思春期および成体マウスにおけるΔ9-テトラヒドロカンナビノール(THC)の投与

Kwang-Mook Jung; Alex Mabou Tagne; Heidi C. Avalos; Dominick D’Agosta; Jean Katz; Hye-Lim Lee; Daniele Piomelli

doi:10.3791/68358

方法論記事

思春期および成体マウスにおける^Δ9-テトラヒドロカンナビノール(THC)の投与

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DOI:

10.3791/68358

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2025年8月1日

Kwang-Mook Jung¹ , Alex Mabou Tagne¹ , Heidi C. Avalos¹ , Dominick D’Agosta¹ , Jean Katz¹ , Hye-Lim Lee¹ , Daniele Piomelli¹^,²^,³

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine, ²Department of Biological Chemistry, University of California, Irvine, ³Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine

この記事について

サマリー

Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール (THC) は、大麻の酩酊成分であり、米国では規制物質です。この記事では、現在の法規制に準拠してマウスに THC を取得、保管、投与するための標準的な手順を概説し、げっ歯類における THC の基本的な薬力学的効果を評価する方法を簡単に紹介します。

要約

Δ⁹-テトラヒドロカンナビノール (THC) は、現在合法および違法市場で入手可能な大麻および大麻由来製品の酩酊 (向精神薬) 効果の原因となっています。THCの向精神作用は、通常、内因性カンナビノイド(エンドカンナビノイド)物質によって関与する脳内のCB₁カンナビノイド受容体の活性化によって生成されます。脳の外では、THC は CB₁および CB₂ 受容体を活性化することにより、幅広い生理学的プロセスの調節に貢献します。エンドカンナビノイド物質とカンナビノイド受容体(総称してエンドカンナビノイドシステムとして知られる)によって果たされる生理学的機能は、生涯を通じてかなり変化し、思春期はこのシグナル伝達複合体の寄与に対する感受性が高まる時期です。この記事では、非経口投与のためにTHCを調製し、思春期と若年成人期の2つの発達段階にある雌雄のマウスにおけるTHCの急性薬力学的効果を評価するためのプロトコルについて説明します。文献で広く使用されている 3 つの用量 (1、5、および 10 mg/kg) と腹腔内経路に焦点を当てて、THC カタレプシー誘導、自発運動阻害、および侵害受容抑制のよく知られた効果が示されています。さらに、米国では THC が規制物質として指定されているため、現行法に従って THC を入手および保管する手順について簡単に説明します。

概要

米国の成人人口における大麻使用の有病率は過去数十年にわたって継続的に上昇しており、2023年も高い水準を維持しています。19歳から30歳の成人では、約42%が過去1年間に大麻を使用したと報告し、29%が過去1か月間に大麻を使用したと報告し、10%が毎日または準毎日の使用(過去30日間で20回^以上)を報告しました1。35歳から50歳の成人の場合、この数字はそれぞれ29%、19%、8%です。これらの推定値は 2022 年に得られたものと統計的に変わりはありませんが、過去 5 年間と 10 年間で両方の人口統計グループで増加していることを示しています¹。重要なことに、現在の証拠は、大麻を使用する人の約9%が大麻使用障害(SUD)²として知られる状態であり、潜在的な健康上の懸念3として知られる薬物に対する耐性と依存を発達させることを示唆^{しています3。}

他の向精神薬と同様に、大麻の使用は通常、10代前半に始まり、思春期を通じて徐々に増加します。2023年には、米国の^8年生の8%、10^年生の18%、12^年生の29%が少なくとも1回はこの薬を使用したと報告しました⁴.ここ数年は比較的安定していますが、リスクに対する認識が低下したにもかかわらず ^5,6、これらの数値は依然として高すぎます。大麻は、その広範な非医療用途に加えて、さまざまな病状にわたって治療の可能性を示しています^7,8。その酩酊性(向精神薬)成分の合成形態であるΔ⁹-テトラヒドロカンナビノール(THC)(図1)は、化学療法を受けているHIVおよびがん患者の吐き気と食欲不振を治療するための処方薬として40年以上使用されてきました^9,10。THCとその類似体カンナビジオール(CBD)(図1)はどちらも向精神薬ではなく、痛み、炎症、およびさまざまな神経障害の管理に関与しています^11,12。したがって、小児てんかんや自閉症など、医療用大麻由来製品の急速な普及により、新しい若者グループもこの薬に導入されています。これらの進展は、法改正と受け入れの拡大が公衆衛生と安全の懸念を上書きする可能性のある経済的利益を助長する社会的状況において特に懸念されます¹³.

THCを含む大麻(「マリファナ」)は、喫煙、気化、食用、チンキ剤、油など、さまざまな形で消費されます。摂取すると、THCは体全体に分布して脳に入り、そこで多幸感、リラクゼーション、感覚知覚の変化、食欲増進を引き起こしますが、一部の人には不安や被害妄想を引き起こす可能性もあります^14,15。THCは、脳の内側と外側の両方にある2種類のカンナビノイド(CB)受容体を活性化することにより、エンドカンナビノイド(ECB)システムと相互作用します^15,16。_CB1受容体が最も豊富な脳では、その活性化が気分、痛みの知覚、食欲、認知などの機能に影響を与えます。THCはまた、末梢臓器のCB₁およびCB₂受容体を活性化し、栄養素の摂取、吸収、貯蔵などの全身エネルギー代謝、ならびに痛みの開始、炎症、免疫に影響を与えます^17,18。

