研究記事

CDCA誘発性HepG2細胞損傷におけるゲンチオピクロシドの保護効果の集学的評価

DOI：

10.3791/68320

⸱

2025年7月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 4Institute of High Altitude Multimorbidity/TCM-Integrated High Altitude Medicine Center, Hospital of Chengdu University of TCM, 5Chengdu Tianxing Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd.

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、ゲンチオピクロシドが胆汁酸と脂質の生成と代謝を制御し、酸化ストレスと炎症反応を防ぐことにより、胆汁うっ滞性肝障害を治療できることを実証しました。

要約

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Swertia chirayita の主要な有効成分であるゲンチオピクロシド (GPS) は、胆汁うっ滞の症例で肝臓を保護することが示されています。胆汁うっ滞性肝障害に対するGPSの保護メカニズムを解明するために、HepG2細胞をケノデオキシコール酸(CDCA)で処理してin vitroで胆汁うっ滞環境をシミュレートし、CCK-8法を使用してHepG2細胞に対するGPSの保護効果を決定しました。生物学的キットを使用して、細胞内TBA、T-CHO、TG、ALP、ALT、AST、GSH、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、およびMDAの含有量を検出しました。共焦点レーザー顕微鏡を使用して、ROS のレベルを確認しました。HepG2 細胞の SHP-2、Tgr5、CYP7A1、および NTCP の発現は、免疫蛍光およびウェスタンブロット分析を使用して評価されました。次に、Autodockソフトウェアを使用して、その主な有効成分の分子ドッキングを検証しました。この知見は、GPSがCDCAがHepG2細胞に与えた損傷を大幅に防ぐことを実証しました。この保護効果は、細胞内の胆汁酸と脂質の生成と代謝を制御し、酸化ストレスと炎症反応を防ぐことによって達成された可能性があります。

概要

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体の消化器系の代謝部位は肝臓です。胆汁分泌は、肝胆道系の脂肪異化プロセスにおける重要なメカニズムです。胆汁の主成分である胆汁酸は肝細胞から放出され、脂肪代謝の平衡を維持するために重要です。健康な人と病気の症例の両方にとって、肝臓の生理学的および病理学的プロセスは、肝臓内の遊離胆汁酸と抱合胆汁酸のバランスに依存します。この平衡が崩れると、胆汁酸循環が正常に機能しなくなり、肝内胆汁うっ滞とその後の肝障害につながる可能性があります1。すでに実施された研究によると、胆汁うっ滞性肝障害 (CLI) は、代謝障害、腸内細菌叢の不均衡、肝細胞壊死に関連する状態です2。これは、胆汁の流れの妨げと、CLI の肝細胞内の胆汁酸の蓄積によって引き起こされます。CLI の重症例は、肝硬変、肝線維症、および肝不全に進行する可能性があります3。現在、CLI の根底にあるメカニズムはまだやや不明確で複雑であり、大多数の患者は薬物療法4 による有効性が低く、重大な副作用5 も受けています。その結果、今日医学界が直面している最も差し迫った問題の 1 つは、効果的な CLI 薬の探索です。

現在の研究では、胆汁酸の代謝におけるいくつかの核内受容体の重要性が実証されています6。これらの中で、胆汁酸受容体は、BAに結合し、タンパク質チロシンホスファターゼ(SHP)を活性化する可能性のある胆汁酸の重要な調節受容体です7。一方、肝細胞に BA が過剰に蓄積して胆汁うっ滞を引き起こすと、SHP 受容体が悪影響を受け、CYP7A1 (シトクロム P450 7A1) 受容体が活性化され、胆汁酸8 の生成が引き起こされます。さらに、G タンパク質共役胆汁酸受容体 TGR5 の BA 分泌をブロックし、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド (NTCP) 受容体を刺激して BA を輸送しました。肝細胞に胆汁酸が蓄積し、肝臓に損傷を与えます9.したがって、このメカニズムに関する追加の研究により、より実行可能な CLI 治療オプションが明らかになる可能性があります。

