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方法論記事

インビトロ H5N1特異的アヒルT細胞の培養と細胞内サイトカイン染色法による免疫応答の検出

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DOI:

10.3791/68291

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2025年5月30日

 ,  ,  ,  , 
1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、感染したアヒルからメモリーT細胞を単離することにより、 インビトロ で鳥T細胞を培養する方法を説明し、高度に精製された特定のアヒルT細胞の生成を可能にします。さらに、アヒルT細胞のIFN-γ分泌を正確に測定するために、細胞内サイトカイン染色(ICS)法が確立されました。

要約

T細胞の in vitro 培養は、免疫応答、ウイルス感染、および潜在的な治療戦略を研究するための重要な方法です。しかし、 in vitro で鳥T細胞を培養するための確立されたプロトコルは今日まで報告されていません。本研究では、高病原性鳥インフルエンザ(HPAIV)H5N1ウイルスをモデルとして、初めてプロトコールを提示します。ここでは、生後4週間のアヒルにウイルスに感染し、感染後28日後にメモリーTリンパ球を分離してH5N1特異的アヒルTリンパ球を培養することで、H5N1ウイルスに対する特異的免疫応答を調べることができました。プロトコールの主要なステップには、感染したアヒルからの記憶末梢血単核細胞(PBMC)の単離、最適な感染の多重度(MOI = 5)で6時間にわたる抗原提示細胞(APC)の活性化、組換えIL-2およびその他の特異的添加物を添加したT細胞培養培地の調製が含まれます。T細胞の増殖、サイトカイン分泌、および細胞毒性活性は、プロセス全体を通じて綿密に監視されました。さらに、アヒルT細胞におけるIFN-γ分泌を定量するための細胞内サイトカイン染色プロトコルを確立しました。これには、duck IFN-γに特異的なIgG3κ抗体を発現するハイブリドーマ細胞株を作製し、その後、抗体精製を成功させることが含まれていました。精製した抗体を1:10に希釈し、フローサイトメトリーに適用してIFN-γ分泌を正確に測定しました。この方法は、アヒルT細胞の応答を評価するための信頼性の高いツールを提供し、将来の鳥ウイルス免疫学の研究の基礎を築きます。

概要

T細胞の活性化、増殖、分化、およびメモリーT細胞への変換のプロセスは、抗原特異的免疫応答の中心です1。最初に、T細胞は、T細胞受容体(TCR)が、主要な組織適合遺伝子複合体(MHC)分子2,3によって抗原提示細胞(APC)の表面に提示された抗原ペプチドを認識するときに活性化されます。この活性化プロセスには、TCRのMHC分子への結合だけでなく、T細胞の機能を完全に活性化するために重要な共刺激シグナルの協調も必要です4。活性化されると、T細胞はすぐに増殖期に入り、元のT細胞と同じ抗原特異性を共有する多数のクローンを生成します。この増殖期には、T細胞はその機能に基づいてさらに分化し、主にCD8+ T細胞およびCD4+ T細胞5に分化します。これらの分化した細胞は、それぞれ細胞傷害性殺傷を媒介し、免疫応答を補助します。最初の感染後、活性化されたT細胞の一部は、長寿命のメモリーT細胞6に変化する。これらのメモリーT細胞は、免疫系に長期間持続し、再曝露時に同じ病原体に迅速に反応します。その結果、それらはより強力で効率的な免疫応答を生成し、宿主に長期的な免疫保護を提供します7。このプロセス全体は、ワクチンの有効性と耐久性の向上に役立つため、T細胞ワクチンの設計にとって重要です8。

このような状況では、抗原特異的T細胞をin vitroで培養することが不可欠になります。このプロトコールは、ヒトT細胞のin vitro培養のための確立された方法に基づいて開発され、鳥の免疫系9に必要な適応を伴います。これらの細胞を体外で増殖させることにより、研究者は、活性化、増殖、分化、記憶形成などのさまざまな免疫状態下でのT細胞応答を研究することができる10。このin vitroアプローチは、免疫応答においてT細胞が果たす役割を理解するために非常に貴重です。さらに、in vitro培養条件下では、T細胞によるサイトカイン(IFN-γなど)の分泌をモニターすることができる11,12。このモニタリングは、免疫応答の質、強度、持続性を評価するため、またT細胞と他の免疫細胞との間の相互作用を研究するために重要です。さらに、抗原特異的T細胞のin vitroでの増殖により、大規模な濃縮が可能になり、検出感度が向上し、T細胞応答レベルの評価が向上します13。したがって、抗原特異的T細胞のin vitro培養は、免疫応答における家禽T細胞の役割をよりよく理解するための強力なツールとして機能し、検出感度を高め、T細胞応答レベルの評価を強化します。哺乳類のシステムでは、同様のin vitro法が十分に確立されていますが、鳥類種でのそのような技術の適用は依然として限られています。これは、T細胞応答を解析するためのツールが未発達な家禽免疫学に特に関係があります。特にアヒルは、いくつかの鳥インフルエンザウイルスの天然の貯蔵庫として機能していますが、その抗原特異的T細胞免疫についてはほとんど知られていません。したがって、鳥類システムに合わせた標準化されたin vitro T細胞培養プロトコルを開発することは、家禽の基礎研究と応用免疫学の両方を進めるために不可欠です。