THCは急性効果と持続効果の両方を発揮し、大麻使用の長期的な影響に関する追加の前臨床および臨床研究が依然として必要です。米国で販売されている大麻の平均THC濃度が過去数十年で2008年の8.9%から2017年には17.1%に増加し、近年ではさらに高くなっていることを考えると、高用量THCに対する潜在的な副作用に特に重点を置く必要があります¹⁹ 。「高効力大麻製品」(高濃度のTHCを含む製品)は、大麻の花の平均THC含有量が20〜35%であり、一部の抽出製品は最大90%のTHCに達します。これらの高用量では、THCは、1970年代と1980年代に使用された従来の「低効力大麻」によって生成されたものとは質的に異なる効果をもたらす^{可能性があります。}したがって、高効力大麻製品の薬理学を理解することは、予防戦略に情報を提供し、規制および財政政策を導くために重要です。さらに、年齢、遺伝学、既存の状態などの要因が THC に対する個人の反応にどのような影響を与えるかを理解することは、特定の集団に合わせて予防と治療を調整するのに役立ちます。特に、ECBシステムが重要な神経発達の役割を果たしている出生前/周産期および青年期のカンナビノイド曝露は、持続的な悪影響につながる可能性があるため、10代の若者および妊娠中または授乳中の母親による大麻使用の結果をさらに調査する必要があります²¹。また、THC が他の薬や物質とどのように相互作用するかを理解するには、さらなる研究が必要です。THC の安全性と有効性に関する包括的なデータは、規制上の決定や公衆衛生政策に情報を提供し、医療と非医療の両方の文脈での安全な使用を保証します。

ここでは、現在の米国の法律(1971年の規制物質法)に従って、実験室環境でTHCを取得、保管、および投与するための標準的な手順を概説します。科学文献で広く使用されている3つのTHC用量(1、5、および10 mg / kg)²² と腹腔内(ip)投与経路に焦点を当てて、THCに対する3つの古典的な効果、つまりカタレプシーの誘導、自発運動活動の阻害、および抗侵害受容が示されました。このプロトコルは、複数回のTHC注射後に使用して、ヒトの急性投与では通常観察されない耐性とさまざまなメンタルヘルスへの影響につながる慢性的なTHC使用の結果を研究することもできます。

プロトコル

すべての手順はカリフォルニア大学アーバイン校のIACUCによって承認され、実験動物のケアと使用に関する国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに厳密に従って実施されました。

1. THCの取得と保管の手順

注: 米国では、学術研究の現場で THC を使用するには、大麻の法的地位で要求されるいくつかの手順に従う必要があります。大麻と大麻由来のTHCはどちらもスケジュールI規制物質に分類されています。このため、大麻やTHCを購入する前に、研究者は麻薬取締局(DEA)からライセンスを取得する必要があります。最大 6 か月以上かかる可能性があるこのプロセスの概要を以下に示します。

研究範囲の決定: 研究プロセスの目的と目的を定義し、THC が必要な理由を指定します。必要な THC の量、その商業的供給源、およびその取り扱いと保管方法を詳述した研究プロトコルを作成します。できるだけ多くの関連詳細を含めます。
機関の規制当局の承認を受け取る: 研究提案書を地元機関の動物管理および使用委員会 (IACUC) (前臨床作業の場合) または治験審査委員会 (IRB) (臨床作業の場合) に提出します。この審査ステップは、研究対象者の権利を保護し、研究が倫理基準に準拠していることを保証します。
州の規制の遵守: 大麻研究に関する州固有の規制は大きく異なる可能性があるため、注意してください。たとえば、カリフォルニア州では、カリフォルニア州研究諮問委員会 (RAPC) から承認を得ます²³。
THC の取得: 大麻と THC は、この目的のために認可された栽培者または製造業者から購入します。
注: 承認された耕運機のリストは、DEA の Web サイトで入手できます。国立薬物乱用研究所 (NIDA) は、NIDA 薬物供給プログラム²⁴ を通じて THC を提供しています。このプログラムに申し込むには、機関に関する情報、詳細な研究プロトコル、およびIACUCやIRBの承認書などの機関規制の文書を提供する必要があります。スケジュール 222 規制薬物の購入または譲渡には、各 DEA 登録番号に特別に指定された 1 ページのフォームである DEA フォーム 1 への記入が必要です。
THCの受け取りと保管
1. THC は、DEA によって承認された設計に従った、安全に施錠された金庫または金庫に保管してください。研究エリアへのアクセスを制御する必要があります(たとえば、建物や研究室のドアを施錠する必要があります)。許可された担当者のみが THC にアクセスできる必要があります。
2. アクセスを許可されている個人のリストを準備して設定し、リストを最新の状態に保ちます。THC 容器には、名前、濃度、受け取り日、危険警告を明確にラベル付けします。
3. 特定の文書化と連邦および州の規制の遵守を必要とする確立された廃棄手順に従ってください。THCを-20°C以下に保ちます。
在庫管理:
1. THC の数量、用途、場所を追跡するための堅牢な在庫システムを実装します。スケジュール 1 ライセンス、許可された個人情報、すべての受領、廃棄、および物質の使用の記録を含む規制物質バインダーを準備します (図 2)。
2. 半年ごとの在庫ログに記入して、在庫および保管慣行の定期的な監査を実施し、規制要件への準拠を確認します。アクセスログとインベントリ記録を定期的に確認します。
トレーニングとプロトコル: THC を扱うすべての担当者にトレーニングを提供する必要があります。薬物の保管、取り扱い、廃棄について明確なプロトコルを確立する必要があります。
注: これらの慣行を実施することで、学術研究室は法的要件を確実に遵守し、安全な研究環境を維持できます。

