方法論記事

ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームとしてのSPOTの再現性のある製造

DOI：

10.3791/68405

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2025年7月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ハイスループット足場ベースの培養プラットフォームであるSPOTの作製と組み立てを96ウェルおよび384ウェルフォーマットで文書化します。また、手動と市販のリキッドハンドラーを使用したSPOTの播種プロセスについても詳しく説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

患者由来オルガノイド (PDO) は、腫瘍をモデル化するためにがん研究の分野でますます使用されるようになってきています。これらは、 in vivo モデルと従来の in vitro モデルの利点を組み合わせ、ヒト細胞で構成されながら組織の複雑さと不均一性を再現します。生理学的に代表的なPDOモデルの台頭により、オルガノイドの挙動を簡単に分析できるデバイスの必要性が高まっています。このプロトコルでは、ハイスループットの3次元(3D)オルガノイド培養装置であるオルガノイドベースの組織用スキャフォールドサポートプラットフォーム(SPOT)を組み立てて使用する方法について説明します。このプラットフォームは、通常、シードされたヒドロゲルによって形成されるメニスカスを排除し、2次元(2D)培養のイメージングプロセスと同様に、正確で迅速なイメージングを可能にします。その結果、SPOTに播種されたオルガノイドと共培養物は、ハイスループット顕微鏡を使用して簡単に画像化できます。既製の使用を想定して設計されたSPOTは、基本的な組織培養の経験を持つ研究者が利用でき、手動および自動の播種ワークフローと互換性があります。このプロトコルには、組み立て、播種、品質管理、トラブルシューティングの段階的な手順を含む、96 ウェルおよび 384 ウェル形式での SPOT の製造について詳しく説明しています。製造にはアイドル時間を除いて3〜4時間かかりますが、複数のプレートを同時に製造できるため、拡張性が向上します。SPOTは、PDOの培養と分析を合理化することで、ハイスループットの薬物スクリーニングとトランスレーショナルがん研究のための堅牢なツールを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物医学研究の進歩にもかかわらず、生理学的に関連する in vitro アッセイの開発は依然として困難です。理想的なアッセイは、さまざまな分野の研究者のニーズを満たすために、多様な細胞タイプ、治療製剤、タイムスケール、市販機器、分析読み出しに対応する必要があります。しかし、適切なツールが不足しているため、研究者は不死化細胞株の2D単層などの単純なモデルに依存することが多く、特にがん研究において、複雑さと臨床的関連性を要約できません1,2。これに対処するために、大規模な腫瘍バイオバンキングと臨床医の協力により、細胞株と比較してより患者固有の遺伝的および治療的プロファイルを保持する患者由来腫瘍オルガノイド(PDO)などの忠実度の高いin vitroモデルの開発が推進されています3,4,5。一方、ラボの自動化と創薬の進歩により、ハイスループット ワークフローにシームレスに統合できるプラットフォームが求められています。既存のプラットフォームは生物学的忠実度またはスケーラビリティのいずれかに対処していますが、両方の課題を同時に解決できるものはほとんどありません6,7,8。主要な疾患の特徴を再現する自動化されたハイスループットモデルの開発は、生物医学研究を進歩させ、トランスレーショナルアプリケーション向けのデータ生成を加速するために不可欠です。

多くの新しいモデルは、PDOなどの特殊な細胞型をハイスループットで培養することに関連する課題に対処することを目的としています(図1)。オルガノイドを96ウェルまたは384ウェルプレートでヒドロゲルと混合する標準プラットフォームには、いくつかの制限があります:(i)細胞ゲルの体積が多いと栄養素のアクセスが一貫しない、(ii)メニスカスの曲率がイメージングアーティファクトと細胞勾配を生み出す、(iii)ヒドロゲル播種はバッチや人員間で均一性を欠いており、(iv)自動製造および自動顕微鏡との非互換性、(v)通常は柔らかく壊れやすいリスクサンプルである細胞外マトリックス(ECM)の使用生理学的組織密度での破壊または収縮性細胞型の取り込み 1,9。現在、プレートベースのPDO研究の大部分は、細胞ゲルをプレート10,11に手動で播種するか、ヒドロゲルを粘度の低い培地で希釈し、細胞をウェル底に遠心分離して適切な光学面12,13に配置するゲルオーバーレイ法のいずれかによって実施されています.どちらのアプローチも、長期的な培養のための機械的サポートを提供できません。以前の観察(未発表データ)に基づくと、標準ウェルプレート内の細胞と混合された市販のヒドロゲルは、12ウェルのうち9ウェルで12日間にわたってウェルの表面から収縮しますが、ゲルオーバーレイ法には生理学的細胞とマトリックスの相互作用が欠けています。さらに、得られた培養物は、ウェル内のスペースの制限により長期間維持することができず、高い試薬対細胞培地比を必要とするアッセイと互換性がありません14,15,16。これらの実際的な障壁は 3D モデルの採用を妨げ、現場全体での実験の再現性を制限します。

