成体Xenopusにおけるアクセシブルな組織を包括的にサンプリングするための効率的な技術

サマリー

これは、 包括的なXenopus サンプリングプロトコルのパート1です。サンプリングされた組織は、心室、動脈幹、左肝葉、胆嚢、肺、膵臓、脾臓、喉頭、食道、胃、腸、精巣、脂肪体、卵管、対腎臓、坐骨神経叢、皮膚、胸腺、および眼全体です。

要約

Xenopus は、脊椎動物の発生と疾患を研究するための重要なモデル生物として長い間存在し、細胞プロセスと遺伝子機能に関する深い洞察を提供してきました。胚 性アフリカツメガエルに関する情報は豊富にあるにもかかわらず、成体組織サンプリングの標準化された方法、特に定量的プロテオミクスのような最新のアプローチには大きなギャップが残っています。この研究では、成人 のXenopusの複数の組織の迅速、正確、効率的なサンプリングのための包括的なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、他の無尾動物と比較した微妙な解剖学的違いに関連する課題に対処し、カエルの解剖の経験が限られている人でも再現性を確保します。このプロトコールは、サンプルの鮮度を優先することにより、高品質の生化学分析に最適化されています。私たちは、1時間以内に最大18の組織を迅速に収集することを促進しています。さらに、この方法は灌流条件と非灌流条件に適用され、さまざまな実験ニーズに柔軟に対応できます。この研究は、 Xenopus laevis と tropicalis の重要な方法論的ギャップを埋めるだけでなく、同様の両生類モデルに技術を適応させる研究者にとって貴重なリソースとしても機能し、それによって比較生物学的および進化学的研究の範囲と信頼性を高めます。

概要

Xenopus は、マウス、ゼブラフィッシュ、その他のモデル生物に比べて、特に発生的および進化的な文脈でヒトの病気を研究するための独自の利点を提供します。その外部胚発生と大きくて操作が容易な胚は、マウスでは困難であり、内部で発生し、侵襲的な手順を必要とするリアルタイムの観察と実験的介入(組織移植、遺伝子編集など)を可能にします。さらに、 Xenopusの3室心臓と四肢は、先天性欠損症¹、四肢再生²、心臓発達³を研究するためのより直接的な進化の架け橋を提供します。マウスとは異なり、 Xenopus オタマジャクシは、哺乳類にはない再生プロセスをモデル化して手足や臓器を再生できるほか、水生生活段階により、環境や毒素の影響を非侵襲的に研究することができます。 Xenopus は、より迅速な育種、低コスト、および倫理的制約の少なさと組み合わせることで、哺乳類のシステムで再現するのが難しい器官形成とストレス応答のハイスループットで機構的な研究に優れています。

この論文は、Xenopus オタマジャクシ⁴ で利用可能なように、成体Xenopus組織の正確で再現性のある臓器サンプリングのための明確なガイダンスを提供することを目的としています。Xenopus成体の「デジタル解剖」⁵および「マイクロCTイメージング」⁶は利用可能ですが、Xenopus成体で一貫した臓器および組織サンプリングを達成することは、マウス^7,8,9などの他の成体モデルに提供される詳細な指示なしには依然として困難です。

6つの重要な組織のサンプルガイドが利用可能です^が10、Xenopusの特定の広範な解剖およびサンプリングガイドは現在利用できません。ラナ^sp.11には包括的な解剖ガイドが存在し、他の無尾類12にはさまざまな教室の解剖マニュアルが利用可能です¹²、しかし、サンプリング技術や両生類の解剖学に経験が浅い個人にとって、Xenopusと他の無尾類との間の微妙な違いにより、既存のリソースは一貫性のある複製可能な組織サンプリングには不十分です。

このガイドは、プロテオミクスと免疫化学のために組織の鮮度を優先するために作成されました。経験豊富なユーザーであれば、1人の個人から1時間以内にすべての組織を採取することができます。経験が不足している場合は、他の理由で安楽死させた標本でこのプロトコルを試してから、交換がより困難な動物を犠牲にすることをお勧めします。

プロトコル

すべての実験は、ハーバード大学医学部IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3)の規則および規制によって承認され、それに従って実施されました。サンプリング前に灌流プロトコル¹³ に従う場合は、ステップ2.3にスキップします。

1.調製(灌流なし)