2. マウスに THC を i.p. 注射で投与する手順

注: THC を取り扱うときは、安定性を維持するために温度を制御し、化合物を光から保護することが不可欠です。THCは熱に弱いため、長期保存するには-20°C以下で保管する必要があります。短期保存の場合、THCは室温で保存するか、4°Cで数時間冷蔵することができます。THC は紫外線 (UV) や可視光にも敏感であり、酸化による劣化を引き起こす可能性があります。これを防ぐには、THCは密閉された琥珀色のガラス容器またはアルミホイルで包まれた透明な容器に入れて暗所に保管する必要があります。適切な追跡と安定性を確保するために、すべてのサンプルに日付と保管条件をラベル付けすることをお勧めします。

料
1. すべての溶液は、超純水と分析グレードの試薬を使用して調製します。ケイマンケミカル(ミシガン州アナーバー)またはRTIインターナショナル(ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク)から、またはNIDA医薬品供給プログラムを通じてTHCを入手します²⁴。
機器と消耗品
1. 手順を開始する前に、 材料表 に記載されている項目の準備ができていることを確認してください。
  注: THC を扱うときは、ガラスバイアル (8 mL または同様のもの) と容器を使用することが不可欠です。プラスチックは THC などの疎水性分子と反応したり吸収したりする可能性があり、サンプルの損失や濃度の不安定につながる可能性があります。ガラスは化学的に安定しており、非反応性であるため、疎水性分子との望ましくない相互作用を防ぐのに役立ちます。
マウスへのTHC投与手順
1. 冷凍庫の安全ロッカーからTHC容器を取り出します。
2. 容器を氷の上に置いたまま、ピペットを使用して適切な量のTHCを取り出し、8 mLのガラスバイアルの底に注意深く加えます。マウスの用量(mg/kg)と体重(g)に基づいて体積を計算します。
3. バイアルを化学ヒュームフードに移動し、窒素ガスの穏やかな流れで溶媒を穏やかに蒸発させて乾燥させます。THC含有溶液をバイアルの側面に飛び散らすと、重大な損失が発生するので注意してください。このプロセスには約5〜10分かかります。
4. 規制物質 I 使用ログに、現在使用されているバイアルからどれだけの THC が摂取されたかを規制物質バインダーに記録します。
5. 溶媒が完全に乾燥したら、適切な量のトゥイーン-80を加えます。これは、ステップ2.3.8に示すように、生理食塩水中でTween-80の最終濃度5%を得るために必要なTween-80の量です。
6. 60°C以下のお湯を入れたビーカーでバイアルを温めます。バイアルをボルテックスしてTHCを完全に溶解し、必要に応じて繰り返します。
7. 滅菌生理食塩水を少しずつ徐々に加えます:例えば、200 μL、300 μL、500 μL、1 mL。渦を巻き起こして加熱します。
8. 必要な生理食塩水の総量が加えられ、5%トゥイーン-80および95%生理食塩水で最終的なTHC溶液が作成され、溶液が完全に溶解するまで、手順2.3.6および2.3.7を繰り返します。
9. (オプション)40 kHzおよび37°Cで約100%の出力に設定された超音波水浴でバイアルを5分間超音波処理します。溶液が透明で、未溶解物質が含まれていないことを確認してください。液体の色は使用する車両によって異なる場合があります。
10. マウスの重量を量り、注射する適切な量を決定します。注射量はマウスあたり10mL / kgでなければなりません。
11. 腹腔内(ip)注射を続行します。THC 溶液が使用当日に調製されたばかりであることを確認してください。