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図1:スケーラビリティと生物学的関連性に基づく培養モデルの評価。 プレートスループットと生物学的関連性(x軸)によって定義されるスケーラビリティ(y軸)に沿ったさまざまな in vitro および in vivo 培養システムの相対的な位置付けは、スループットの可能性と生理学的忠実度の間のトレードオフを強調しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

これらの課題に動機付けられて、薄いセルロース足場の高い気孔率と機械的強化を利用して、96ウェルと384ウェルの両方のフォーマットで利用可能なオルガノイドベースの組織用足場支持プラットフォーム(SPOT)を開発しました。SPOTは、プレートレイアウトに一致する以前に開発された浸潤法17を使用してポリマーのプレパターン足場を組み込んでおり、正確な細胞ゲル液滴の配置を可能にし、ヒドロゲル相の構造的サポートを提供します(図2A)。足場への毛細管吸湿発散性は、細胞ゲル溶液を導き、機械的に強制された生体複合ネットワークを形成します(図2B)。足場の多孔質構造により、細胞ゲルが浸透して薄い層(厚さ約70μm)を形成し、ウェル14の底を覆うために必要な細胞ゲルの量が10倍少ない。SPOT と播種膵管腺癌 (PDAC) PDO との適合性は、代謝アッセイと画像ベースの測定を使用してそれらの成長を評価することによっても実証されました。SPOTは開発以来、オルガノイド培養に携わる研究者にとって大きな汎用性と使いやすさを実証してきました。さらに、SPOTの設計は、平らでメニスカスのないミクロゲル形状により、試薬量の削減とイメージング機能の向上により、ユーザーフレンドリーな拡張性に対応し、均一な光の透過と正確なハイコンテントイメージングを保証します14(図2C、D)。SPOTは、線維芽細胞などの他の関連細胞型との共培養もサポートし、腫瘍微小環境をよりよく再現します18。

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図2:96-SPOTデバイスと画像解析ワークフローの概要。 (A)SPOTプレート製造の概略図:デバイスは、両面ポリアクリル接着剤(黄色で表示)の層を使用して、市販の底なしウェルプレート(上)、PMMAパターンの足場(青で表示)、およびポリカーボネートフィルム(下)を照合することによって組み立てられます。(B)足場ウェルへの細胞播種:細胞を非重合ヒドロゲル(ピンク色で表示)に懸濁し、足場に浸透する各ウェルにピペットで浸透させます。次に、ヒドロゲルをゲル化させて、足場で支持されたヒドロゲル内に細胞をカプセル化します。(C)顕微鏡検査:得られた微小組織は、自動広視野顕微鏡を使用して画像化できます。(D)画像ベースの分析:ゲル中に懸濁した蛍光細胞(緑色)の取得画像は、標準的な画像分析パイプラインを使用して分析できます。1つの96-SPOTウェルにおけるGFP発現KP4細胞の代表的な落射蛍光顕微鏡画像。スケールバーは500μmです。この数値は14から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

SPOTのもう一つの利点は、システムをオープンソースのリキッドハンドラーと統合できるため、PDO培養物の自動化された再現性のある作製を容易にすることです。この進歩により、ユーザーのばらつきが減り、ハイスループット薬物スクリーニングや個別化医療アプローチなどの複雑な実験計画がサポートされます18。SPOTは、不均一な腫瘍環境における細胞表現型の単一細胞ベースの多重特性評価、および消化によるSPOTからのオンデマンド細胞の回収と互換性があることも以前に示されました18。これらの機能により、SPOTは、生理学的に関連する条件下での薬効と細胞挙動を評価するために縦断的な高解像度データが不可欠なスクリーニングアプリケーションのための汎用性の高いツールとして位置づけられています14,18。これらの技術革新を組み合わせることで、SPOTは従来の3D培養システムの重大な制限に対処します。

このプロトコルは、堅牢で再現性のある3Dオルガノイド培養のためのSPOTコンポーネントの作製、プレートの組み立て、および播種方法のための包括的なガイドを提供します。マイクロピペットを使用した手動プレート播種と、96ウェルと384ウェルの両方のフォーマットをサポートするリキッドハンドラーによる自動播種ワークフローの詳細な手順が含まれています。さらに、このプロトコルでは、高い実験基準を維持するために、均一なゲル分布や足場の完全性の検証など、重要な品質管理措置の概要が説明されています。不完全なゲル浸潤、播種中の蒸発、足場の剥離などの一般的な問題に対処するためのトラブルシューティング戦略も提供され、研究者がワークフローを最適化し、信頼できる結果を達成するための実用的なソリューションを提供します。

SPOTは、ゲルの完全性を維持しながらアッセイの実施や培地の変更に関連する課題など、従来のオルガノイドアッセイが直面するギャップを埋めるように設計されています10,11,12,13。この方法の全体的な目標は、12日間にわたってオルガノイド培養をサポートする足場支持プラットフォームを製造することです。さらに、この方法は、手動またはリキッドハンドラー支援播種によるSPOTでの組織アレイの生成もカバーしており、ユーザーは薬物IC50アッセイや低分子スクリーニングなどの下流の摂動を実行できます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、膵管腺癌(PDAC)オルガノイドを例として使用した。これらのオルガノイドは、トロント大学研究倫理委員会のガイドライン(プロトコル#36107)に準拠したプロトコルに基づいて、プリンセスマーガレットがんセンターのUHNバイオバンク(カナダの大学保健ネットワークからのPMLB識別子PPTO.46)から購入されたPDAC患者から確立されました。必要な材料、試薬、機器はすべて 材料表をご覧ください。

