ペレットを10 mLのRPMI 1640培地に再懸濁して細胞計数します。
7. オプション)サンプルをさらに精製するには、440 x g で5分間遠心分離した後、赤血球溶解バッファーを使用して残りの混合血球を除去します。

2. H5N1 AIV特異的T細胞のin vitro 培養

1. 生後2週間の健康なマガモ(Sheldrake)をアヒル農場から購入し、陰圧アイソレーターに収容します。実験前に赤道凝集阻害(HI)アッセイを使用して、アヒルがAIVに対して陰性であることを確認します。生後4週齢のアヒルにH5N1 AIV 1 x 10⁶を50%卵感染量[EID50]/0.2mLの鼻腔内投与で感染させます。
2. H5N1に感染したアヒルから、ステップ1で説明した方法に従って、感染から28日後にメモリーPBMCを分離します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液を0.08%トリパンブルーで1:1の比率で希釈し、光学顕微鏡で生細胞(未染色細胞)を手動でカウントします。
   注:以前に発表された研究²⁰で裏付けられているように、感染後28日目に分離された末梢血単核細胞(PBMC)は、メモリーT細胞が豊富であると考えられています。この段階では、エフェクター相は沈静化しており、記憶細胞集団が優勢です。
3. 濃度を3 x 10⁶ 細胞/mLに設定し、48ウェルプレートの各ウェルに1 mLの培地を添加します。
4. 単離されたPBMCをH5N1鳥インフルエンザウイルス(AIV)に同時感染させ、APCとして機能します。ウイルス量はMOI = 5です。PBMCをウイルスと37°Cで1時間共培養します。 15分ごとに手で優しく振ってください。
5. 感染の1時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、結合していないウイルス粒子を除去します。洗浄したPBMCを1 mLのT細胞培養培地に再懸濁し、さらに懸濁した細胞を37°Cで5時間インキュベートします。
6. 細胞を440 x g で室温で5分間遠心分離します。その後、インキュベートした抗原提示細胞(APC)を100 μLのT細胞培養培地に再懸濁し、エフェクター細胞に加えます。抗原提示細胞とエフェクター細胞の比率は1:5である必要があります。
7. 細胞を5%_CO2 雰囲気、37°Cで14日間インキュベートします。2日ごとに、細胞培養上清の半分を新鮮なT細胞培地と交換し、慎重にピペッティングして均一に分布させます。セルを含む培地の半分を廃棄し、同量の新しい培地を追加します。
8. 7日目に、光学顕微鏡で細胞を100倍で観察します。
9. PBSで処理されたメモリPBMCを非刺激対照群として使用します。

3. カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)によるT細胞増殖のモニタリング

1. 細胞密度を0.5-1 x 10⁷ cells/mLに調整し、440 x g で5分間遠心分離した後、細胞を5 mLのPBSで再懸濁します。
2. 10 mM ストックを 1 μM CFSE に希釈し、5 mL の予冷済み PBS で希釈します。暗闇で操作します。
3. 2本の遠心分離チューブを45°に傾け、パスツールピペットでCFSE希釈液を細胞懸濁液に加え、よく混合し、37°Cの水浴に15分間暗所で置きます。
4. 細胞を5%FBSを含む予冷PBS10容量で希釈して洗浄し、沈殿物を440× g で5分間遠心分離して沈降させ、上清を捨てます。洗濯を2回繰り返します。
5. ステップ2に従って 、in vitro でCFSEで標識された細胞を刺激します。増殖アッセイが完了したら、細胞を回収し、フローサイトメトリーで解析します。

4. CD8⁺ T細胞およびCD4⁺ T細胞の増殖のためのフローサイトメトリー解析

1. 7日間の培養後、各ウェルからすべての細胞を採取し、分析のために2本のフローチューブに分けます。
2. 細胞を新しい遠心チューブに移し、室温で440 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
3. 抗体カクテル100 μL(マウス抗アヒルCD8、1:50またはマウス抗アヒルCD4、1:50)を加え、4°Cの暗所で30分間細胞をインキュベートします。
4. 細胞を新しい遠心チューブに移し、室温で440 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
5. 抗体カクテル (FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) 100 μL を加え、暗所 4 °C で 30 分間細胞をインキュベートします。
6. 細胞を1 mLのPBSで1回洗浄し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析します。ゲーティング戦略を 補足図 1 に示します。