1. 研究機関がこのプロトコルに記載されている安楽死技術を承認していることを確認してください。
2. 5 g / L MS-222(メタンスルホン酸トリカイン)と5 g / L重炭酸ナトリウム( 材料の表を参照)の溶液を準備します。.pHをチェックして、≥7であることを確認します。
   注:容積は、安楽死させる動物を完全に覆うために必要な容積よりも大きくなければなりません。
3. XenopusをMS-222溶液(ステップ1.2から)に入れ、動物を合計1時間¹⁴分沈めたままにして、一次安楽死を実行します。
4. 解剖面(トレイまたはフォームシート)を二次容器内の傾斜に置くか、血液の排出を容易にするために配置します。
5. カエルが溶液に1時間入ると、一次安楽死が完了します。カエルを取り除き、足をつまむことで痛みの反応の喪失を確認します。
6. サンプリング対象の動物の年齢(既知の場合)、性別、健康状態、および灌流されたかどうかを記録します。 Xenopus の重量を量り、必要な追加の測定を行ってからampleing。
7. カエルを仰向けに置き、前肢を体に近位に固定します(図1A)。
8. 解剖ハサミを使用して、皮膚を切り取り、正中線を上向きに切り取り、次に横方向に切り込み、2つのフラップを作ります。
9. linea albaを特定します(図1B)。鉗子を使用してalbaのlineaをつかみ、体腔から引き離します。はさみを慎重に使用して、筋肉組織を通じて頭に向かって切ります。キャビティ壁から2つのフラップを作成し、すべてのフラップを邪魔にならないように切断またはピンで留めます。
10. まだ鼓動しているはずの心臓を特定します。心臓に簡単にアクセスできない場合は、解剖ハサミを使用して烏口骨を減らします(図1B)。
    注:サンプリング前に心臓の鼓動が止まった場合、サンプルの鮮度が損なわれています。
11. 所望であれば、迅速灌流プロトコル⁹を完了する。

2. サンプリング

注:動物が灌流されている場合は、手順2.3にスキップしてください。すべてのマージンは約25mmである必要があります。鉗子とハサミはきれいに拭くか、サンプル間で交換する必要があります。すべての組織は、鮮度を最大限に高めるために、安楽死から1時間以内にサンプリングする必要があります。