1. PMMA-アセトン溶液の作製(タイミング:20分+~8-16時間アイドル)

注:ポリメタクリレートメチル(PMMA)-アセトン溶液は、ウェルの輪郭を描き、ウェル間の漏れを防ぐためにSPOTで使用されます。一般的な手順は、固体PMMAをアセトンに溶解することです。以前は、PMMA-アセトン溶液を使用して、同様の紙足場をパターン化し、培地およびガス交換をブロックし、異なる3D培養モデル17で低酸素症を達成した。ここでは、PMMA-アセトン式を適応させて、SPOT製造用のPMMA浸潤足場を生成します。

  1. 標識された50 mLのコニカル遠心分離管に、1.75 gのPMMA粉末を加えます。次に、ヒュームフードに7.84 mLのアセトンを加え、溶媒の蒸発を避けるためにチューブをしっかりと閉じます。
  2. ポリマーパターンの視覚化が必要な場合は、溶液に5〜10滴のマニキュアを加えます。遠心分離管をしっかりと閉じます。チューブを手動で振って、ポリッシュとPMMA-アセトン溶液の混合を開始します。
    注:複数のプロットバッチで一貫性を保つために、既知の量のマニキュアをアセトンで希釈し、この溶液を7.84 mLのアセトンとしてピペットで移します。
  3. PMMA-アセトン溶液をボルテックスミキサーに一晩置き、溶液が溶解することを確認します。PMMA-アセトン溶液を未開封の場合は、4°Cで最大2週間保存します。

2. PMMA浸透足場の製作

(タイミング:96-SPOTパターニングの場合:セットアップ15分+足場あたり6分、384-SPOTパターニングの場合:セットアップ15分+足場あたり10分)

注:96-/384-SPOT用のPMMA浸潤足場の製造は、作業台(非滅菌環境)でのみ行われます。96/384-SPOTスキャフォールドを作成するには、それぞれのグラフィック編集プロッターソフトウェアまたはベクトルプロッター制御ライブラリが インストールされていることを確認してください。 手順の一部のサブセクションは 96-SPOT と 384-SPOT の両方に適用されるが、他のサブセクションは 1 つのプレート サイズに固有のものであることに注意してください。後者の場合、オプションA(96-SPOTの場合)とB(384-SPOTの場合)が表示されます。(A)96-SPOTパターンには、 3 つのレイヤーがあります。まず、プライミングラインはPMMA-アセトン溶液の一貫した流れを確立します。第二に、96個の円の配列。最後に、出張販売員 (TSP) パターンが井戸間スペースをプロットします。(B)384-SPOTパターンの場合、最初のモジュールにはプライミングラインが含まれています。第二に、ウェルプレートを囲む境界。最後に、384 個の領域が残るようにグリッドがプロットされます。どちらのパターンでも、Liら14で実証されているように、ソースコードを変更することでウェルのサイズを制御できます。