3. THCの薬理効果を評価する手順

動物
1. この研究には男女のマウスを使用します。
  注:この研究では、ジャクソン研究所(コネチカット州ファーミントン)の男女の青年(生後日、PND、30〜35)および成体(PND 70〜75)のC57BL / 6Jマウスを使用しました。
  この手順は、他のマウス系統にも適用できます。
2. マウスを換気されたケージ(ケージあたり4〜5匹)に入れ、餌と水を自由に利用できるようにします。年齢と体重が一致した動物を治療群にランダムに割り当て、実験前に少なくとも1週間順応させます。
3. 住宅室を、一定の温度(20±2°C)と相対湿度(55%-60%)で、12時間のライトサイクル/12時間の暗サイクル(午前6時30分にライトオン)に維持します。
実験グループ
1. 各年齢と性別のグループを 4 つの治療グループに分けます: 1 つのビヒクル対照グループと 3 つの THC 治療グループを 1、5、および 10 mg/kg の用量で投与します。
薬物投与
1. 上記のように、5%Tween-80を含む95%生理食塩水のビヒクルでTHCを新たに調製し、ip注射によって投与します。
行動テスト
注: この例では、各動物は THC の効果を追跡するために以下に説明するテストを受けました²².3つの行動試験は、同じ動物コホートで連続して実施されました。手順の順序は、移動 (THC 後 30 分)、カタレプシー (THC 後 45 分)、および尾浸漬 (THC 後 60 分、180 分、および 300 分) でした (図 3).思春期の女性の実験では、同じビヒクル処理群を再利用し、カタレプシーと尾の浸漬試験を実施するために、同じコホートに 1 mg/kg または 10 mg/kg の THC を投与しました。このアプローチにより、倫理ガイドラインに従って、使用する動物の数を最小限に抑えながら、十分な統計的検出力に達することができました。ビデオカメラを使用して行動を記録し、行動追跡ソフトウェアを使用して動画ファイルを分析しました。
1. カタレプシー検査
  注:マウスのカタレプシーは、随意運動の欠如、姿勢の硬直、および体位の外部誘発性の変化に対する耐性を特徴とする(病的)生理学的状態です。これは、運動抑制、抗侵害受容、体温低下と並んで、THC の 4 つの標準的な効果の 1 つと考えられています。この例では、以下に詳述するように、確立された手順²² に基づいてカタレプティック行動が評価されました。
  1. セットアップ:通常の周囲照明(160ルクス)で、クリーンな実験台の表面から4cm高い水平バー(長さ7 cm)を準備します。すぐに使用できる電子タイマーを近くに置きます。
  2. マウスをハウジング施設から試験ラボに移し、試験前にケージ内で60分間順応させます。清潔な白衣を着用し、香水は使用しないでください。
  3. 清潔なラテックス手袋を使用して、マウスをケージからそっと取り外し、適切な量の THC またはビークルを安全に投与して、ケージに戻します。
  4. THC注入後の適切な時間(この場合は45分)に、マウスをケージから取り外し、前足を水平バーにそっと置きます。
  5. 電子タイマーを使用して不動時間を記録します。
    注:不動時間は、マウスをバーに置いてから片方または両方の足を離すまでの時間として定義されます。
  6. マウスが片方または両方の足をバーから外すか、10秒のカットオフ時間に達したときにタイマーを停止します。
  7. 各マウスに対してテストを2回繰り返し、試験の間に2分の休憩間隔を空けます。
  8. 最終的なデータ分析には、2 つの不動時間の平均を使用します。
  9. 結果の測定: カタレプシーの指標として不動時間 (秒単位) を使用します。
2. オープンフィールドテスト(新しい環境での自発運動)
  注: THC 誘発性低運動は、オープンフィールドテストを使用し、確立されたプロトコルに従って評価されます²⁵。
  1. セットアップ: このテストでは、ビデオ追跡装置を備えたオープンフィールドアリーナを使用します。オープンフィールドアリーナが清潔で、以前の実験からの臭いの手がかりがないことを確認してください。
    注:効果的なクリーンアップは、 材料表に記載されている市販の製品を使用して行うことができます。
  2. マウスをハウジング施設からテストラボに移し、テスト前にケージ内で60分間順応させます。テストルームの照明が低輝度(10ルクス)であることを確認してください²⁵。清潔な白衣を着用し、香水は使用しないでください。
  3. 清潔な手袋を使用して、マウスをケージからそっと取り外し、適切な量のTHCまたはビヒクルを安全に投与して、マウスをケージに戻します。
  4. THC注入後の適切な時間(この場合は30分)に、ハンドリングのストレスを最小限に抑えるように注意しながら、マウスをアリーナの中央にそっと置きます。
  5. ビデオカメラと行動追跡ソフトウェアを使用して10分間のセッションを記録します。
  6. テスト後、マウスをホームケージに戻し、上記の洗浄液でアリーナを徹底的に洗浄します。
  7. 結果の測定: 自発運動を定量化するための主要なパラメーターとして、メートル単位で測定された総移動距離を計算します。
3. 尾浸漬試験(侵害受容閾値、熱水尾引き抜き試験とも呼ばれます)
  注:侵害受容は、前述のように尾浸漬試験を使用して評価されます²⁶。このテストは、潜在的な鎮痛薬の有効性を評価し、その効果に対する耐性を評価するために使用されます。試験中、痛みを伴う刺激としてマウスの尻尾に熱を加え、尻尾を熱源から引き抜く時間を測定します。
  1. セットアップ:通常の周囲照明(160ルクス)で54°Cに維持されたウォーターバスを準備します。すぐに使用できる電子タイマーを近くに置きます。
  2. ペットのトレーニングパッド (Glad) を使用して作られたソフトティッシュポケットを使用してマウスを優しく拘束し、尻尾にアクセスできるようにします。
  3. 尾の遠位の3分の1をウォーターバスに浸し、同時にタイマーを開始します。
  4. テールの反射的なフリックとして定義される、テールリアクションまでのレイテンシー(秒単位)を記録します。
  5. 組織の損傷や不快感を防ぐために、最大カットオフ時間を10秒に設定してください。
  6. 各マウスに対して、各時点で測定を2回繰り返します(この場合は、THC注射後60分、180分、および300分)、試行間隔は5分です。
  7. データ分析のために 2 つのレイテンシ測定値を平均化します。
  8. 結果の測定: 抗侵害受容効果を評価するための主要な結果変数として、数秒単位で測定されたテール離脱までの潜時を計算します。
統計分析
1. 結果を SEM ±平均として表現します。二元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続く Šídák の多重比較検定、または三元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定を使用して有意性を決定します。 P が 0.05 の場合、有意な差<考えます。
  注:GraphPad Prismバージョン10.4を使用して解析を実行しました。

結果

上記のプロトコルを説明するために、THC の急性薬理学的効果に関する結果を提示します。マウスの4つのグループ(グループあたり8匹)、思春期の雄、成人雄、思春期の雌、および成体雌に、対照としてビヒクルとともにTHCの3回投与(1、5、および10 mg / kg)が投与されました。次に、カタレプシー、自発運動、侵害受容を評価し、効果の用量依存性と性別や年齢による違いに焦点を当てました。