1. トランスファーピペットを使用して、体腔を冷やしたPBSまたは0.7x PBS¹⁵ ですすいで、血液をきれいにし、視認性を維持します。
2. 細い心膜(図2A)を特定し、組織鉗子でぴんと張ってください。虹彩切除ハサミの先端を使用して、下にある組織を切らないように注意しながら、そっと穴を開けます。心膜を心臓の3つの心室から剥がします(図2B)。
3. 耳介が心室と動脈幹に接する場所で耳介を切って切り取ります。
4. 鉗子を使用して心室を頂点でつかみ、動脈幹と接する場所より下に切り込み、縁を残します(図2C)。
5. 拡大して心室を目視検査し、不要な組織が付着していないことを確認します。
   注:心室の中心には、明るい色のらせん弁組織が含まれる場合があります。これは保持することができます。灌流されていない動物では、心室の除去は二次安楽死(終末麻酔とも呼ばれます)と見なされる場合があります。
6. サンプリング後すぐに、実験のニーズに応じて、チルドPBSまたは0.7x PBSで組織サンプルをすすぎます¹⁵。
   注:灌流動物では、肝臓を除くすべての組織がきれいにすすぐことが期待されます。そうでない場合は、メモを作成する必要があります。灌流されていない組織では、すべてのすすぎ媒体は血液で飽和します。各組織をサンプリングした後、手順2.5〜2.6に従う必要があります。
7. 動脈幹が 2 つの大動脈幹 (外側大動脈とも呼ばれます) に分岐し、それぞれが 3 つの動脈弓に分かれていることがわかります (図 2D)。動脈幹をぴんと張って引っ張り、これらのアーチが分裂した直後に大動脈幹を切断します。
8. 肝臓の3つの葉を観察します(図3A)。左葉の唇(視聴者の右側)をつかみ、肝管と嚢胞管が見えるようにゆっくりと持ち上げます。これらのアタッチメントの下にあるローブの底部2/3をサンプリングします(図3B)。
9. 胆嚢を特定しますが、これは色が大きく異なる場合があります。胆嚢をつかみ、肝臓の右葉から引き離し、その付着を切断します(図3C)。破裂しない場合は、虹彩切除ハサミで破裂させます。
10. 肺の頂点をつかみ、ぴんと張って引っ張ります。肺胞のテクスチャに注意し、そのテクスチャがどこで終わり、気管支がどこから始まるかを決定します。このマージンでカットします(図3D)。肺が腹膜に癒合している場合は、慎重に取り外します。
11. 胚上皮と呼ばれる内臓腹膜の層に包まれている卵巣を特定します。ローブをそれぞれの側面に来るまでゆっくりと動かして、取り付け領域が見えるようにします(図4A)。これらのアタッチメントは、対になった腎臓に直接腹側にあります。はさみを使用して、卵巣を傷つけずに、腎臓にできるだけ近づけて卵巣を取り出します(図4B)。この過程で卵子が漏れ出た場合は、卵子を採取して洗い流してください。
    注:卵巣を取り外すと、メスのカエルの組織へのアクセスが良くなります。
12. 肝臓の前葉(正中葉とも呼ばれる)を検査し、腸間膜を介して胃と十二指腸にどのように接続しているかに注意してください(図3A および 図4C)。虹彩切除ハサミを使用して腸間膜と肝十二指腸靭帯を切断します。残りの肉質の塊は膵臓と総胆管です。
13. 膵臓と総胆管と肝臓の前葉への接続を切断し、マージンを残します。歯付き鉗子で胃をつかみ、組織鉗子で膵臓の一端をつかみます。拡大して、膵臓を胃からそっとからかいます(図4D)。
    1. 膵臓がきれいに剥がれない場合は、残りの膵臓組織を摘み取ります。あるいは、虹彩切除術のはさみと組織鉗子を使用して系統的に膵臓を切り離します。
       注: 総胆管に加えて、このサンプルには腸間膜と膵管が含まれることが予想されます。
14. 脾臓を特定し、腹膜への付着部を切断してサンプリングします(図4E)。
15. 残りの肝臓組織を取り出して廃棄します。.
16. もう一方の肺と、それらが喉頭に付着している残りの気管支を切除します。喉頭の下端をつかみ、空洞から持ち上げ始め、明らかな付着物が明らかになると切断します。
17. 喉頭が持ち上げられると、食道への付着が目立つようになります。湾曲した虹彩切除はさみを使用して、食道組織を慎重に剥がし、喉頭から切り離します(図5A)。次に、喉頭を引き下げて、口腔から切り取ります。明らかな添付ファイルをすべてカットします。
18. 胃と食道を区別する胃の湾曲と、胃と腸を区別する幽門の制限に注意してください(図5B)。胃の湾曲のすぐ前方にある消化管を切断し、胃を食道から分離します。
19. 口を開き、その屋根¹⁶の耳管の共有開口部を特定します。口を開けた状態で、食道を引っ張ってその付着に注意してください(図5C)。食道を空洞から持ち上げ、途中で透明なアタッチメントを切断します。耳管開口部のすぐ下にある頬腔から食道を切断します。
20. 胃をつかみ、十二指腸と出会う場所、幽門の制限で切ります(図5A、B)。
21. 結腸をぴんと張って引っ張り、総排泄腔にできるだけ近づけて切ります(図5D)。腸を引き抜き、透明な腹膜の付着物を切断します。
22. カエルがオスの場合は、精巣を特定し、虹彩切除はさみを使用して精巣を取り除き、下にある腎臓を傷つけないように注意します(図6A)。
23. 脂肪体をバラバラにして、それぞれの側にくるようにします。脂肪体が腹膜につながる腎臓の上の領域が見えます。いずれかの脂肪体の基部をつかみ、はさみを使用して腹膜から切り取り、マージンを残します(図6B)。
24. 膀胱を特定して取り外し、総排泄腔にできるだけ近づけます(図6C)。
25. カエルが雌であるか、はっきりとした痕跡卵管がある場合は、卵管の下端をつかみ、総排泄腔から引き離し、総排泄腔にできるだけ近づけて切ります(図6D)。体腔から卵管を引き出し、腹膜の付着物が明らかになったら切断します(図6E)。
26. 残りの脂肪体と精巣または卵管を取り外して廃棄します。
27. 鉗子を使用して腎臓を下基部でつかみ、透明な腹膜(後腹膜)で覆われていることに注意してください¹⁷。腎臓の基部で腹膜を切断し(図7A)、次に腎臓を体腔から持ち上げ(図7B)、必要に応じてハサミを使用して腹膜を切断します。
28. 拡大して、余分な腹膜と残っている脂肪体、卵巣、または精巣組織を切り取ります。
29. 脊柱の末端を各脚に付着している末梢神経の束を観察します。これが坐骨神経叢です。鉗子で神経の束をつかみ、体腔を出る場所で神経を切断します(図7C)。束を空洞から持ち上げて、神経が脊柱を離れる場所で切り取ります(図7D)。
30. 動物からピンを取り外し、腹側にひっくり返して、動物の手足を再度ピンで固定します。サンプリングする後肢を選択し、その肢の足を固定します。
31. 腓腹筋/脛骨腓骨の上からアーモンド型の皮膚のフラップを取り除きます(図8A、B)。
32. 背側の皮膚をつかみ、横方向に切り取り、動物の中央部の周りに連続した切り込みが入ります(図8C)。
33. ピンを外し、片手で脚を固定し、歯付き鉗子で前背側皮膚をつかみます。力を使って背側の皮膚を頭と腕の上に引き上げて、動物の皮を剥ぎます(図8D)。
34. 顎関節を覆っている脂肪塊を特定し、それがピンク色の筋肉組織に融合しているところから腫瘤の後縁を切断し、虹彩切除ハサミを使用して下にある骨から脂肪を切り取ります(図9A)。動物の年齢と成熟度に応じて、メラノフォアのクラスターが明らかになります(図9B)。筋肉の付着物や軟骨が付着しないように、腫瘤をトリミングします。
35. 動物をピンで固定し直し、目を選択します。湾曲した虹彩切除術のはさみを目の湾曲の周りの眼窩に挿入します(図9C)。目の周りをやさしく切り、筋肉の付着物を切断します。
36. はさみを眼窩の奥深くにスライドさせ、目の後ろの視神経を切り離します。これらのハサミを使用して、眼窩から目を離し、筋肉の付着物をさらに減らします。