  1. 足場浸透プロセスのセットアップ
    1. PMMA-アセトン溶液(4°Cで保存)を室温で10分間振とうします。プロットが始まるまでチューブホルダーを放置します。
    2. 電源ケーブルを使用してプロッタを電源に接続します。緑色のライトが点滅している場合は、デバイスの電源が入っていることを示します。プロッタのUSBケーブルを、プロット用の指定されたコンピュータに差し込みます。
    3. クリップイーゼルをクッキングシートで覆います。イーゼルの表面全体が覆われていることを確認してください。
      1. 96/384-SPOTパターンのプロットをガイドするには、プリンター用紙に96-/384-SPOTテンプレートを用意します。手順2.2〜2.3は、注射器の代わりにペンを使用し、クッキングシートとティーフィルターの代わりにプリンター用紙を使用します。テンプレートの準備ができたら、クリップイーゼルの上に置き、クッキングシートで覆います。ステップ2.2に進み、プロトコルに従って96-/384-SPOTスキャフォールドを作成します。
    4. バインダークリップを使用してクッキングシートをイーゼルにクランプします(図3A)。足場のシート(つまり、茶ろ紙)を取り、2つの層が融合している側面に沿って切り取ります(図3B)。
    5. カットしたティーフィルター(以下、紙の足場と呼ばれます)を、滑らかな面(ティーフィルターの外側)を上にしてクリップイーゼルに置きます。3つの側面を締め付けます。紙の足場がクリップイーゼルの上で完全に平らになっていることを確認します。印刷領域にしわがあってはなりません。
  2. 96/384-SPOTパターンのプロット
    1. 96-SPOT 用のプロッタ ソフトウェアとファイルをセットアップするには、オプション 2.2.2 に従います。384-SPOTのソフトウェアとファイルをセットアップするには、オプション2.2.3に従います。
    2. プロッタ ソフトウェアと 96-SPOT プロット ファイルのセットアップ
      1. ソフトウェアアプリで、96-SPOT (補足ファイル1;図4A)。メニューバーで、[Extensions]> [Plotter Control]に移動します(図4B)。
      2. 新しいウィンドウが表示されたら、 補足図1に一致するように設定を調整します。[プロッタ コントロール拡張]ウィンドウの[印刷]タブに戻ります。これは後で使用するために開いたままにしておきます。
    3. ベクトル プロッタ コントロール ライブラリ API と 384-SPOT プロット ファイルの設定
      1. コマンドプロンプトウィンドウ(Windows)またはターミナル(Mac)を開きます。コマンドを入力して、指定された対話型コンピューティングノートブックを起動します。ノートブックがブラウザで開くことを確認します。
      2. 384-SPOTコードファイル(補足ファイル2)を選択して開きます。20Gチップ(または384-SPOTパターンの場合は16Gチップ)を使用して、3 mLプロットシリンジで1 mLのPMMA-アセトン溶液を吸引します(図3C)。
        注:10 mLローディングシリンジとEVAチューブの間の流量制御バルブは開いている必要があります(バレルと平行)。浸透プロセスは重力によって駆動されるため、プロット中に一定の分注量を維持するために、3 mLプロットシリンジは常に0.5〜1.5 mLマーキングの間に充填されていることを確認してください。
    4. 3 mLプロットシリンジの先端がPMMA-アセトン溶液の中にある間に、10 mLローディングシリンジとEVAチューブの間の流量制御バルブを閉じます(バレルに対して垂直に持ってきます)。
    5. PMMA-アセトン溶液のチューブをすばやく閉じます。3 mLシリンジをペンホルダーにセットします。ホルダーに対するシリンジの高さを調整して、次の位置合わせを実現します(図3D)。
    6. 3 mLシリンジの先端がプロットされたパターンの原点(つまり、テンプレートパターンの左上の暗い点)に当たるように、クリップイーゼルの位置を調整します。シリンジを取り付けたプロッタペンホルダーを持ち上げて、クリップイーゼルを下にスライドさせます。
    7. 10 mLシリンジをチューブからすばやく外し、大気圧で3 mLプロットシリンジに保管されているPMMA-アセトン溶液に圧力をかけます。流量制御バルブを開きます。
    8. 96-SPOTパターンのプロットを開始するには、手順2.2.9に従います。384-SPOTのプロットを開始するには、手順2.2.10に従います。
    9. 以下で説明するように、指定されたプロッタで96-SPOTのプロットを開始します。
      1. ソフトウェアで、プロッタの[制御拡張]の [適用 ]をクリックします。プロッタの実行が開始され、PMMA パターンがプロットされます。印刷が完了し、プロッタ ペン ホルダがホーム位置に戻るまで、それ以上の操作は必要ありません。
      2. プロット中にプロッタを一時停止するには、プロッタの左側にある小さな銀色のボタンを押します。次に、グラフィックス ソフトウェアのプロッターの [制御拡張機能] > [再開] タブを使用して、停止した場所からプロットを再開するか、ペン ホルダーをホーム位置に戻すかを選択します (補足図 1C(iii))。
    10. 以下に説明するように、指定されたコンピューティング インターフェイスで 384-SPOT のプロットを開始します。
      1. インターフェイスで、[ カーネルの再起動と再実行 ] をクリックします (ツールバーの二重矢印)。コードの実行が開始され、PMMA パターンがプロットされます。パターンのプロットが完了し、ペンホルダーがホームポジションに戻るまで、それ以上のアクションは必要ありません。
      2. プロッタの印刷中にプロッタを一時停止するには、プロッタの左側にある [小さな銀色 ]ボタンを押します。プリントヘッドを手動で左奥まで動かして、ホーム位置に到達します。プロッタを電源に再接続します。96-SPOTのプロットとは異なり、384-SPOTのプロットを一時停止した場所から再開する方法はありません。紙の足場を交換し、コードを最初からやり直します。
  3. シリンジの荷降ろしと清掃
    1. プロットが完了したら、10 mLシリンジをチューブに再度取り付けます。3 mLシリンジをプロッターペンホルダーから取り外し、残りのPMMA-アセトン溶液をストックバイアルに戻すか、前のステップで大幅な蒸発が発生した場合は廃棄します。
    2. 3 mLシリンジのバレルをアセトンでピペッティングして洗浄します。シリンジチューブシステムを保管場所に戻す前に、自然乾燥させてください。
    3. クリップイーゼルからSPOT足場を慎重に外します。
    4. プロットされたSPOT足場を検査して、実験に使用できることを確認します(図3E、F)。ガイダンスについては、トラブルシューティング の表 1 と品質保証と制御の 表 2 と表 3 を参照してください。
    5. すべてのPMMAパターンの足場は、涼しく乾燥した場所のジップロックバッグに入れて保管してください。

3. 96/384ウェルテープ切断

(タイミング:96-SPOTパターニングの場合:テープ5枚あたり15分、384-SPOTパターニングの場合:テープ5枚あたり30分)