まず、急性カタレプシス効果については、THCは思春期および成体雄マウスに用量依存性カタレプシーを引き起こしました(図4A および表1)。奏効の持続時間は用量依存的であり (P<0.0001、二元配置分散分析)、5 mg/kg と 10 mg/kg は、各グループのビヒクル対照と比較して、両方の年齢グループで統計的に有意な効果をもたらしました (Šídák の多重比較検定による P < 0.0001)。10 mg / kgの用量では、THCは思春期と成体の雌マウスの両方でカタレプシーを引き起こし(図4B および表2)、成体雌は思春期の雌と比較してあまり顕著な反応を示しませんでした(Šídákの多重比較検定によるP < 0.0001)。データセットはさらに分析され、性別がTHC誘発性カタレプシーに影響を与えるかどうかを判断しました。男性と比較して、女性の青年では、控えめではあるが有意な性的二形性反応が観察されました(P = 0.0204)(図4C および表3)。雌の成体マウスでは、性別の影響がかなり強く見られ、雄の成体マウスと比較してTHCのカタレプティック効果に対する感度が有意に低かった(P < 0.0001)(図4D および表4)。

第二に、急性自発運動効果については、THCは雄マウスの自発運動活動を低下させました(図5Aおよび表5)。この効果は、THCの用量と動物の年齢依存性(それぞれP < 0.0001およびP = 0.0042)の両方であり、思春期のマウスは成体マウスと比較してTHCの効果に対してより敏感でした。事後多重比較試験では、5 mg/kg THC 用量では、思春期のマウスは成体マウスよりも有意に少ない動きが示されました (P < 0.0001)。THCは雌マウスでも自発運動活動を低下させた(図5Bおよび表6)。二元配置分散分析は、雌マウスでも用量と年齢の両方の有意な効果を示しました(それぞれP < 0.0001およびP = 0.0103)(図5Bおよび表6)。しかし、事後多重比較試験では、0または10 mg / kgのTHC用量で思春期と成体の雌マウスの間で統計的に有意な差は明らかにされませんでした(図5B)。これらのデータセットはさらに分析され、性別がTHC誘発性の低運動に影響を与えるかどうかを判断しました。性的二形性は思春期のマウスでは観察されませんでした(図5Cおよび表7)。しかし、成体マウスは統計的に有意な性的二形性を示し(P = 0.0046)、成体メスは成体雄と比較して有意に高い動きを示しました。それにもかかわらず、事後多重比較検定では、0または10 mg / kgのTHC用量で男女間の統計的に有意な差は明らかにされませんでした(図5Dおよび表8)。

第三に、急性抗侵害受容効果については、THCは雄マウスの尾浸漬侵害受容を減少させました(青年、図6Aおよび表9、成人、図6Cおよび表11)。思春期の男性では、THCは投与後60分、180分、および360分でテストされた5および10 mg / kgで有意な抗侵害受容効果を生み出しました(P<0.0001、Šídákの多重比較テストによる、ビヒクルコントロールマウスのテールフリック潜時と比較して)(図6Aおよび表9)。二元配置分散分析により、テールフリック潜時に対するTHC用量の強い効果が確認され(P < 0.0001)、特に最高用量(P = 0.0133)で抗侵害受容効果の時間依存的な減少が示されました(図6Aおよび表9)。同様のTHC用量依存効果が観察されましたが、時間の影響は観察されませんでした(それぞれP < 0.0001およびP = 0.9923)(図6Bおよび表10)。成人男性では、THCは最高用量(10 mg / kg)と最も早い時点(投与後60分)でのみ有意な抗侵害受容効果をもたらしました(ビヒクルコントロールと比較して、Šídákの多重比較テストによるP<0.0001)(図6Cおよび表11)。二元配置分散分析は、用量と時間の両方に有意な効果を示しました(線量、P < 0.0001、時間、P = 0.0007)(表11)。成人女性では、有意な抗侵害受容効果は、最高用量(10 mg / kg)と最も早い時点(投与後60分)でのみ観察されました(ビヒクルコントロールと比較して、Šídákの多重比較テストによるP < 0.0012)(図6Dおよび表12)。THC誘発性抗侵害受容に対する性別と年齢の影響に関しては、二元配置分散分析により、テールフリック潜時に対するTHCの影響は年齢と性別の両方によって影響を受けることが明らかになりました(図6E、F、表13、 および表14)。THC投与の60分後に思春期の男性で最も強い効果が観察されましたが、マウスの4つのグループすべてが、この時点で適切なビヒクルコントロールと比較した場合、有意なTHC誘発性抗侵害受容を示しました(図6E)。興味深いことに、THC後60分の時点で、思春期のマウスでは観察されましたが、成体マウスでは性の有意な影響が観察されました(思春期、P = 0.0083、成体、Šídákの多重比較検定によるP = 0.9919)(図6Eおよび表13)。THC後300分の時点で、有意な抗侵害受容効果は、雄と雌の両方の思春期マウスにのみ見られ、成体マウスでは見られませんでした(図6Fおよび表14)。三元配置分散分析では、用量、年齢、性別の3つの変数を同時に検定し、時間と用量の両方の有意な効果(それぞれP = 0.0007およびP < 0.0001)と、時間と用量の間の有意な相互作用(P = 0.0022)を明らかにしました(表15)。

