成体Xenopusにおけるアクセシブルな組織を包括的にサンプリングするための効率的な技術

Summary

これは、 包括的なXenopus サンプリングプロトコルのパート1です。サンプリングされた組織は、心室、動脈幹、左肝葉、胆嚢、肺、膵臓、脾臓、喉頭、食道、胃、腸、精巣、脂肪体、卵管、対腎臓、坐骨神経叢、皮膚、胸腺、および眼全体です。

Abstract

Xenopus は、脊椎動物の発生と疾患を研究するための重要なモデル生物として長い間存在し、細胞プロセスと遺伝子機能に関する深い洞察を提供してきました。胚 性アフリカツメガエルに関する情報は豊富にあるにもかかわらず、成体組織サンプリングの標準化された方法、特に定量的プロテオミクスのような最新のアプローチには大きなギャップが残っています。この研究では、成人 のXenopusの複数の組織の迅速、正確、効率的なサンプリングのための包括的なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、他の無尾動物と比較した微妙な解剖学的違いに関連する課題に対処し、カエルの解剖の経験が限られている人でも再現性を確保します。このプロトコールは、サンプルの鮮度を優先することにより、高品質の生化学分析に最適化されています。私たちは、1時間以内に最大18の組織を迅速に収集することを促進しています。さらに、この方法は灌流条件と非灌流条件に適用され、さまざまな実験ニーズに柔軟に対応できます。この研究は、 Xenopus laevis と tropicalis の重要な方法論的ギャップを埋めるだけでなく、同様の両生類モデルに技術を適応させる研究者にとって貴重なリソースとしても機能し、それによって比較生物学的および進化学的研究の範囲と信頼性を高めます。

Introduction

Xenopus は、マウス、ゼブラフィッシュ、その他のモデル生物に比べて、特に発生的および進化的な文脈でヒトの病気を研究するための独自の利点を提供します。その外部胚発生と大きくて操作が容易な胚は、マウスでは困難であり、内部で発生し、侵襲的な手順を必要とするリアルタイムの観察と実験的介入(組織移植、遺伝子編集など)を可能にします。さらに、 Xenopusの3室心臓と四肢は、先天性欠損症¹、四肢再生²、心臓発達³を研究するためのより直接的な進化の架け橋を提供します。マウスとは異なり、 Xenopus オタマジャクシは、哺乳類にはない再生プロセスをモデル化して手足や臓器を再生できるほか、水生生活段階により、環境や毒素の影響を非侵襲的に研究することができます。 Xenopus は、より迅速な育種、低コスト、および倫理的制約の少なさと組み合わせることで、哺乳類のシステムで再現するのが難しい器官形成とストレス応答のハイスループットで機構的な研究に優れています。

この論文は、Xenopus オタマジャクシ⁴ で利用可能なように、成体Xen....

Protocol

すべての実験は、ハーバード大学医学部IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3)の規則および規制によって承認され、それに従って実施されました。サンプリング前に灌流プロトコル¹³ に従う場合は、ステップ2.3にスキップします。

1.調製(灌流なし)

1. 研究機関がこのプロトコルに記載されている安楽死技術を承認していることを確認してください。
2. 5 g / L MS-222(メタンスルホン酸トリカイン)と5 g / L重炭酸ナトリウム( 材料の表を参照)の溶液を準備します。.pHをチェックして、≥7であることを確認します。
   注:容積は、安楽死させる動物を完全に覆うために必要な容積よりも大きくなければなりません。
3. XenopusをMS-222溶液(ステップ1.2から)に入れ、動物を合計1時間¹⁴分沈めたままにして、一次安楽死を実行します。
4. 解剖面(トレイまたはフォームシート)を二次容器内の傾斜に置くか、血液の排出を容易にするために配置します。
5. カエルが溶液に1時間入ると、一次安楽死が完....

Results

このプロトコルのすべての手順に従うことにより、心室、動脈幹、左肝葉、胆嚢、肺、膵臓、脾臓、喉頭、食道、胃、腸、精巣、脂肪体、卵管、対腎臓、坐骨神経叢、皮膚、胸腺、および目全体が安楽死から1時間以内にきれいに切除されました(図1、図2、図3、図4、図5、図6を参照)。 図 7、図 8、および図 9

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、さまざまな経験レベルのユーザーに柔軟性を提供しながら、必要な組織の収集をタイムリーかつ効率的に行うように設計されています。新規ユーザーは、組織の体系的な収集を確実にするために、概説されているプロトコルの各ステップに従うことをお勧めします。ただし、経験豊富なユーザーは、特定の手順をスキップして、必要な組織のみをサンプリングすることを選択できます。たとえば、腸間膜の後ろにある脾臓へのアクセスは、膵臓をサンプリングせずに胃を動かすだけで達成できます。この適応性により、特定の研究ニーズに応じてサンプリングプロセスをカスタマイズできます。組織の分解速度と代謝活性は臓器特異的ですが、迅速に作業し、チルドバッファーを使用することで、結果として得られるサンプルへの影響を最小限に抑えることができます。

このプロトコルは効率を重視して設計されており、1時間以内に最大18の組織を収集できます。この方法の制限は、特定のアプリケーションに対しては、技術のさらなる改良が必要な場合があることである。例えば、ユーザは、.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	コーニング	21-040-CV
5x 拡大鏡 LED ライト付き スタンド	amazon.com	B08QJ6J8P1	ライトは熱を発生させないでください
使い捨てトランスファーピペット	VWR	414004-036
解剖用ファインスパイン	Fisher Scientific	08-875
解剖用はさみ 鋭いパイオン、ストレート 6.5 インチ	VWR	76457-374
解剖トレイ	フィッシャー サイエンティフィ	14-370-284	発泡スチロール シートは、許容される代替品です
楽死容器	米国プラスチック	アイテム 2860	代替の不透明な容器が許容される
楽死容器の蓋	プラスチック	アイテム 3047
虹彩切除はさみ 6 インチ	VWR	470018-938	虹彩はさみが許容される代替品です
MS-222: シンカイン (旧トリカイン)	Pentair AES	TRS1
ラット歯組織鉗子 5.5 インチ、ステンレス鋼	フィッシャーサイエンティフィ	S08100
重炭酸ナトリウム、粉末、USP	フィッシャーサイエンティフィ	18-606-333
標本鉗子、鋸歯状	VWR	82027-442
Fisher Scinetific	S99385		用 T ピン