これらのプロセスに関与する主要なサイトカインは、主にCD8+ T細胞、1型CD4+ T細胞、およびNK細胞14によって産生されるII型インターフェロンであるIFN-γである。IFN-γは、ウイルスの複製を阻害し、免疫応答を調節する上で重要な役割を果たします15。IFN-γの発現レベルは免疫状態を反映し、T細胞活性化のマーカーとして機能し、研究者はその発現を通じてT細胞の応答レベルを評価することができます16,17。免疫細胞におけるサイトカイン発現を検出するための一般的な方法の一つは、細胞内サイトカイン染色(ICS)18,19である。しかし、実験材料や技術の制約から、アヒルの研究は哺乳類の研究に遅れをとっています5。現在、多くの研究者がIFN-γの発現レベルを測定するためにqPCRに依存していますが、この方法には一定の制限があります11。当研究室では、フローサイトメトリーに対応したduck IFN-γ抗体の開発に成功しました。この成功を基に、本研究では、アヒルT細胞におけるIFN-γタンパク質発現を検出するICS法を確立し、アヒルT細胞の応答に関するさらなる研究のための信頼性の高いツールを提供しました。

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プロトコル

利用可能なすべての鳥インフルエンザA(H5N1)ウイルスを用いたすべての実験は、華南農業大学のプロトコル(CNAS BL0011)に従って、動物バイオセーフティレベル3の実験室および動物施設で実施されました。すべての動物研究プロジェクトは、華南農業大学の動物管理および使用委員会(識別コード2021f154、2021年7月29日)によって承認されました。すべての動物の手順は、この委員会によって確立された規制とガイドライン、および動物福祉の国際基準に従って行われました。この研究で使用された動物は、生後4週間の家畜マガモ(Anas platyrhynchos domestica)で、オスとメスの両方を含み、体重は500〜600gの範囲でした。

1. ダックPBMCの単離と単一細胞懸濁液の調製

  1. 各アヒルの頸静脈から2 mLのヘパリン化血液を採取し、EDTA含有チューブに移して、個々のアヒルからの凝固を防ぎます
  2. リンパ球単離キットまたはPBSから提供されたサンプル希釈剤を使用して血液を希釈します。パスツールピペットでピペッティングして穏やかに混合します。通常の希釈比は、血液と希釈液の1:1です。
  3. 希釈した血液と同量のリンパ球分離溶液を遠心チューブに移します。リンパ球分離溶液の上に血液懸濁液を慎重に重ねます。混合物を400 x g、25°Cで15分間遠心分離し、落下加速度を1に設定します。
    注:リンパ球分離液の量は4mL以上でなければなりません。リンパ球分離ソリューションキットの成分は、 材料表に記載されています。
  4. 遠心分離後、遠心分離チューブ内の4つの異なる層を上から下に観察します。最上層がサンプル希釈液、次に環状乳白色リンパ球層、次に分離溶液、最下層が赤血球で構成されています。
  5. ピペットを慎重に使用して、2番目の層である環状の乳白色リンパ球層を採取し、新しい遠心分離管に移します。10 mLの洗浄液を加えて細胞と混合します。
  6. サンプルを440 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨ててから、細胞ペレットを10 mLのRPMI 1640培地に再懸濁して細胞計数します。
  7. オプション)サンプルをさらに精製するには、440 x g で5分間遠心分離した後、赤血球溶解バッファーを使用して残りの混合血球を除去します。