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図1:フィトカンナビノイド、THCおよびCBD、およびエンドカンナビノイド、アナンダミド、および2-AGの化学構造。デルタ-9-テトラヒドロカンナビノール (THC) は、雌の大麻植物の花序で生成され、その向精神作用の原因となります。THCは、脳や体の他の組織にあるGタンパク質共役_CB1 および_CB2 受容体に結合することによって作用します。カンナビジオール(CBD)は、抗てんかん作用、場合によっては抗精神病薬、抗炎症作用を持つ非向精神薬カンナビノイドです。CB受容体の2つの主要な内因性活性化因子であるアナンダミドと2-アラキドノイル-sn-グリセロール(2-AG)は、脳および末梢組織の脂質由来メッセンジャーであり、オンデマンドで生成され、CNSのシナプス可塑性の微調整など、さまざまな短距離シグナル伝達プロセスに関与しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:規制薬物Iの使用ログの例。 THC の使用状況は、施錠されたキャビネットまたは安全なオフィススペースに保管されている規制物質バインダーに保管される、アドホックな規制物質 I 使用ログに記録する必要があります。このフォームには、スケジュール 1 ライセンスに登録する必要がある主任研究者の名前と所属、予定されている薬剤と正確なバッチに関する情報、プロトコル番号、薬剤を使用している権限のある人、および各使用の量と残高を含める必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:行動テスト実験の順序を示す概略図。手順の順序は、移動 (THC 後 30 分)、カタレプシー (THC 後 45 分)、および尾浸漬 (THC 後 60 分、180 分、および 300 分) でした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:マウスにおけるTHC誘発性急性カタレプシー。 THCは、思春期および成体の(A)オスマウスと(B)メスのマウスにカタレプシーを引き起こします。反応は、i.p. 指示された用量でのTHCの注射後のバーテストを使用して評価されました。同じデータセットで、(C)思春期および(D)成体オスおよびメスのマウスにおけるTHC誘発性カタレプシーに対する性別の影響について分析されました。結果は SEM ±平均値として表されます。有意性は、二元配置分散分析とそれに続く Šídák の多重比較検定を使用して決定されました。P が 0.05 の場合、差は有意であると考えられ<。P < 0.0001 ビヒクルコントロールと比較して 0.0001、 ^##P < 0.01、 ^####P < 0.0001 と、パネル B の青年期 10 mg/kg グループまたはパネル C および D の男性 10 mg/kg グループと比較して。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:マウスにおけるTHC誘発性急性低運動。THCは、思春期および成体の(A)オスおよび(B)メスのマウスの自発的な自発運動活動を低下させます。反応は、i.p. 指示された用量での THC の注射後のオープンフィールドテストを使用して評価されました。同じデータセットが、(C)思春期および(D)成体オスおよびメスの成体マウスにおけるTHC誘発性運動低下に対する性別の影響について分析されました。結果は SEM ±平均値として表されます。有意性は、二元配置分散分析とそれに続く Šídák の多重比較検定を使用して決定されました。P が 0.05 の場合、差は有意であると考えられ<。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001 を、パネル A のビヒクル対照と比較して 0.0001、^####P < 0.0001 を、青年期の 5 mg/kg 群と比較して。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:マウスにおけるTHC誘発性急性鎮痛。 THCの急性抗侵害受容効果は、(A)思春期の雄、(B)思春期の雌、(C)成体雄、および(D)成体雌マウスの尾浸漬試験を使用して測定されました。示された用量でTHCをi.p.注射しました。THC投与から(E)60分または(F)300分後のTHC誘発性抗侵害受容に対する年齢と性別の影響について、同じデータセットを分析しました。結果は SEM ±平均値として表されます。有意性は、二元配置分散分析とそれに続く Šídák の多重比較検定を使用して決定されました。P が 0.05 の場合、差は有意であると考えられ<。*P < 0.05、***P < 0.001、****P < 0.0001 ビヒクル対照と比較して 0.0001、 ^##P < 10 mg/kg 思春期男性群と思春期女性群の間で 0.01 0.01、 ^@P < 0.05 と ^@@P <10 mg/kg 成人男性群と成人女性群と比較してそれぞれ 0.01 でした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:思春期および成体雄マウスにおけるカタレプシーの産生におけるTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図4Aに関連)(グループあたりn = 7〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:思春期および成体の雌マウスにおけるカタレプシーの産生におけるTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図4Bに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表3:思春期の雄および雌マウスにおけるカタレプシーの産生におけるTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図4Cに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:成体雄および雌マウスにおけるカタレプシーの産生におけるTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図4Dに関連)(グループあたりn = 7〜10)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表5:思春期および成体雄マウスの運動に対するTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図5Aに関連)(グループあたりn = 7〜9)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表6:思春期および成体の雌マウスの移動に対するTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図5Bに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表7:思春期の雄マウスおよび雌マウスの移動に対するTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図5Cに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表8:成体雄および雌マウスの移動に対するTHCの急性効果に関する二元配置分散分析(図5Dに関連)(グループあたりn = 7〜9)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表9:思春期の雄マウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する二元配置分散分析(図6Aに関連)(グループあたりn = 7〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表10:思春期の雌マウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する二元配置分散分析(図6Bに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表11:成体雄マウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する二元配置分散分析(図6Cに関連)(グループあたりn = 6〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表12:成体雌マウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する二元配置分散分析(図6Dに関連)(グループあたりn = 7〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表13:10 mg / kg THCの注射から60分後にテストされた、青年期および成人、雄および雌のマウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する二元配置分散分析(図6Eに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表14:10 mg / kg THCの注射から300分後にテストされた、思春期および成人、雄および雌のマウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する二元配置分散分析(図6Fに関連)(グループあたりn = 5〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表15:10 mg / kg THCの注射から60、180、および300分後にテストされた、青年および成人、雄および雌のマウスにおけるTHCの急性鎮痛効果に関する三元配置分散分析(図6Eおよび6Fに関連)(グループあたりn = 7〜8)。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この記事では、現在の米国の規制に従ってTHCを取得および保管するための手順の概要を提供し、腹腔内注射用のTHCを調製し、思春期(PND 30-35)および若年成体マウス(PND 70-75)に投与するためのプロトコルの概要を説明します。THC を正規の供給源から入手し、適用されるすべての規制を遵守することが重要です。米国では、大麻が医療用と非医療用の両方で合法である州であっても、研究者は連邦と州の両方の規制要件を満たす必要があります。認証された供給源を使用することで、一貫した効力と純度を保証する厳格な管理の下で製造された研究グレードの THC に確実にアクセスできます。対照的に、規制されていない、または許可されていない情報源を使用すると、科学的完全性が損なわれ、転用のリスクが生じ、研究者が法的結果にさらされます。