注:これは、特に384ウェルテープパターンの場合、テープを正確かつ効率的に切断する最も効率的な方法の1つです。この方法では、テープ (トップ カバー プラスチック) の 1 層をレーザー彫刻して、組み立てプロセス中の使いやすさを向上させる可能性も提供します。あるいは、彫刻プロセスを行わずに、ペーパーカッターを使用してテープを遅い速度で切断することもできます。

  1. 96/384ウェルテープパターンレーザー切断ファイル(補足ファイル3、補足ファイル4)を開き、補足図2Aの次の設定で[プロット]をクリックして、3つの異なる色でコード化された印刷パターンをレーザー切断ソフトウェアにロードします。
  2. レーザー カッターの表面にテープを貼り、テープが表面で滑らかに平らになっていることを確認します。切断中は、紙テープまたは重い重りを使用してテープを押さえます。
    メモ: テープがレーザーカッターの表面で平らであることを確認してください。バンプは、カットテープ、特に384ウェルテープの品質に影響を与える可能性があります。
  3. レーザーカッターのマニュアルに基づいて、テープの位置に合わせて印刷パターンの位置を調整します。
  4. 補足図2Bに示すように、同じレーザーカッター設定を使用して、両方の96/384ウェルテープを切断します。特定の色の線の順序は重要です。緑の線の前に赤い線を先に切ります。最後に青をカットします。
    赤い線:レーザー出力45%、速度80%、1000PPI、Z軸0.50mmのRast/Vestモード。
    緑色の線:レーザー出力7%、速度100%、1000PPI、Z軸0.50mmのRast/Vestモード。
    青い線:レーザー出力50%、速度80%、1000PPI、Z軸0.50mmのRast/Vestモード。
  5. パターンテープは、SPOT組み立てまで適切に保管してください。

4. 96/384-SPOT組立(タイミング:1時間)

メモ: このセクションでは、バイオセーフティキャビネット(BSC)などの無菌環境で96-/384-SPOTデバイスを組み立てる手順について詳しく説明します。あるいは、96-/384-SPOT装置は、非滅菌環境で事前に組み立てられ、エチレンガス滅菌プロセスによって滅菌することもできます。

  1. 組み立て用のSPOT足場の準備
    1. 96 または 384 SPOT の PMMA パターンの足場を取ります。足場の青い部分の周りの余分な紙を切り取ります。青い領域の周囲に5mmの余白を残します。得られたシートは約760 mm x 1300 mmになります。
      注意: プライミングラインを切断しないでください。足場のどちら側が粗いか滑らかかを判断するのに役立ちます(図3E、F)。
    2. 組み立て用の 96-SPOT 足場を準備するには、手順 4.1.3 に従います。384-SPOTスキャフォールドを準備するには、手順4.1.4に従います。
    3. 96-SPOT足場のウェル間スペースのミシン目を行います。
      1. ポリエチレンフィルム(1000 mm x 1500 mm)を硬質アクリルサポート(2700 mm x 2700 mm)の上に置きます。ポリエチレンフィルムで覆われたサポートを作業面に置き、ポリエチレンフィルムの上に足場を置きます(図5A)。
      2. ルーラーの端を最初の 2 行の間に合わせて、この端に沿ってトレースが井戸にトレースされないようにします。
      3. 足場の下部にある定規にトレースホイールを置きます。トラッキングホイールを足場の上部まで上向きに転がし、定規を使用してブレードの経路をガイドします。スキャフォールド上のすべての行間スペース(つまり、7x)に対してこれを繰り返します。
      4. 最初の 2 つの列の間のスペースから始めて、他のすべての列間スペースに対して、手順 4.1.3.2 と 4.1.3.3 を繰り返します。
    4. 以下の手順に従って、384-SPOT足場の井戸間スペースに穴を開けないでください。
      1. 384-SPOT足場のウェル間スペースに穴を開けないでください。手順 4.2 に直接進みます。
  2. SPOT材料・組立装置の滅菌
    1. 印刷された足場、2本の96ウェルテープ(または384ウェルテープ)、96ウェルボトムレスプレート(または384ウェルボトムレスプレート)、96ウェルプレートカバー(または384ウェルプレートカバー)、ポリカーボネートフィルム、ポリジメチルシロキサン(PDMS)スラブ、再密封可能なビニール袋、ピンセット、および精密ナイフをBSCに置き、片側を20分間UVします(図5B)。
    2. すべての材料と組立装置を反対側に裏返し、さらに20分間UVします。
  3. 最初の96/384ウェルテープへの足場の取り付け
    1. 足場を粗い面を上にして(図3F)PDMSスラブに置き、列が水平になるようにします。下塗り線を使用して、どちら側が粗いかを判断します(右揃えの下塗り線は粗い面が上になっていることを示します)。
    2. 足場の上(または下)にしわや気泡がないように、足場をPDMSスラブに滑らかにします。両面テープの刻印されていない面から保護層を剥がします。テープの中央を少し締め、テープの中央の2列を足場に合わせます。
    3. 位置合わせしたら、テープの中央を押し下げます。テープを足場に真ん中から外側に向かって滑らかにします。
      注:正しく位置合わせされていない足場は、ウェル播種領域に明らかなPMMAパターンが重なります。
    4. ピンセットを使用して PDMS スラブから足場を慎重に取り外し、将来の製造のためにスラブを保管します。
  4. 2番目の96/384ウェルテープへの足場の取り付け
    1. 足場を作業台に置きます。足場を裏返して、滑らかな面(テープで留めていない面)が上を向くようにします。
    2. 2 番目のテープの刻印面から中央の保護層を取り外します。テープの中央の 2 つの列が露出していることを確認します。刻印されていないテープデザインを使用する場合は、片側から保護層を完全に取り除きます。
    3. テープの中央を少し締め、テープの中央の2列を足場に合わせます。
    4. テープを足場に合わせたら、テープの中央を押し下げます。刻印テープのデザインを使用する場合は、テープの露出した中央部分に隣接する他の 2 つの保護層を取り外します。テープを足場の上に、中央から外側に向かって滑らかにします。
  5. 底なしプレートへの足場の取り付け
    1. 足場の粗い側からテープの保護層を剥がします。刻印テープデザインを使用する場合は、中央の保護層のみを取り外します。
    2. 足場を底なしプレートの下側に合わせます(蓋付き)。位置合わせしたら、足場の中央をプレートの下側に押し付けます。刻印デザインを使用する場合は、露出した中央に隣接する保護層を取り外してください。足場を真ん中から外側に向かってプレートの上に滑らかにします。
  6. ポリカーボネートフィルムへの足場の取り付け
    1. ピンセットを使用して、ポリカーボネートフィルムの保護層を慎重に緩めます。緩んだら、フィルムから保護層をゆっくりと剥がします。顕微鏡イメージングの光学特性に影響を与えるため、フィルムにくぼみを作らないでください。
    2. ポリカーボネートフィルムの反対側でも手順4.6.1を繰り返します。両方の保護層が取り除かれたら、フィルムを作業台に置いて置く。.
    3. プレート底に貼られたテープから保護層を剥がします。ポリカーボネートフィルムを真ん中から外側に向かって足場に押し付けます。
    4. ポリカーボネートフィルムをプレートの底にしっかりと押し付けて、すべてのウェルがはっきりとした境界線になるようにします。
    5. 精密ナイフを使用して、プレートの底から余分な材料を慎重に切り取ります。
      注:プレートやウェルに切り込まないように特に注意してください。ナイフが簡単に切れない場合は、プレートに食い込んでいないか確認してください。
  7. 組み立て後の96/384-SPOTの保管
    1. 96-SPOTを完全に組み立てたら、再密封可能な透明なビニール袋に入れます。バッグをBSCの外に持ち出します。
    2. プレートの下側に硬いアクリルサポートを置きます。アクリルサポートを反対側の角のプレートにクランプします(図5C)。クランプを使用してくださいamp使用前に、各角を少なくとも30分間使用してください。
    3. 使用するまで、プレートは清潔で乾燥した場所に保管してください。