5. qPCRを用いたシグネチャー遺伝子発現アッセイによるT細胞応答

1. T細胞培養の最後に細胞をカウントし、1.5 mLの遠心チューブに回収し、400 x g で5分間遠心分離します。上澄みは慎重に捨ててください。
2. RNA抽出
   注:抽出は、RNA汚染を防ぐために、ドラフトまたは超クリーンベンチで行うことができます。
   1. キットに付属の溶解バッファーを使用して、製造元の指示に従って細胞を溶解します。溶解したサンプルをgDNAフィルターカラム(収集チューブにあらかじめ配置)に移し、13,400 x g で30秒間遠心分離し、カラムを廃棄して濾液を回収します。濾液に0.5容量の無水エタノールを加えます。よく混ぜます。
      注:エタノール添加後の濁った溶液または沈殿物は正常です。振って次のステップに進みます。
   2. 混合物をRNAカラムに移し、13,400 x g で30秒間遠心分離します。濾液を廃棄し、700 μLのBuffer RW1を加え、再度遠心分離します。
   3. ろ液を廃棄し、700 μLのBuffer RW2(無水エタノールを含む)を加え、遠心分離します。ろ液を廃棄し、500 μLのBuffer RW2(無水エタノールを含む)を加え、2分間遠心分離します。濾液からの汚染を避けるために、カラムをチューブから慎重に取り外します。下流の反応への干渉を防ぐために、すべてのリンス液が除去されていることを確認してください。
   4. カラムを新しいRNaseフリーコレクションチューブに移し、50〜200 μLのRNaseフリーddH₂Oを加え、室温で1分間放置した後、13,400 x g で1分間遠心分離してRNAを溶出します。RNAの純度と濃度を測定します。
      注:RNaseフリーのddH₂Oを65°Cに予熱して収量を増やし、必要に応じて2回目の溶出を行います。
3. キットの指示に従ってcDNAを合成します。製造元の指示に従ってcDNA鎖を合成し、逆転写酵素を5倍の量に加えます。37°Cで15分間、次に85°Cで5秒間逆転写し、4°Cに冷却します。
4. メーカーのプロトコルに従ってPCR反応を設定します。
   1. qPCRチューブで、10 μLの2x PCR反応酵素ミックス、0.4 μLのプライマー1、0.4 μLのプライマー2、1 μLのcDNAテンプレート、および8.2 μLのddH₂Oを組み合わせ、20 μLのミックスを作成します。
   2. 以下のプログラムを使用して、リアルタイム定量PCR装置でPCRを実行します。
      ステージ1:95°Cで30秒間、REP x 1
      ステージ 2: 95 °C で 3 秒、60 °C で 30 秒、REP x 35
      ステージ3:95°Cで15秒、60°Cで60秒、95°Cで15秒、REP x 1

6. 細胞内サイトカイン染色(ICS)

注:このプロトコルは、アヒルの細胞内IFN-γ分泌を検出することにより、H5N1特異的CD8⁺ T細胞のエフェクター応答を評価するために開発されました。

1. ステップ2で説明した手順に従って、H5N1特異的T細胞 をin vitro で培養します。培養開始から7日後にすべての細胞(各ウェルから)を回収します。
2. ステップ2で概説した抗原提示細胞(APC)をインキュベートします。インキュベートしたAPCとブレフェルジンA(1:1,000)をエフェクター細胞に加え、39°Cのインキュベーターで6時間共インキュベートします。
3. 細胞を新しい遠心チューブに移し、室温で440 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
4. 抗体カクテル100μL(マウス抗アヒルCD8、1:50)を細胞に加え、暗所4°Cで30分間インキュベートします。
5. 細胞を400 x g で4°Cで5分間遠心分離して洗浄し、1 mLのPBSに再懸濁します。抗体カクテル(FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b、1:50)を加え、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。
6. 細胞を再び洗浄し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞を100 μLの固定緩衝液に再懸濁し、4°Cの暗所で20〜25分間インキュベートします。
7. 細胞を400 x g で4°C、5分間遠心分離して再度洗浄します。 1 mLの1x透過化バッファーを添加し、細胞を440 x g で440 g、4°C、5分間遠心分離して2回洗浄します。
8. 上清を捨て、細胞を100 μLの透過化バッファーに再懸濁し、抗体(Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10)を細胞に加えます。固定および膜透過処理後、細胞-抗体混合物を暗所で30分間インキュベートし、4°Cでのインキュベーション中に時々振とうします。
   注:透過化/洗浄液は10倍ストック溶液であり、使用前にPBSで希釈する必要があります。
9. 400 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、1 mLのPBSで細胞を再度洗浄します。 抗体カクテル (PE-conjugated Goat Anti-Mouse IgG3, 1:250) 100 μL を加え、4°C の暗所で 30 分間インキュベートします。
10. FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析します。ゲーティング戦略を 図 1 に示します。