THC に対する 3 つの標準的な薬理学的反応 (カタレプシー、運動の減少、鎮痛) を調べました。THCが用量依存的にこれらの反応に影響を与えることを示す広範な文献データ(たとえば、参考文献²⁷^、²⁸^、²⁹を参照)を再現しました。これらの検査は、カンナビノイド受容体アゴニストの薬理学的特性を評価するための前臨床研究で使用されますが、人間の経験との関連性はさまざまです。カタレプシーとは、被験者が正常な運動機能を動かしたり従事したりする能力が低下した状態を指します。これは、被験者が異常な姿勢をとる物理的な固定または硬直として現れます。運動の低下 (または低運動) とは、水平運動活動の全体的なレベルの低下を指し、動きが遅くなったり、頻度が低下したりして現れます。これは、鎮静、運動障害、または単に動く意欲の欠如が原因である可能性があります。動物実験では、これは新しい環境での探索行動または一般的な活動レベルの低下として観察されることがよくあります。3 番目のテストである抗侵害受容は、テールイマージョンテストでテールリドメントレイテンシを増加させる THC の能力を指します。動物モデルでは、鎮痛の主観的成分を評価するには特殊なテストが必要ですが、テール浸漬抗侵害受容は、薬物が侵害受容機能にどのように影響するかについて、限定的ではありますが有用な見解を提供します。

ここで提示された結果は、THCが性別や年齢に関係なく、特に5 mg / kgおよび10 mg / kgの用量でカタレプシーを用量依存的に誘発することを示しています。成体雌マウスでは年齢および性別特異的な影響が観察され、雄または思春期の雌マウスと比較してカタレプシーの産生が有意に鈍化しました。新しい環境でのTHC誘発性運動低下は、性別に関係なく、成体マウスと比較して思春期のマウスで強かった。この加齢に伴う違いは、馴染みのある環境である自宅ケージでのTHCの成人選択的低運動効果と区別できました³⁰。THCの急性抗侵害受容作用については、思春期の雄マウスでは5 mg/kgと10 mg/kgの用量の両方で統計的に有意な効果がみられたが、成体雄マウスでは10 mg/kgの用量のみが有効であった。ここでテストした 3 つの時点で、THC の抗侵害受容効果は THC 後 60 分で最も高く、その後減衰しました。思春期の男性は、4つの年齢性グループの中で最もTHCの侵害受容効果に最も敏感であり、思春期のマウス群では、10 mg / kgのTHCの注射から60分後に性別の有意差が観察されました。THC投与300分後、青年期では有意な抗侵害受容効果がみられたが、成体マウスでは性別を問わず有意な抗侵害受容効果がみられたが、年齢による明らかな影響が見られました。一般に、思春期のマウスは、特に運動と侵害受容の測定において、成体と比較してTHCに対する高い感受性を示しました。全体として、これらの結果は、思春期がTHCの急性薬理学的効果に敏感な時期であることを示していますが、これはテストに依存している可能性があります³⁰。ここでの結果は、THCの影響における年齢と性別の両方の影響も特定しており、成人女性がTHCに対して最も感受性が低いことを示唆しています。

思春期にTHCにさらされると、特に頻繁に高用量で曝露されると、脳を含む体全体のエンドカンナビノイドシステムの機能が破壊される可能性があります³¹。この混乱は、精神的および身体的健康の両方に長期的な影響をもたらす可能性があります32,33,34。過去30年間の疫学研究は、思春期の大麻使用と認知、気分、心理社会的機能の長期的な障害との関連性を一貫して示しており、これらの影響は使用を中止した後でも成人期にまで及ぶ可能性があります32,33,34,35,36.さらに、体重、代謝、免疫機能の長期的な変化が報告されています。これらの関連性は十分に文書化されていますが、大麻の使用とその潜在的な健康への影響との間の因果関係を確立することが重要です。不一致双生児分析、メンデルのランダム化、準実験的介入などのさまざまな方法を使用して、ヒト集団の因果関係を評価できます。しかし、実験動物実験も因果関係の解明に重要な役割を果たします³⁷。国立薬物乱用研究所の資金提供を受けて、思春期に中程度ではあるが頻繁なTHC曝露のげっ歯類モデルを使用した私たちの研究室の調査結果は、思春期がTHC曝露の脆弱な時期であるという仮説を裏付けています17,18,25,38,39,40.この重要な発達時期に適度な用量の薬物を投与した場合でも、成人のエンドカンナビノイドシステムのさまざまな成分に永続的な影響を与える可能性があります。これらの影響は、神経行動の変化、免疫反応の障害、心理社会的ストレスに対処する能力に関連しています。私たちの以前の研究では、脂肪組織の機能における予期せぬ変化も明らかになり、通常の大麻使用者に見られる長期的な代謝変化の潜在的な分子的説明を提供します¹⁸。思春期などの重要な神経発達期に脳内の CB₁ 受容体を不適切に活性化することにより、THC は脳の成熟に必要なバランスを崩し、成人期まで持続する可能性のある構造的および機能的変化を引き起こす可能性があります。

