方法論記事

全身プレチスモグラフィーとドップラー超音波法によるマウスの肺腺癌進行時の肺機能と血流の動的変化

DOI：

10.3791/68306

⸱

2025年6月10日

 ,  ,  ,  , 
1School of Clinical Medicine, Chengdu University of TCM, 2Chengdu Xinjin District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3China Civil Affairs University, 4Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、マウスの肺機能とドップラー超音波を調査技術として使用し、肺腺癌を研究するための非侵襲的でシンプルで効率的な方法を提供します。

要約

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肺腺がん (LUAD) は一般的な悪性肺腫瘍であり、その進行は換気と血流の変化を引き起こし、病理学的条件下での肺の明確な機能的特徴を強調しています。非侵襲的な全身プレチスモグラフィー(WBP)システムは、覚醒マウスの肺機能と気道応答性をリアルタイムでモニタリングし、気管切開や麻酔による干渉を回避します。小動物ドップラー超音波(DU)は、高周波イメージング技術を利用して、微小血管の構造と肺の血流速度の変化を非侵襲的に捉え、LUADに関連する換気と灌流の異常を調査するための重要なサポートを提供します。本研究では、100 mg/kgの4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)を用いて、A/JマウスにLUADモデルを確立した。WBPとDUの組み合わせは、マウスの肺機能と血行動態パラメータを監視するために採用されました。その結果、50%呼気流量(EF50)、分時換気(MV)、最大呼気流量(PEF)、最大吸気流量(PIF)、強化された一時停止(Penh)、および一回換気量(TV)などの主要な指標で有意な減少(p < 0.05)が明らかになりました。また、腫瘍進行中のモデル群では、肺動脈血流速度(p < 0.05)が著しく低下しました。この組み合わせたアプローチは、マウスのLUADの病理学的発達中に発生する機能的混乱を効果的に捉え、呼吸器疾患の研究を進めるための非侵襲的で効率的な方法を提供します。

概要

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肺腺がん(LUAD)は、非小細胞肺がんの最も一般的なサブタイプです1。環境汚染、タバコの使用、人口の高齢化の増加に伴い、LUADの世界的な普及率は毎年増加しています2,3,4。現在の研究では、LUAD が進行するにつれて、患者は肺機能と血行動態障害の進行性低下を経験することが示されています 5,6,7,8。肺機能と肺動脈血流の変動を追跡および評価するための非侵襲的で効率的で費用対効果の高い方法を開発することで、臨床LUAD管理の重要な証拠を提供できます。

既存の研究では、LUAD腫瘍の増殖が徐々に気道を閉塞し、肺活量と換気を減少させ9、炎症性サイトカイン分泌を誘発し、局所的な慢性炎症を通じて気道狭窄を悪化させることが実証されています10。その結果、肺機能の低下は、低酸素症と血流異常の悪化につながります11,12。これらの病理学的変化は、しばしば進行性の呼吸困難や胸部圧迫感として臨床的に現れます。CTイメージングでは、LUADの進行によって誘発されるリアルタイムの肺機能パラメータの異常や血行動態の変化を捉えることはできませんが、短期間のCTスキャンを繰り返すと、放射線被ばくも増加します13。対照的に、全身プレチスモグラフィー(WBP)とドップラー超音波流量測定は、動的モニタリングのための非侵襲的で、オペレーターに優しく、再現性のある補完的なアプローチとして機能します。これらの技術を統合して肺機能と血行動態を監視することで、疾患の進行評価と治療上の意思決定を改善できる可能性があります。

本研究では、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)をA/Jマウスに用いて、LUADの開始と進行をモデル化した。肺機能と血行動態の変化は、4週目、10週目、20週目にWBPとドップラー超音波(DU)を介して縦断的にモニターされました。このアプローチは、LUAD の病態生理学と治療戦略に関する新たな洞察を提供することを目的としています。

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プロトコル

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この研究に記載されているすべての動物実験は、成都中医薬大学の動物福祉に関する倫理委員会によって承認され、動物研究倫理に関する関連法および基準(20240616IV)に準拠して実施されました。雌の近交系A/JGptマウス(7-8週齢)は、20-24°C、相対湿度40%-70%に維持されました。12時間の明暗サイクル全体を通して、マウスに標準的な動物飼料と精製水を与えました。動物たちは、実験開始の7日前にこの環境に順応しました。