結果

このプロトコルのすべての手順に従うことにより、心室、動脈幹、左肝葉、胆嚢、肺、膵臓、脾臓、喉頭、食道、胃、腸、精巣、脂肪体、卵管、対腎臓、坐骨神経叢、皮膚、胸腺、および目全体が安楽死から1時間以内にきれいに切除されました(図1、図2、図3、図4、図5、図6を参照)。 図 7、図 8、および図 9

ディスカッション

ここで紹介するプロトコルは、さまざまな経験レベルのユーザーに柔軟性を提供しながら、必要な組織の収集をタイムリーかつ効率的に行うように設計されています。新規ユーザーは、組織の体系的な収集を確実にするために、概説されているプロトコルの各ステップに従うことをお勧めします。ただし、経験豊富なユーザーは、特定の手順をスキップして、必要な組織のみをサンプリングすることを選択できます。たとえば、腸間膜の後ろにある脾臓へのアクセスは、膵臓をサンプリングせずに胃を動かすだけで達成できます。この適応性により、特定の研究ニーズに応じてサンプリングプロセスをカスタマイズできます。組織の分解速度と代謝活性は臓器特異的ですが、迅速に作業し、チルドバッファーを使用することで、結果として得られるサンプルへの影響を最小限に抑えることができます。

このプロトコルは効率を重視して設計されており、1時間以内に最大18の組織を収集できます。この方法の制限は、特定のアプリケーションに対しては、技術のさらなる改良が必要な場合があることである。例えば、ユーザは、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x PBS	コーニング	21-040-CV
5x 拡大鏡 LED ライト付き スタンド	amazon.com	B08QJ6J8P1	ライトは熱を発生させないでください
使い捨てトランスファーピペット	VWR	414004-036
解剖用ファインスパイン	Fisher Scientific	08-875
解剖用はさみ 鋭いパイオン、ストレート 6.5 インチ	VWR	76457-374
解剖トレイ	フィッシャー サイエンティフィ	14-370-284	発泡スチロール シートは、許容される代替品です
楽死容器	米国プラスチック	アイテム 2860	代替の不透明な容器が許容される
楽死容器の蓋	プラスチック	アイテム 3047
虹彩切除はさみ 6 インチ	VWR	470018-938	虹彩はさみが許容される代替品です
MS-222: シンカイン (旧トリカイン)	Pentair AES	TRS1
ラット歯組織鉗子 5.5 インチ、ステンレス鋼	フィッシャーサイエンティフィ	S08100
重炭酸ナトリウム、粉末、USP	フィッシャーサイエンティフィ	18-606-333
標本鉗子、鋸歯状	VWR	82027-442
Fisher Scinetific	S99385		用 T ピン

鉗子 ック 安安米国ック ック 解剖