2. H5N1 AIV特異的T細胞のin vitro 培養

  1. 生後2週間の健康なマガモ(Sheldrake)をアヒル農場から購入し、陰圧アイソレーターに収容します。実験前に赤道凝集阻害(HI)アッセイを使用して、アヒルがAIVに対して陰性であることを確認します。生後4週齢のアヒルにH5N1 AIV 1 x 106を50%卵感染量[EID50]/0.2mLの鼻腔内投与で感染させます。
  2. H5N1に感染したアヒルから、ステップ1で説明した方法に従って、感染から28日後にメモリーPBMCを分離します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液を0.08%トリパンブルーで1:1の比率で希釈し、光学顕微鏡で生細胞(未染色細胞)を手動でカウントします。
    注:以前に発表された研究20で裏付けられているように、感染後28日目に分離された末梢血単核細胞(PBMC)は、メモリーT細胞が豊富であると考えられています。この段階では、エフェクター相は沈静化しており、記憶細胞集団が優勢です。
  3. 濃度を3 x 106 細胞/mLに設定し、48ウェルプレートの各ウェルに1 mLの培地を添加します。
  4. 単離されたPBMCをH5N1鳥インフルエンザウイルス(AIV)に同時感染させ、APCとして機能します。ウイルス量はMOI = 5です。PBMCをウイルスと37°Cで1時間共培養します。 15分ごとに手で優しく振ってください。
  5. 感染の1時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、結合していないウイルス粒子を除去します。洗浄したPBMCを1 mLのT細胞培養培地に再懸濁し、さらに懸濁した細胞を37°Cで5時間インキュベートします。
  6. 細胞を440 x g で室温で5分間遠心分離します。その後、インキュベートした抗原提示細胞(APC)を100 μLのT細胞培養培地に再懸濁し、エフェクター細胞に加えます。抗原提示細胞とエフェクター細胞の比率は1:5である必要があります。
  7. 細胞を5%CO2 雰囲気、37°Cで14日間インキュベートします。2日ごとに、細胞培養上清の半分を新鮮なT細胞培地と交換し、慎重にピペッティングして均一に分布させます。セルを含む培地の半分を廃棄し、同量の新しい培地を追加します。
  8. 7日目に、光学顕微鏡で細胞を100倍で観察します。
  9. PBSで処理されたメモリPBMCを非刺激対照群として使用します。

3. カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE)によるT細胞増殖のモニタリング

  1. 細胞密度を0.5-1 x 107 cells/mLに調整し、440 x g で5分間遠心分離した後、細胞を5 mLのPBSで再懸濁します。
  2. 10 mM ストックを 1 μM CFSE に希釈し、5 mL の予冷済み PBS で希釈します。暗闇で操作します。
  3. 2本の遠心分離チューブを45°に傾け、パスツールピペットでCFSE希釈液を細胞懸濁液に加え、よく混合し、37°Cの水浴に15分間暗所で置きます。
  4. 細胞を5%FBSを含む予冷PBS10容量で希釈して洗浄し、沈殿物を440× g で5分間遠心分離して沈降させ、上清を捨てます。洗濯を2回繰り返します。
  5. ステップ2に従って 、in vitro でCFSEで標識された細胞を刺激します。増殖アッセイが完了したら、細胞を回収し、フローサイトメトリーで解析します。

4. CD8+ T細胞およびCD4+ T細胞の増殖のためのフローサイトメトリー解析

  1. 7日間の培養後、各ウェルからすべての細胞を採取し、分析のために2本のフローチューブに分けます。
  2. 細胞を新しい遠心チューブに移し、室温で440 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
  3. 抗体カクテル100 μL(マウス抗アヒルCD8、1:50またはマウス抗アヒルCD4、1:50)を加え、4°Cの暗所で30分間細胞をインキュベートします。
  4. 細胞を新しい遠心チューブに移し、室温で440 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
  5. 抗体カクテル (FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) 100 μL を加え、暗所 4 °C で 30 分間細胞をインキュベートします。
  6. 細胞を1 mLのPBSで1回洗浄し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析します。ゲーティング戦略を 補足図 1 に示します。