1. 動物モデルの作成と準備

  1. NNKを生理食塩水に溶解し、10 mg/mLの濃度の原液を調製します。
  2. 4週目(モデリング後28日目)、10週目(モデリング後70日目)、および20週目(モデリング後140日目)にWBPを使用して肺機能を測定します。肺動脈血流速度は、20週目(モデリング後140日目)にDUを使用して測定されました。各測定の前に、ストレスを最小限に抑えるためにマウスを適切な環境に置いてください。

2. 非侵襲的肺機能検査

注:WBPシステムは、特別に設計された測定チャンバーを使用して、覚醒して自由に動く動物の呼吸機能を測定します。チャンバーにはニューモタックスクリーンが取り付けられており、空気がチャンバーに出入りするのを防ぎます。ニューモタックスクリーンによって生じる空気抵抗は、周囲の空気に対してチャンバー内の小さな圧力変化を引き起こします。高感度圧力トランスデューサが接続され、チャンバー内のこれらの圧力変化を測定し、そこから流れを引き出すことができます(ボックスフローと呼ばれます)。このソフトウェアは、流量や体積などの呼吸器パラメータとリアルタイムのレポートを提供します。

  1. WBPコントローラー、コントローラー電源トランス、コンソールバー、長いコンソールバーケーブルと短いコンソールバーケーブル、キャリブレーターカラム、WBPプレチスモグラフ、フロートランスデューサー、温度と湿度プローブ、ネブライザーヘッド(紫)、バイアスフローフィルターとチューブ、PCの主要コンポーネントを入手します。
  2. 以下の説明に従ってハードウェアを組み立てます。
    1. 後述するように、リアパネル接続を行います。
      1. コントローラーユニットをUSB2.0ケーブルでコンピューターに接続し、接続が安定していることを確認します。
      2. 給水ラインまでカラムに水道水を入れ、コントローラーの背面にあるポートに接続して、ラインが乾いていることを確認します。
      3. 電源トランスをコントローラーの背面に差し込み、しっかりと接続されていることを確認します。
      4. コンソール ストリップを配置する場所に応じて、コントローラーの背面に接続するための長いまたは短いコンソール ストリップ ケーブルを選択します。
      5. コントローラーユニットを所定の位置に押し込み、キャリブレーションカラムと電源トランスを配置します。
    2. フロントパネルを以下の手順で接続します。
      1. 各フローセンサーをセンサーというラベルの付いたポートに差し込みます。各バイアスフローフィルターとチューブを、フロントパネルのバイアスフローというラベルの付いたコントローラーポートに差し込みます。バイアスフローアイソレーション抵抗をバイアスフローチューブの開放端に接続します。
    3. 以下に説明するようにチャンバー接続を実行します
      1. チャンバーをコントローラーユニットの前に置き、振動のない堅固で安定した表面に配置されるようにします。
      2. フローセンサーをチャンバーに接続し、DSIサインが上を向くようにセンサーを向けます。
      3. バイアスフローチューブ(絶縁抵抗付き)をプレチスモグラフの下部ポートに接続します。
      4. プレチスモグラフの上部にあるプラグを取り外し、ネブライザーヘッド(紫色)と交換します。
  3. 以下の説明に従ってソフトウェアをセットアップします。
    1. 制御プログラムソフトウェアを起動してログインします。コントローラのホームページで、[ Hardware Configuration] をクリックします。 「新規構成」をクリックして構成ウィザードを起動し、「 WBP 」(シリアル番号:DEMO-061)を選択して 「次へ」をクリックします。
    2. [Species] ドロップダウンメニューで、[ Mouse] を選択します。流量をデフォルト値に設定します。 4つのサイト を選択します(各サイトは1つのチャンバーに対応し、セッションごとに最大4つのチャンバーがあります)。すべてのアクティブサイトのバイアス流量が一貫していることを確認します。ソフトウェア内のサイトを WBP コントローラの実際のポートと一致させます。最後に、[ 完了] をクリックして構成を完了します。
  4. データ収集
    1. メインプログラムを開き、チャンバーをキャリブレーションします(この手順は重要です)。ハードウェアの上にマウスを置くと、黄色のツールアイコンが表示されます。アイコンをクリックしてキャリブレーションインターフェースに入り、 次に「すべて 」をクリックして4匹すべての動物のチャンバーを同時にキャリブレーションします。
    2. 「Create Study Options」で 「Dose Response Study 」を選択して、必要な治験プロトコルを作成します。 GLP 設定に GLP に従わないように設定します。
    3. 測定パラメータとタスクシーケンスを設定するには、[ 新規パラメータ] をクリックしてパラメータビルダを開き、測定するパラメータを追加します。タスク シーケンスの既定の設定を使用します。
    4. データ収集を開始するには、ワークステーションの My Laboratory ページに移動し、準備した研究プロトコルをWBP for mouseにドラッグアンドドロップします。
    5. 各サイトの赤い三角ボタンをクリックして、データ取得を開始します。4 つのサイトすべてを同時に開始するには、[ セッション] > [すべてのサイトの確認] をクリックします。取得を開始すると、ワークステーションは[取得の構成]ページを開き、これを使用して取得サイトの各マウスの情報を編集します。
    6. 順番に「 セッション」>「すべてのサイトを確認」 をクリックして、データ収集を開始します。実験結果が真実で信頼性があることを確認するには、事前に実験マウスを静かな部屋で30分間安定させてください。
    7. 静かなマウスを完全に密閉されたテストジャーに入れます。システムの「 開始 」オプションをクリックして、データを収集します。システムは 2 秒ごとにデータを収集するため、少なくとも 10 分収集します。中央で 4 分間のデータをインターセプトします。ここでは、各グループで5匹の動物を試験し、この試験を3回繰り返しました。
    8. [スタディ]ページで [レポートの作成 ]をクリックし、レポートタイプを選択します。実験データをスプレッドシート形式で保存します。この実験では、ピーク呼気流量(PEF)、ピーク吸気流量(PIF)、増強休止(Penh)、および一回換気量(TV)を使用して、マウスの肺機能を評価しました。