医学での長い使用の歴史を持つスワーティア・チライタは、中国の伝統的なチベット医学です。それは最高のティダと見なされており、胆嚢や肝臓の状態を治療するために地元の人々によって頻繁に使用されます10。胆石、胆嚢炎、肝硬変、肝炎、その他の肝疾患の治療によく使用されます11。最近の研究により、Swertia の一部のイリドイド化学成分とその有効成分が、肝線維症や急性肝障害などの肝疾患に優れた治療効果があることが明らかになりました 12,13,14。Swertia chirayitaの有効成分は、炎症15とその抗酸化特性16を低下させることにより肝疾患を緩和します。私たちの予備研究では、Swertia chirayita を主成分とするチベット薬化合物処方が CLI に対して好ましい治療効果を示すことが実証されており、Swertia chirayita が CLI17 の治療薬としての可能性を秘めていることが示唆されています。Swertia chirayitaから抽出および精製される主な有効成分はGPS(ゲンチオピクロシド)18であり、肝臓保護19、グルコース代謝調節20、腸内細菌叢の改善21、抗腫瘍特性22などの多くの薬理作用を持っています。以前の研究では、GPS が胆汁うっ滞状態における肝障害を改善し、胆汁酸トランスポーターの発現をアップレギュレートすることにより肝内胆汁うっ滞を減少させることが実証されています23,24。これと同様に、in vivo と in vitro の両方で実施された研究では、GPS が脂質代謝を促進し、炎症を軽減し、酸化ストレスを軽減することにより、肝臓の損傷を軽減できることが実証されています25,26。

HepG2 細胞は、肝細胞代謝酵素活性を示すため、肝疾患の in vitro 研究で頻繁に利用されます27。その間、肝細胞は、CDCA28 を含む 4 つの形態の遊離胆汁酸のいずれかにさらされると、より多くの胆汁を分泌する可能性があります。その結果、CDCA を使用して胆汁うっ滞性肝損傷の細胞モデルを作成し、 in vitro で胆汁うっ滞環境を模倣することができます。CDCA 誘発性肝細胞損傷が酸化ストレスと炎症経路によって決定的に媒介されることを考えると、他の肝臓の状況における GPS の抗酸化作用と抗炎症効果が文書化されていることを考慮すると26、GPS は HepG2 細胞における CDCA 誘発性細胞毒性を軽減することにより、胆汁うっ滞性肝損傷に対する保護を与える可能性があるという仮説を立てます。この研究では、CDCAによるHepG2細胞への損傷のモデルを使用して、CLIに対するGPSの保護効果とその分子メカニズムを調査しました。

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プロトコル

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細胞培養と治療
HepG2細胞とMEMメディアは、市販ベンダーから購入しました。HepG2細胞は、10%FBS、1%100 U/mLペニシリン、および100 U/mLストレプトマイシンを添加したMEM培地で、37°Cおよび5%CO2 雰囲気で増殖させました。細胞接着後、培地を交換しました。細胞を2〜3日後に1:3の比率で培養し、細胞培養が80%のコンフルエントに達したら実験に利用しました。

細胞生存率アッセイ
1日目に、細胞を96ウェルプレートに2 x 10 4 HepG2細胞(2 x 105細胞/ mL、ウェルあたり100 μL)に6回繰り返し29で播種しました。2日目、接種の24時間後、細胞を異なる濃度のCDCA(0、20、40、60、80、100 μM)でCDCAで12時間処理しました。細胞生存率はCCK-8法で検出した。最初の細胞播種の24時間後、細胞を異なる濃度のGPS(0、25、50、100、200、400、および800μM)でCDCAで24時間処理しました。3日目に、CCK-8法により細胞生存率を検出しました。4日目に、2 x 104 HepG2細胞(2 x 105細胞/ mL、ウェルあたり100 μL)を96ウェルプレートに6回繰り返し24時間播種しました。5日目に、細胞を6つのグループに分離します:コントロール、モデル、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、およびGPS:25 μM、50 μM、および100 μM。対照群を除き、60 μM CDCA溶液をすべてのグループに12時間添加しました。次に、UDCA溶液(60 μM)とGPS溶液(25 μM、50 μM、および100 μM)をそれぞれUDCAおよび3つのGPSグループに24時間添加しました。6日目に、CCK-8法により細胞生存率を検出しました。