5. 96/384-SPOTシード(タイミング:2時間45分)

注:このセクションでは、96-/384-SPOTデバイスをシードして均一な3D微小組織を作成する手順について詳しく説明します。播種プロセスでは、定義された細胞ゲル量(たとえば、96-SPOTの場合は5 μL、384-SPOTの場合は2 μL)を事前に組み立てられたSPOT足場に慎重に分注します。均一な浸潤とゲル分布を確保するために、細胞ゲル液滴は毛細管吸湿発散性を介して足場の多孔質構造に沿って導かれます。このステップは、マイクロピペットを使用して手動で実行することも、液体処理で自動化することもできます。播種後、プレートを37°Cでインキュベートして、ゲル重合と細胞カプセル化を可能にします。

  1. 96/384-SPOTプレートの作製
    1. 96-/384-SPOTのクランプを外し、アクリルサポートを底から取り外します。
    2. BSCで、ビニール袋からSPOTを取り出します。UVをオンにしてプレートの内側を滅菌し、蓋を20分間蓋をしてから、蓋を閉めてプレートの底にひっくり返してさらに20分間UV処理を行います。
    3. 70 μLのPBSを96-SPOTプレートの各ウェル間スペースにピペットで移動します。PBSを384-SPOTプレートにピペットで入れないでください。播種する前に、プレートを4°Cで少なくとも30分間冷やします。
  2. 細胞の調製
    1. 推奨される取り扱いに基づいて、培養フラスコまたはゲルドームからオルガノイドから細胞を切り離し、製造元の指示に従って血球計算盤を使用して細胞量をカウントします。細胞懸濁液の細胞密度(すなわち、 mLあたりの細胞数)に注意して、所望の播種密度に基づいてステップ5.4.1〜5.4.2に必要な細胞懸濁液量を計算します。
  3. ゲルの調製
    1. 17、19、20、21に最適化されたヒドロゲル調製手順に従って、1 mLの3 mg / mL1型ウシコラーゲンを1.5 mL微量遠心チューブに分注してヒドロゲルを作成します。
      注:成分と得られた混合物は、調製期間中ずっと氷上に保管する必要があります。
    2. 125 μLの10倍濃縮ミニマムエッセンシャル培地(MEM)をウシコラーゲンに分注します。混合物がピンクから黄色に変わるまでゆっくりと上下にピペットで混ぜます。
    3. 8 μLの0.8 M重炭酸ナトリウムをウシコラーゲン混合物に分注します。混合物が淡いピンク色になるまでゆっくりと上下にピペットで混ぜます。調製後30分以内に混合溶液を使用して、複数の実験で一貫したゲル化を確保します。
      注:混合物が黄色のままの場合は、淡いピンク色になるまで0.5 μLのアリコートに0.8 Mを加えて溶液をpH 7に滴定します。オプション:同じ手順に従って、より高いコラーゲン濃度を必要とする培養物用にゲルを調製できます。オルガノイドの培養には、Landon-Brace et al.17によって特徴付けられるヒドロゲルブレンドを使用します。
  4. ゲル中の細胞の懸濁液
    1. ターゲット細胞ゲル密度に必要な量の細胞懸濁液を微量遠心チューブに分注し、300 x g で5分間遠心分離します。
    2. 上清を吸引し、細胞ペレットをゲルに再懸濁します(量は目標濃度によって異なります)
  5. 96-/384-SPOTプレートの手動シード
    1. 96-/384-SPOTプレートを冷凍保冷剤の上に置きます。96-SPOTをシードするには、手順5.5.2に従います。384-SPOTをシードするには、手順5.5.3に従います。
    2. 96-SPOTの手動シード
      1. 10 μLのピペットチップに細胞とゲルの混合物をプレコートします。20 μLピペットを使用して5 μLのゲルを吸引し、先端に液滴が形成されるまで最初のストップまで排出します。液滴を井戸の真ん中に触れます。
        注:ピペットを2番目の停止まで押し込んでゲルを排出すると、気泡が発生する場合があります。ウェル間の一貫したゲル化のために、すべてのウェルは5分以内に播種する必要があります。
      2. 必要なウェルをすべて播種した後、プレートを覆い、製造元の指示に従って37°Cで45分間インキュベートし、ゲルを重合させます。200 μLの培地を各シードウェルに分注し、必要なイメージングまたは摂動を行う前に、最低1時間中断することなくインキュベートします。