3. 肺動脈血流速度測定

  1. 動物の調理法
    1. マウスを麻酔導入チャンバーに置き、5%イソフルラン(流量:1 L / min)で麻酔します。マウスを動物取り扱いプラットフォームに固定し、プラットフォームの温度を35〜37°Cに維持して体温を維持します。
    2. マウスの口と鼻を麻酔マスクに入れます。1%-2%イソフルラン(流量:0.6-1 L / min)で麻酔を維持します。マウスが安定した心拍数と規則的な呼吸リズム、完全な筋肉弛緩、手足の動きの欠如、振動のけいれん反応なし、ペダル離脱反射の消失、ピンク色の粘膜、および瞳孔拡張のない安定した仰臥位を維持した場合、マウスは適切な麻酔深度に達したと考えられます。
    3. この段階で、滅菌綿棒を使用して、2〜3 mgの獣医軟膏を下部結膜嚢に塗布します。上まぶたと下まぶたをやさしくなでると、眼球が圧迫されることなく閉鎖が促進され、軟膏が角膜表面全体に均一に分布します。
  2. イメージングエリアの準備
    1. 脱毛クリームと脱毛器具を使用して胸毛を取り除きます。.湿らせたガーゼまたは濡れたティッシュで治療部位を清掃し、37°Cに予熱したカップリング剤を綿棒で均一に塗布して、目に見える気泡のない0.3mmの均一な厚さを実現します。
  3. ドップラー超音波画像診断
    1. 40 MHzドップラー超音波プローブを使用して、胸骨傍長軸ビューから肺動脈血流速度を測定します。プローブを左に45°、手術台を右に15°傾けます。胸部の右側からプローブを下げ、X軸とY軸を微調整して、解剖学的空間関係、形態学的特徴、血行動態の流れ方向に基づいて、右心室と肺動脈を特定します。
    2. CFボタンを押してドップラーモードに切り替えます。青色の肺動脈血流信号を視覚化します。サンプリングラインを肺動脈に配置し、PWボタンを押して肺動脈血流スペクトルを表示します。
    3. フリーズボタンを押して画像をフリーズし、次に測定ボタンを押してタッチスクリーンのベロシティオプションを選択します。測定ラインをスペクトルのピークに配置して、最大肺動脈血流速度を取得します。
  4. データ集録
    1. オフライン解析ソフトウェアを使用して、肺動脈パルスドップラーデータを選択します。Cardiac Package測定パックにアクセスし、 RVおよびPV機能を選択し、肺動脈血流速度と保存された画像を出力します。