5. qPCRを用いたシグネチャー遺伝子発現アッセイによるT細胞応答

  1. T細胞培養の最後に細胞をカウントし、1.5 mLの遠心チューブに回収し、400 x g で5分間遠心分離します。上澄みは慎重に捨ててください。
  2. RNA抽出
    注:抽出は、RNA汚染を防ぐために、ドラフトまたは超クリーンベンチで行うことができます。
    1. キットに付属の溶解バッファーを使用して、製造元の指示に従って細胞を溶解します。溶解したサンプルをgDNAフィルターカラム(収集チューブにあらかじめ配置)に移し、13,400 x g で30秒間遠心分離し、カラムを廃棄して濾液を回収します。濾液に0.5容量の無水エタノールを加えます。よく混ぜます。
      注:エタノール添加後の濁った溶液または沈殿物は正常です。振って次のステップに進みます。
    2. 混合物をRNAカラムに移し、13,400 x g で30秒間遠心分離します。濾液を廃棄し、700 μLのBuffer RW1を加え、再度遠心分離します。
    3. ろ液を廃棄し、700 μLのBuffer RW2(無水エタノールを含む)を加え、遠心分離します。ろ液を廃棄し、500 μLのBuffer RW2(無水エタノールを含む)を加え、2分間遠心分離します。濾液からの汚染を避けるために、カラムをチューブから慎重に取り外します。下流の反応への干渉を防ぐために、すべてのリンス液が除去されていることを確認してください。
    4. カラムを新しいRNaseフリーコレクションチューブに移し、50〜200 μLのRNaseフリーddH2Oを加え、室温で1分間放置した後、13,400 x g で1分間遠心分離してRNAを溶出します。RNAの純度と濃度を測定します。
      注:RNaseフリーのddH2Oを65°Cに予熱して収量を増やし、必要に応じて2回目の溶出を行います。
  3. キットの指示に従ってcDNAを合成します。製造元の指示に従ってcDNA鎖を合成し、逆転写酵素を5倍の量に加えます。37°Cで15分間、次に85°Cで5秒間逆転写し、4°Cに冷却します。
  4. メーカーのプロトコルに従ってPCR反応を設定します。
    1. qPCRチューブで、10 μLの2x PCR反応酵素ミックス、0.4 μLのプライマー1、0.4 μLのプライマー2、1 μLのcDNAテンプレート、および8.2 μLのddH2Oを組み合わせ、20 μLのミックスを作成します。
    2. 以下のプログラムを使用して、リアルタイム定量PCR装置でPCRを実行します。
      ステージ1:95°Cで30秒間、REP x 1
      ステージ 2: 95 °C で 3 秒、60 °C で 30 秒、REP x 35
      ステージ3:95°Cで15秒、60°Cで60秒、95°Cで15秒、REP x 1

6. 細胞内サイトカイン染色(ICS)

注:このプロトコルは、アヒルの細胞内IFN-γ分泌を検出することにより、H5N1特異的CD8+ T細胞のエフェクター応答を評価するために開発されました。

  1. ステップ2で説明した手順に従って、H5N1特異的T細胞 をin vitro で培養します。培養開始から7日後にすべての細胞(各ウェルから)を回収します。
  2. ステップ2で概説した抗原提示細胞(APC)をインキュベートします。インキュベートしたAPCとブレフェルジンA(1:1,000)をエフェクター細胞に加え、39°Cのインキュベーターで6時間共インキュベートします。
  3. 細胞を新しい遠心チューブに移し、室温で440 x g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
  4. 抗体カクテル100μL(マウス抗アヒルCD8、1:50)を細胞に加え、暗所4°Cで30分間インキュベートします。
  5. 細胞を400 x g で4°Cで5分間遠心分離して洗浄し、1 mLのPBSに再懸濁します。抗体カクテル(FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b、1:50)を加え、4°Cの暗所で30分間インキュベートします。
  6. 細胞を再び洗浄し、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨て、細胞を100 μLの固定緩衝液に再懸濁し、4°Cの暗所で20〜25分間インキュベートします。
  7. 細胞を400 x g で4°C、5分間遠心分離して再度洗浄します。 1 mLの1x透過化バッファーを添加し、細胞を440 x g で440 g、4°C、5分間遠心分離して2回洗浄します。
  8. 上清を捨て、細胞を100 μLの透過化バッファーに再懸濁し、抗体(Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10)を細胞に加えます。固定および膜透過処理後、細胞-抗体混合物を暗所で30分間インキュベートし、4°Cでのインキュベーション中に時々振とうします。
    注:透過化/洗浄液は10倍ストック溶液であり、使用前にPBSで希釈する必要があります。
  9. 400 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、1 mLのPBSで細胞を再度洗浄します。 抗体カクテル (PE-conjugated Goat Anti-Mouse IgG3, 1:250) 100 μL を加え、4°C の暗所で 30 分間インキュベートします。
  10. FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析します。ゲーティング戦略を 図 1 に示します。