    3. 384-SPOTの手動シード
      1. 10 μLのピペットチップに細胞とゲルの混合物をプレコートします。10 μLピペットを使用して2 μLのゲルを吸引し、先端に液滴が形成されるまで最初のストップまで排出します。
        注:マルチチャンネル10 μLピペットを強くお勧めします。
      2. 液滴を井戸の真ん中に触れます。必要なウェルをすべて播種した後、プレートを覆い、製造元の指示に従って37°Cで45分間インキュベートし、ゲルを重合させます。
      3. 60 μLの培地を各シードウェルに分注し、必要なイメージングまたは摂動を行う前に、中断することなく最低1時間インキュベートします。
    4. リキッドハンドラーを使用した96/384-SPOTの播種
      1. 細胞とゲルの混合物の調製中に、リキッドハンドラーとそのHEPAフィルターモジュールを強にオンにします。リキッドハンドラー内に70%エタノールを慎重にスプレーし、エタノールを染み込ませたペーパータオルで拭きます。
      2. ピペットヘッドのキャリブレーションを実行する前に、96-SPOTまたは384-SPOTシードプロトコル(補足ファイル5 または 補足ファイル6)のいずれかをロードします。スロット 1 と 4 に温度モジュールを取り付けます( 図 6A)。
      3. 校正の目的で、P20およびP200フィルターチップの指定されたボックスを使用してください。それぞれスロット 5 と 6 にロードします(図 6B)。ソフトウェアに表示されるプロンプトに基づいてピペットヘッドを校正します。キャリブレーション後、スロット5と6にシードするための滅菌P20およびP200フィルターチップボックスに切り替えます。表面に70%エタノールを再スプレーし、播種するまでドアを閉めます。
        注意: 96-/384-SPOTプレートの上部にチップを正確に校正することが重要です。プレートの上部に対する先端の z 軸を視覚化するために、プレート シーリング テープを使用することをお勧めします。理想的な位置は、マルチチャンネルヘッドの先端がすべてプレートシーリングテープに接触し、小さなへこみができる場合です。
    5. 両方の温度モジュールをオンにし、細胞とゲルの混合物の調製中に細胞が最後の回転ステップにある間に4°Cに設定します。ステップ5.4の完了後、BSC内の8ストリップ0.2 mL PCRチューブの各チューブに所望の量の細胞-ゲル混合物をロードします。
      注:各チューブにロードされる細胞-ゲル混合物の最小量は、96-SPOT:5 μLにシードする必要のあるカラムの数とデッドボリュームを掛けたものです。384-SPOT:2 μLにシードが必要なカラム数を掛け、デッドボリュームを加えた値を2倍します。デッドボリュームは、気泡や末端の不完全なカラムを避けるために、チューブあたり約10〜20 μLにすることをお勧めします。
    6. 細胞-ゲル混合物を氷上のBSCから移す前に、8ストリップフラットキャップを使用して8ストリップ0.2mL PCRチューブを閉じます。
    7. 事前に冷却したSPOTプレートを、平底プレートフォーマットブロックを使用してスロット4の温度モジュールにロードします(図6B)。
    8. 細胞とゲルの混合物を含む8ストリップ0.2 mL PCRチューブを、96ウェルフォーマットブロックを備えたスロット3の温度モジュールにロードします。
    9. フラットキャップとSPOTプレートの蓋を開け、リキッドハンドラーの中に保管しますが、使用済みのスロットから離して保管してください。P20およびP200フィルターチップボックスの蓋を開けます。
    10. プロトコルを実行します。必要なウェルをすべて播種した後、プレートを覆い、製造元の指示に従って37°Cで45分間インキュベートし、ゲルを重合させます。
    11. 200 μLまたは60 μL(96-/384-SPOT)の培地を各シードウェルに分注し、必要なイメージングまたは摂動を行う前に、中断することなく最低1時間インキュベートします。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