サイトカインアッセイ
報告された文献によると、TNF-α、IL-6、およびIL-1βキットを使用して、さまざまな処理後のHepG2細胞の炎症因子のレベルを検出しました30。CDCAまたはCDCA + GPS介入の24時間後、培地を廃棄し、PBSですすいでください。細胞懸濁液を69 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞沈殿物を取ります。PBS溶液を加え、氷水浴条件下でホモジネーションして細胞ホモジネートを調製します。10,005 x g 、4°Cで10分間遠心分離した後、上清を除去し、BCA法を使用して細胞内容物中の総タンパク質を測定しました。製造元の指示に従って、細胞上清中のTNF-α、IL-6、およびIL-1βのレベルはELISAによって測定されました。吸光度は、多機能マイクロプレートリーダーを使用して450 nmで測定されました。

TBA、TG、T-CHOの検出
TBA、TG、および T-CHO テストは、キットの指示に従って利用され、HepG2 細胞の胆汁酸と脂質代謝が同定されました31。TBA、TG、T-CHOは市販で購入した。細胞沈殿物を氷水浴中で超音波で分解した後、ライセートRIPAを30分間添加して細胞ホモジネートを調製した。吸光度は、多機能マイクロプレートリーダーを使用して450 nmで測定されました。各ウェルにBCA作業溶液を添加し、細胞を均質化した後、酵素レターを使用して吸光度を562 nmで測定し、インキュベーション期間を30分標準製品の吸光度を使用して標準曲線を作成し、次の式を使用して吸光度値を取得しました。
TBA含有量(μmol/gprot)=(サンプル-Aブランク)/(標準Aブランク)×C校正/Cpr
T-CHO、TG 含有量 (mmol/gprot) = (サンプル - Aブランク)/(A標準 - Aブランク)×C標準/Cpr

肝機能の評価
肝機能は、ALT、AST、ALP を使用して評価されました。ALT、AST、ALP は商業的に購入されました。採取した細胞を2回PBS緩衝液洗浄した後、細胞を69 x g で10分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を沈殿させ、PBS緩衝液を添加し、氷水浴中で超音波粉砕によってホモジネートを作成しました。次に、テストホールとコントロールホールが設定されました。操作台に従い、試薬を加え、ホールプレートを軽く振って混合し、室温で15分間放置しました。各穴のOD値は、波長505nmの酵素剤を使用して決定されました。次に、絶対OD値を標準曲線に入力し、式を使用して追加の定量分析を実行しました。

SOD、MDA、GSH活性の決定
SOD活性、MDA含有量、GSH含有量は、それぞれ製造元の指示に従って評価されました。SOD、MDA、GSHは商業的に購入されました。簡単に言うと、細胞を接種するために6ウェルプレートを使用しました。処理後、細胞はキットの実験指示に従って前処理(収集と破壊)を受けました。次に、指示の操作手順に従ってブランク穴、標準穴、および測定穴を設定した後、適切な作業溶液を細胞検出プレートに注ぎました。その後、細胞はキットの説明書に記載されている温度と期間で培養されます。次に、BCA検出キットを使用してタンパク質含有量を定量しました。最終的に、適切な波長で吸光度を測定し、酸化ストレス指数のより徹底的な定量分析を実施しました。

DCFH-DAプローブを用いたHepG2細胞におけるROSの変化の検出
細胞数のルーチン培養を実施しました。密度が1×10のHepG2細胞を5細胞/ mLにそれぞれ1.5mLずつガラス底皿に接種し、上記の方法に従って培養した。培養後、培地を廃棄し、細胞をPBSで洗浄しました。DCFH-DAを1:1000の濃度に希釈し、ウェルあたり1.5 mLの希釈液で添加し、20分間インキュベートしました。インキュベーション後、細胞をMEM塩基性培養液で3回すすぎました。次に、DAPIを含む100 μLの退色防止封入剤を各皿に添加しました。蛍光共焦点顕微鏡を使用して、励起の場合は 488 nm、発光の場合は 525 nm で観察および写真を撮影しました32。