4. データ分析

  1. R4.4.2とGraphPad Prism 9.5.1を使用してデータ解析を行い、データをプロットします。肺機能データのグループ間比較は、独立したサンプルのt検定を使用して実行されましたが、グループ内比較では、反復測定ANOVAを利用しました。グループ間の肺動脈血流速度の比較は、独立したサンプルで分析されました t検定、統計的有意性はp < 0.05に設定されました。

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結果

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肺機能および肺動脈血流評価法の実現可能性、精度、再現性を検証するために、ブランクグループの4週目のモニタリング期間中の肺活量の50%(EF50、10倍拡大)でのPIF、PEF、および呼気流量の分単位平均曲線をプロットしました(図1A)。このパネルに示すように、対応する 3 つの曲線は、形状の一致度が高いことを示しています。特にEF50では、絶対的な変化が最小限に抑えられたにもかかわらず、これらの変動は依然として捕捉されており、マウスの主要な呼吸パラメータの収集におけるWBPの高い感度を示しています。これら 3 つのパラメーターは独立しており、他のインデックスを使用して計算する必要はありません。PIFとPEFは主に全体的な気道機能と気流速度を反映していますが、EF50は小さな気道機能の評価に重点を置いています14。PEFは通常、呼気中に肺と胸部の筋肉が急速に収縮すると大きな圧力差が発生し、空気が急速に排出されるため、最も高くなります。対照的に、PIFは一般的にPEFよりも低く、吸気は比較的小さな圧力差で胸部の拡張を伴い、肺の弾性反動...

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ディスカッション

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本研究では、NNKとA/Jマウスを併用して、これまでの報告に従って肺腺がんモデルを作製しました。関連する研究では、NNK と A/J マウスを組み合わせると、10週目に腫瘍形成が最小限に抑えられ、16週目から 20週目に安定した腫瘍形成が始まることが示されています18,19。そこで、腫瘍発生初期における肺機能と肺動脈血流の変化を観察するために注射後4週目の検査を選択し、腫瘍発生初期におけるマウスの検出指標の変化を評価するために10週目から継続して検査を行い、最後に20週目に腫瘍発生の安定段階で検査を行い、結果を客観的に比較しました3つのテストのうち。

この研究では、WBP技術とドップラー超音波を組み合わせて、NNK誘発LUADマウスモデルで腫瘍進行中の肺機能の動的変化を...

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開示事項

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著者は何も開示していません。

謝辞

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成都中医薬大学基礎医学部のCong Huang教授のご支援に感謝いたします。本研究は、Sichuan Science and Technology Program(プロジェクト承認番号:2024YFFK0173)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
A/JマウスGemPharmatech LLC.
0.5ml EDTAチューブLabshark 
1-ブタノン、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジニル)Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.
N589770 75%エタノールChengDu Chron Chemicals Co、。Ltd2023052901
麻酔導入室Shanghai Tawans Intelligent Technology Co., Ltd.MZ-MR
脱毛クリームShanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.
脱毛装置Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.3180
イソフルラン上海Dumaバイオテクノロジー株式会社DM-M9462
医療用テープ北京蓮昌技術有限公司19-5023
医療用トリコーダーMedChemexpress69652
PBS 緩衝液Shanghai Fusheng Co., Ltd.A-RY5256
生理食塩水(薬)北京バイオラボテクノロジー株式会社GL1736‌
超音波カップリング剤Qisheng(Shanghai)Medical Equipment Co.、Ltd.
N0000181302010702023062320212060273