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結果

このプロトコルは、アヒル20における抗原特異的T細胞エフェクター応答の検出に関する以前の研究に基づいて開発されました。実験の最初のステップは、その後のエフェクター応答研究の基礎となるウイルス特異的T細胞の in vitro 培養です。最初に、APCをインキュベートし、エフェクター細胞と共培養しました。形態学的観察により、増殖後、細胞はクラスター増殖を示すことが明らかになりました(図2A)。CFSE標識は、細胞分裂の複数のピークを示すことにより、増殖の成功をさらに確認しました(図2B)。最後に、アヒル特異的細胞マーカーCD8/CD4を用いて細胞20の割合と絶対数を評価し、抗原特異的T細胞の in vitro 培養が成功したことを確認しました(図2C)。

培養7日目に、細胞を採取...

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ディスカッション

このプロトコールは、アヒル抗原特異的T細胞の in vitro 培養に効率的な方法を提供するとともに、T細胞のエフェクター応答を評価するために使用できるアヒルの細胞内サイトカイン染色プロトコールも確立します。現在、アヒルT細胞の in vitro 培養プロトコルに関する報告は発表されていません。主にヒト抗原特異的T細胞のプロトコルを参照しましたが、APCのインキュベーション条件の最適化に取り組んでいます。私たちは、差別化プロトコルのさらなる最適化を検討しています。

このプロトコルには、その成功に不可欠な2つの重要なステップがあります。まず、アヒルT細胞のin vitro培養では、十分なT細胞の増殖と機能保存を確保するために、抗原用量、APC活性化、培養期間などの刺激条件を慎重に最適化する必要があります。これらのパラメータが逸脱すると、最適でない活性化や細胞死につながる可能性があります。第二に、ICSアッセイは、IFN-γ発現を機能的に評価するための重要な技術です。ICSを成功させ...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、中国国立自然科学基金会(32473060および32461120064)(MDおよびMLに)の支援を受けました。広州基礎および応用基礎研究プロジェクト(2025A04J5445)(MDへ);長江奨学生教授プログラムの若手奨学生(2024年、マンマン・ダイ)。「広東特別支援計画」のヤングピール川奨学生(2024年、マンマンダイ)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL MICRO遠心分離管BiosharpCat#BS-15-M
15 mL遠心分離管LabselectCat#CT-002-15A
2-メルカプトエタノール(55 mM)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48ウェル組織培養プレート(未処理、平底)BiofilCat#TCP000048
50 mL遠心分離管LabselectCat#CT-002-50A
96ウェルアンスカートqPCRプレートLabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm kitBD BioscienceCat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BioscienceCat#347688
細胞培養 CO2 インキュベーターThermo FisherHeracell 150i GP
遠心分離機Eppendorf5810R
CFSE標識キットAbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR マスターミックスVazymeCat#Q341-02
アヒル末梢血リンパ球分離キットTbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT PremixAccurate BiotechnologyCat#AG11706
FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolationキット V2VazymeCat#RC112-01
ウシ胎児血清GibcoCat#10437-028
フローサイトメーターBeckman CoulterBA43347
フローチューブBeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
Goat Anti-Mouse 488、1:50 希釈AbbkineCat#A23210
ヤギ抗マウス IgG2b、FITC、1:50 希釈Southern BiotechCat#1091-31
ヤギ抗マウス IgG3、PE、1:250 希釈Southern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad プリズム 8.0.2GraphPad ソフトウェアhttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV 株 DK383獣共通感染症予防および制御の医療のための国立および地域共同工学研究所A/Duck/Guangdong/383/2008
L-グルタミン (200 mM)GibcoCat#25030081
顕微鏡MoticAE2000
マウス抗アヒルCD4、1:50希釈Bio-RadCat#MCA2478
抗アヒルCD8&α;、1:50希釈GeneTex Cat#GTX41834
マウス抗アヒルIFN-&ガンマ;mAb、1:10希釈当研究室で調製 NA
NanoDrop One 分光光度計Thermo FisherAZY1603209
NEAA (非必須GibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR サーマルサイクラーBiometra BiometraTone 96G
ペニシリン ストレプトマイシン溶液GibcoCat#15070063
ABI7500組
換えヒト IL-2 (10 &g)USCNKCat#RPA111Ga01
赤血球溶解バッファーTBDSCIENCECat#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoCat#11875-119
ピルビン酸ナトリウム (100 mM)GibcoCat#11360-070
トリパン ブルーシグマ アルドリッチCat#93595
後 2 週間のマガモ (シェルドレイク)ヒル農場広州
人マウス 生ア NA

参考文献

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