免疫蛍光イメージング
細胞をインキュベーション後にPBSバッファーで3回洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した後、振動台上でPBSバッファーを使用して細胞を洗浄しました。希釈剤を加え、4°Cで光を避けて一晩冷蔵した。その後、細胞を蛍光希釈剤でコーティングし、37°Cで光から1時間インキュベートしました。 インキュベーション後、細胞をPBSバッファーで3回洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで30分間固定した後、細胞をロータリーシェーカーでPBSバッファーですすいだ。続いて、150 μLの一次抗体希釈液を添加し、光保護条件下で4°Cで一晩インキュベートしました。一次抗体希釈液を回収し、続いて適切な量のPBSバッファーを添加し、5分間振とうしました。この洗浄手順を3回繰り返しました。次に、各皿に150 μLの蛍光二次抗体希釈液を投与し、光保護インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートしました。適切な量のPBSバッファーを各皿に加え、ロータリーシェーカーで8分間洗浄し、3サイクル繰り返しました。最後に、細胞を十分なDAPI染色液で10分間覆い、退色防止敷地をマウントし、超解像イメージングシステム33を使用して画像化した。

ウェスタンブロット分析
さまざまな処理の後、Ripa ライセートを使用して HepG2 細胞の全タンパク質を抽出し、BCA 技術を使用してタンパク質濃度を確認しました。10%SDS-PAGEを用いて標的タンパク質を単離した後、0.45μmのPVDFメンブレンに転写した。その後、膜を5%BSAを使用して25°Cで1.5時間密封した。SHP-2(1:1000)、CYP7A1(1:1000)、Tgr5(1:1000)、NTCP(1:1000)、およびβ-アクチン(1:1000)に対する一次抗体を4°Cで一晩インキュベートしました。 次に、メンブレンを西洋わさびペルオキシダーゼと結合させたヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG二次抗体(1:10000)と25°Cで2時間インキュベートした。 次に、ペルオキシダーゼでコーティングされたバンドを超高感度ECL化学発光溶液を用いて見られ、画像はイメージングシステム34を用いて撮影された。

分子ドッキング
報告されているように、分子ドッキングプロセスは、以下の手順35に従って実行された。薬物の小分子.mol2構造はChemicalBookプラットフォームからダウンロードされ、リガンドタンパク質.sdf構造はUniprotおよびRCSBPDBプラットフォームからダウンロードされました。リガンドと水分子はPymolソフトウェアによって除去され、リガンドタンパク質は水素化と検出のためにAutoDockソフトウェアにインポートされました。最終的な出力は .pdbqt 形式です。ドッキング ボックス、RunAutoGrid、RunAutoDock、および AutoDock ツール解析を AutoDock ソフトウェアで実行し、ドッキング結果の各グループの最小結合エネルギーを保存しました。各グループの自由結合エネルギーが最も低いコンフォメーションを選択し、そのリガンド受容体コンフォメーションをPymolソフトウェアで視覚化しました。

統計分析
前述のデータは、GraphPad Prism 9.2を使用して統計的にソートされ、すべての実験結果は平均±SDとして報告されました。グループ間のデータを統計的に比較するために、一元配置分散分析が採用されました。2 つのグループ間の差は、p が 0.05 <ときに有意であると見なされました。

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結果

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実験用に、CDCAの濃度を0 μM、20 μM、40 μM、60 μM、80 μM、および100 μMの濃度勾配に設定しました。CDCAの濃度が60μMの場合、細胞活性は対照群と有意に異なり、最終的にCDCAの濃度として60μMを使用しました(図1A)。結果は、薬物投与後24時間のインキュベーション後、各グループと対照グループの間で細胞活性に有意差がないことを示し(図1B)、GPSが800μMの濃度内で細胞活性に阻害効果を示さなかったことを示しています。最後に、25 μM、50 μM、および100 μMの3つの濃度を選択して、関連する文献20に従って後続の実験を完了しました。HepG2細胞を60μM CDCAで12時間誘導し、次にUDCAおよび異なる用量のGPSで24時間培養し、HepG2細胞生存率の変化を測定しました(図1C)。対照群と比較して、モデル群の細胞生存率は有意に低下しました (p < 0.05...