人間では、喫煙と電子タバコがすべての年齢層で最も一般的な大麻消費方法です。私たちの現在のプロトコルは、腹腔内(ip)経路を介したTHCの投与を概説しており、これは実用的で再現性があり、げっ歯類に薬物動態学的および薬力学的反応をもたらし、いくつかの点でヒトの大麻使用者で観察されたものに似ています。たとえば、思春期および成人の雄マウスにおける 5 mg/kg THC の ip 用量は、成人のヒト使用者で報告されているものに匹敵するピーク血中濃度を生成することが示されています。THC のエアロゾル送達 (口語的には「蒸気」と呼ばれます) は、腹筋注射を補完するものとして研究されています。このアプローチは、喫煙や電子タバコのようにエアロゾル化された THC を受動的に吸入すると肺吸収が引き起こされ、その結果、非経口投与と比較して効果がより迅速に発現し、初回通過肝臓代謝が低下し、潜在的に異なる精神活性転帰が生じるという前提に基づいています。特に、以前の研究では、ラットがオペラント行動パラダイムでエアロゾル化された大麻抽出物またはTHC/カンナビジオール混合物を自己投与することが実証されており、THCの強化特性を研究するためのこの方法の可能性が浮き彫りになっています。

結論として、このプロトコルは、いくつかの重要な更新と改良を提供することにより、ニューロン_CB1受容体の活性化⁴³に依存するカンナビノイド誘発性テトラッド挙動^41,42を評価するための確立された方法に基づいて構築されています。まず、実践的な経験のない人のために、THC が重要な考慮事項を取得、取り扱い、管理するための現在の DEA および制度的規制に沿った手順について説明します。第二に、テトラッドパラダイムを思春期(PND 30-35)と若年成体(PND 70-75)マウスに適用し、幼少期および新興成人の大麻曝露に大きく関連しているが、前臨床研究では過小評価されている2つの発達段階です。この研究の結果は、カタレプシー、移動、および鎮痛に対するTHCの既知の用量依存的効果を要約すると同時に、思春期マウス、特に侵害受容および自発運動領域におけるTHCに対する感受性の増加を明らかにしました。この年齢固有の洞察と規制の調整により、このプロトコルは、カンナビノイド研究の初心者や、カンナビノイドの発達への影響を調査する研究者にとって特に価値のあるものとなっています。

開示事項

著者らは、生物医学的な金銭的利益や潜在的な利益相反は報告していない。

謝辞

この研究は、国立薬物乱用研究所 (助成金番号 2P50DA044118 [DP へ] ) によって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mL TBシリンジ	BDの	309659	200/ケース;滅菌済み、使い捨て。
8 mL ガラスバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	W224584	144/ケース、THC注射液の調製に使用されます。
ANY-mazeソフトウェア	ANY-迷路	6000	行動テストのビデオを録画し、データ分析のためにテストの要素を定量化するために使用されます。
C57BL/6Jマウス	ジャクソン研究所	#000664	すべての実験に使用される野生型マウス。希望する正確な年齢と性別を指定できます。
コンパスCXスケール	オハウス	CR221	マウスの体重を量り、注射するTHCの量を決定するために使用されます。最大220g、d = 0.1g。
Corning Pyroceram ホットプレート	フィッシャーサイエンティフィック	11500151	テールフリックテスト用のウォーターバスを加熱するために使用されます。
デルタ-9-テトラヒドロカンナビノール	ケイマンケミカル	12068	スケジュール 1 の薬剤を -30 º で確実に施錠された金庫に保管します。C冷凍庫。
フィッシャーブランドニトリル手袋	フィッシャーサイエンティフィック	19-181-610	100/パック;適切な個人用保護具に使用される使い捨てのラテックスフリー手袋。
GraphPad プリズム v10.4	グラフパッド	該当なし	実験データの分析と統計的検定の実行に使用される統計分析ソフトウェア。
ヘビーデューティービーカー	フィッシャーサイエンティフィック	S81280	テールフリックテスト用のお湯を入れるために使用されます。
高純度窒素ガス	エアガス	UN1066	THC原液からエタノールを蒸発させるために使用されます。
ロジクールC920ウェブカメラ	ロジクール	960-001055	動物の行動テストを記録するために使用されます。カールツァイス1080p / 30fps HD USB。
フィールドボックスを開く	ストールティング社	60101	オープンフィールドテストを実施するための不透明な側面を備えたボックス。側面は簡単に取り外して掃除できます。
ペットトレーニングパッド	嬉しい	B088G1N2H8	85/パック;22インチ&急性;22インチ;テールフリックテストのためにマウスを包んで保持するために使用されます。
プレシジョングライドニードル	BDの	305109	100/ケース;0.4 mm&急性;13ミリメートル;滅菌済み、使い捨て。
塩田	フィッシャーサイエンティフィック(Cytiva)	Z1377	1 Lボトル、USP滅菌グレード。
スコー 1x	バイオフォグ	R-SK	行動試験材料の洗浄に使用される洗浄液。
トゥイーン-80	シグマ・アルドリッチ	P8074-500MLです	BioXtra、粘性液体;CAS #9005-65-6。
超音波ウォーターバス	フィッシャーサイエンティフィック(ブランソン)	CPX2800	温度制御;デジタル超音波洗浄機。
ボルテックスミキサー	フィッシャーサイエンティフィック	2215365	調製中のTHC注射液の内容物を混合するために使用されます。

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