参考文献

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  1. Melocchi, V., et al. Aggressive early-stage lung adenocarcinoma is characterized by epithelial cell plasticity with acquirement of stem-like traits and immune evasion phenotype. Oncogene. 40 (31), 4980-4991 (2021).
  2. Cardoso, D., Painho, M., Roquette, R. A. A geographically weighted regression approach to investigate air pollution effect on lung cancer: A case study in Portugal. Geospat Health. 14 (1), (2019).
  3. Cockburn, M. G., Wu, A. H., Bernstein, L. Etiologic clues from the similarity of histology-specific trends in esophageal and lung cancers. Cancer Causes Control. 16 (9), 1065-1074 (2005).
  4. Liu, B. D., et al. Expert consensus on image-guided radiofrequency ablation of pulmonary tumors: 2018 edition. Thoracic Cancer. 9 (9), 1194-1208 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Club cells employ regeneration mechanisms during lung tumorigenesis. Nat Comm. 13 (1), 4557(2022).
  6. Yang, M., et al. Alveolar type I cells can give rise to KRAS-induced lung adenocarcinoma. Cell Rep. 42 (12), 113286(2023).
  7. Roche, O., et al. Identification of non-coding genetic variants in samples from hypoxemic respiratory disease patients that affect the transcriptional response to hypoxia. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9315-9330 (2016).
  8. Zhai, R., Yu, X., Shafer, A., Wain, J. C., Christiani, D. C. The impact of coexisting COPD on survival of patients with early-stage non-small cell lung cancer undergoing surgical resection. Chest. 145 (2), 346-353 (2014).
  9. Chang, W. H. Complete spontaneous resolution of a giant bulla without rupture or infection: a case report and literature review. J Thoracic Dis. 9 (6), E551-E555 (2017).
  10. Wang, X., et al. SAA suppresses α-PD-1 induced anti-tumor immunity by driving TH2 polarization in lung adenocarcinoma. Cell Death Dis. 14 (11), 718(2023).
  11. Best, S. A., et al. Distinct initiating events underpin the immune and metabolic heterogeneity of KRAS-mutant lung adenocarcinoma. Nat Comm. 10 (1), 4190(2019).
  12. Fujimoto, J., et al. Development of Kras mutant lung adenocarcinoma in mice with knockout of the airway lineage-specific gene Gprc5a. Int J Cancer. 141 (8), 1589-1599 (2017).
  13. Zhang, D., et al. Reducing radiation dose to selected organs by selecting the tube start angle in MDCT helical scans: a Monte Carlo based study. Med Phys. 36 (12), 5654-5664 (2009).
  14. Yang, X. X., et al. Pharmacological effects of Bufei Jianpi granule on chronic obstructive pulmonary disease and its metabolism in rats. Front Pharmacol. 13, 1090345(2022).
  15. Hankinson, J. L., Odencrantz, J. R., Fedan, K. B. Spirometric Reference Values from a Sample of the General U.S. Population. Am J Resp Crit Care Med. 159 (1), 179-187 (1999).
  16. Quindry, J. C., Ballmann, C. G., Epstein, E. E., Selsby, J. T. Plethysmography measurements of respiratory function in conscious unrestrained mice. J Physiol Sci. 66 (2), 157-164 (2016).
  17. Rivera, D. A., Buglione, A. E., Ray, S. E., Schaffer, C. B. MousePZT: A simple, reliable, low-cost device for vital sign monitoring and respiratory gating in mice under anesthesia. PloS One. 19 (3), e0299047(2024).
  18. Song, M., et al. Dietary 5-demethylnobiletin inhibits cigarette carcinogen NNK-induced lung tumorigenesis in mice. Food Function. 8 (3), 954-963 (2017).
  19. Upadhyaya, P., Kenney, P. M., Hochalter, J. B., Wang, M., Hecht, S. S. Tumorigenicity and metabolism of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol enantiomers and metabolites in the A/J mouse. Carcinogenesis. 20 (8), 1577-1582 (1999).
  20. Hu, P., et al. Haemoptysis as a prognostic factor in lung adenocarcinoma after curative resection. British J Cancer. 109 (6), 1609-1617 (2013).
  21. Popper, H. Primary tumor and metastasis-sectioning the different steps of the metastatic cascade. Transl Lung Cancer Res. 9 (5), 2277-2300 (2020).
  22. Jin, C., et al. Commensal Microbiota Promote Lung Cancer Development via γδ T Cells. Cell. 176 (5), 998-1013.e16 (2019).
  23. Zhao, S., et al. Clinical manifestations of pulmonary mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma: single-center experience with 18 patients. OncoTargets Ther. 11, 555-561 (2018).
  24. Liu, C. H., et al. Lipopolysaccharide-Mediated Chronic Inflammation Promotes Tobacco Carcinogen-Induced Lung Cancer and Determines the Efficacy of Immunotherapy. Cancer Res. 81 (1), 144-157 (2021).

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