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ディスカッション

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CLI は、胆汁の形成、分泌、または排泄の閉塞によって引き起こされる肝疾患です。臨床的にはそう痒症、骨粗鬆症として現れ、肝線維症、肝硬変、その他の疾患に発展し、生命と健康を深刻に危険にさらします36,37,38。UDCA は、CLI39 の治療で最も一般的に使用される薬剤として認識されています。しかし、臨床現場では UDCA に対する反応が不十分な患者が多数いるため、近年、FXR 受容体アゴニスト (オベチコール酸40、シロフェキサー41)、FGF19 類似体 (アルダフェルミン) 42、および TGR5 アゴニスト (INT-767)43 は、胆汁...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、四川省自然科学基金 (2024NSFSC0697)、成都中医薬大学 (LH202402015) の共同イノベーション基金プロジェクトの支援を受けています。

著者の貢献:
Caitong Wu:方法論、形式的分析、データキュレーション、原案の作成、執筆と編集。Yang Xiao: 概念化、調査、視覚化、および検証。Fuhan Fan: 検証と編集。Zhangli Lei、Xianhua Zhou、Xianli Meng:編集と翻訳。Yong Zeng、Hou Ya、Peng Shen:概念化、方法論、検証、調査、草案のレビューと修正、および監督。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ALP南京建城生物工学研究所A059-2-2
ALT南京建城生物工学研究所C009-2-1
AST南京建城生物工学研究所C010-2-1
BCABoster Biological Technology Co., LtdAR0146
CDCAChengdu Medesheng Technology Co., Ltd474-25-9
細胞計数キット-8Boster Biological Technology Co., LtdAR1160-500
シトクロム P450 7A1 抗体Abmart Shanghai Co.,Ltd.TD2612S
DAPIBeyotime BiotechnologyC1005
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
ヤギ抗ウサギ IgG (H&L)成都禅生物科学有限公司511202
ギ抗ウサギIgG AF488Abmart Shanghai Co.,Ltd.M21012M
GPS成都 Medesheng Technology Co., LtdRP210717
GSH南京建城生物工学研究所A006-2-1
HepG2 細胞Procell Life Science &Technology Co., LtdCL-0103
HRP ヤギ抗ウサギ IgG武漢 ABclonal バイオテクノロジー株式会社 AS014
IL-1&ベータ;Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0149c
IL-6Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H6156
MDA南京建城生物工学研究所A003-1-2
MEM ベース培地Procell Life Science &Technology Co., LtdPM150410
PBSBoster Biological Technology Co., Ltd PYG0021
高速転写バッファー (20×)NCM BiotechWB4600
RIPABoster Biological Technology Co., LtdBL651A
ROSBeyotime BiotechnologyS0033S
SHP2 ウサギ pAb武漢 ABclonal バイオテクノロジー株式会社 A12486
SLC10A1抗体Abmart Shanghai Co.,Ltd.PU276166S
SOD南京建城生物工学研究所A001-3-1
未定南京建城生物工学研究所E003-2-1
T-CHO南京建城生物工学研究所A111-1-1
TG南京建城生物工学研究所A110-1-1
TGR5 ポリクローナル抗体ImmunoWay Biotechnology CompanyYT4636
TNF-& アルファ;Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0109c
トリプシン溶液 (0.25%)Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd40126ES60
UDCAChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDX007601
β-Actin Rabbit mAbWuhan ABclonal バイオテクノロジー株式会社 AC026
ヤ

参考文献

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