このプロトコルは、アヒル20における抗原特異的T細胞エフェクター応答の検出に関する以前の研究に基づいて開発されました。実験の最初のステップは、その後のエフェクター応答研究の基礎となるウイルス特異的T細胞の in vitro 培養です。最初に、APCをインキュベートし、エフェクター細胞と共培養しました。形態学的観察により、増殖後、細胞はクラスター増殖を示すことが明らかになりました(図2A)。CFSE標識は、細胞分裂の複数のピークを示すことにより、増殖の成功をさらに確認しました(図2B)。最後に、アヒル特異的細胞マーカーCD8/CD4を用いて細胞20の割合と絶対数を評価し、抗原特異的T細胞の in vitro 培養が成功したことを確認しました(図2C)。

培養7日目に、細胞を採取し、免疫関連遺伝子の発現を評価しました。増殖するT細胞は、グランザイムAやIFN-γなどの細胞傷害性関連遺伝子を主に発現していることを発見しました11,20(図3)ことから、これらの細胞が主に細胞傷害性応答に関与していることが示唆されました。このエフェクター応答をさらに調べるために、アヒルT細胞によるIFN-γ分泌を定量的に検出するためのアヒル特異的染色プロトコルを確立しました。フローサイトメトリーを使用して、増殖した集団のCD8 T細胞を固定、透過処理、および抗IFN-γ抗体で標識しました。その結果、抗原刺激後、CD8high+T集団とCD8low+T集団の両方でIFN-γ+細胞の割合が有意にアップレギュレーションされることが示され(図4)、増殖によって生成されたCD8+ T細胞の強力なエフェクター応答が示されました。

図1:CD4+/CD8+T細胞のゲーティング戦略 (A)H5N1刺激細胞と非刺激細胞の間のCD4+ T細胞の割合と表現型のゲーティングと分析 培養後14日後。(B)H5N1刺激細胞と非刺激細胞の間のCD8+ T細胞の割合と表現型のゲーティングと分析 14日間の培養後。この数値は平成20年から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:H5N1 AIV特異的アヒルT細胞の in vitro 培養。 (A)H5N1 AIVによる刺激の有無にかかわらず、メモリーPBMCの形態学的解析。2つの異なるアヒルメモリPBMCドナーを使用して、2つの独立した実験が行われました。(B)H5N1に感染したアヒルのH5N1刺激細胞におけるCFSE希釈により、CFSE標識PBMCの増殖を2週間後の培養で評価した。赤色のサンプルは、刺激なしのCFSE標識メモリーPBMCを表し、黄色、緑、黒のサンプルは、それぞれ7日、8日、14日の培養後にH5N1で刺激されたCFSE標識メモリーPBMCを示しています。(C)14日間の培養後に、H5N1刺激細胞と非刺激細胞の間でCD4+ およびCD8+ T細胞の割合を分析した。統計的有意性は、対応のないt検定を使用して決定されました。(D)14日間の培養後に、H5N1刺激細胞と非刺激細胞の間でCD4+ とCD8+ T細胞の数を比較した。T細胞の割合と数に関するデータは、それぞれ2回の反復による2つの独立した実験から得られた。統計解析は、対応のない t 検定 ns p > 0.05、*p < 0.05、**p < 0.01 を使用して実行しました。この数値は平成20年から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:qRT-PCRによるH5N1 AIV特異的ダックT細胞応答の検出。 データは、H5N1刺激群と非刺激群のそれぞれ3回の反復から収集されました。結果はSEM±平均として提示され、対応のあるt検定を統計的比較に使用しました。*p < 0.05、**p < 0.01.この数値は平成20年から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:刺激を受けたアヒルPBMC由来のCD8+ T細胞におけるIFN-γ発現のフローサイトメトリー解析 (A)刺激群と対照群のICSゲーティング戦略。(B)刺激後のアヒルPBMCからのCD8low+ およびCD8high+ 細胞におけるIFN-γ発現の統計解析。グループ間のIFN-γ発現の差はt検定によって評価され、 比較はp≤0.05で有意であると考えられました。この数値は平成20年から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:CD4+およびCD8+ T細胞に用いられるゲーティング戦略。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

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