紙足場のPMMAパターニングは、ウェル間の内容物交換を防ぐ物理的な障壁として機能します。この設計は、隣接するウェルが化学的および生物学的に分離されたままであることを保証し、培地、薬物、分泌因子、さらには細胞の意図しない拡散を防ぐために重要です14。PMMAを組み込むことで正確な区画化が可能になり、SPOTはクロスコンタミネーションを最小限に抑える必要があるハイスループットスクリーニングおよび共培養研究のための信頼できるプラットフォームになります14,18。推奨される品質保証および品質管理実験を表3および表4に示します。細胞-ゲル混合物の播種実践と長期オルガノイド培養を進める前に実施すべき最も重要な品質保証実験の1つは、組み立てられたプレートの構造的完全性とPMMAバリアの有効性を保証するためのリークテストです。正常に製造されたプレートでは、媒体の漏れは観察されません。フルオレセインとPBSを交互のウェルに添...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、96ウェルおよび384ウェルSPOTの製造と使用に関する詳細なガイドが提供され、組み立て、手動、およびリキッドハンドラー支援による細胞ゲル播種をカバーしています。従来のハイドロゲルプラグシステムとは異なり、SPOTはメニスカス関連のアーティファクトを排除し、前述のようにオルガノイドの非破壊的なin situイメージングを容易にします14,16,22。さらに、足場は構造的なサポートを提供し、長期的な培養の安定性を確保します。SPOTにより、研究者は縦断イメージングを通じて集団動態を追跡し、腫瘍オルガノイドやその他の3D細胞培養で代謝分析を行うことができ、エンドポイントのみの評価よりも大きな利点をもたらします14,18。さらに、足場の支...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、画像取得におけるジェニファー・ラムの支援を認めています。図1、図2、図7Aは BioRender.com で作成しました。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会 (NSERC) の APM へのディスカバリー助成金 (助成金 #RGPIN-2021-03488) によって支援されました。カナダ・ファースト・リサーチ・エクセレンス(CFREF)メディシン・バイ・デザイン・グランド・クエスチョン・プログラムをAPMに提供。NSERCカナダ大学院奨学金-RCへの博士課程。R.C.へのピーターバラKMハンター慈善財団賞。NTLに授与された国立研究評議会(NRC)のCRAFTフェローシップ。NSERC CREATE TOePからNTLへ。ZKへのNSERC学部生研究賞。トロント大学優秀賞を CMT に授与されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.2mL PCRチューブ(8本入り) ザルシュテット72.985.002
1.5mL遠心分離管フロッガバイオLMCT1.7B
1000-&ミュー;Lピペットチップ食4-1019-260-000
10mL血清ピペットフロッガバイオ394010
10mLシリンジBD, カナダ302995
10x 最小必須培地 (MEM 10x)ギブコ11430030
150mm皿コーニング430599
ルアーロック接続付き16ゲージディスペンスチップ米国イリノイ州マクマスターカー6699A2
20&マイクロ;Lフィルターチップラックオープントロン999-00099
200&マイクロ;Lフィルターチップラックオープントロン999-00081
200-&ミュー;Lピペットチップ食4-1030-260-000
ルアーロック接続付き20ゲージディスペンスチップ米国イリノイ州マクマスターカー6699A4
384ウェル底なしウェルプレート(黒)グライナー82051-544
3mLシリンジ BD, カナダ309657
50mLポリプロピレン製コニカル遠心分離管VWRのCA21008-940
50mLポリプロピレン製コニカル遠心分離管VWRのCA21008-940
96ウェル無底ウェルプレート(黒)グライナー82050-714
アセトンフィッシャーサイエンティフィックA18-1
分析天びん該当なし該当なし
Inkscape の AxiDraw 拡張機能 (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)該当なし該当なし
AxiDraw Python API (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) 該当なし該当なし
AxiDraw V3 高性能個人用筆記および描画機Evil Mad Scientists、アメリカ該当なし
ウシコラーゲン(PureCol 3 mg/ml)アドバンストバイオマトリックス5005
選択した細胞株該当なし該当なし
クリップイーゼル(AxiDraw V3パッケージに含まれています)Evil Mad Scientists、アメリカ該当なし
最適な培地該当なし該当なし
汚れを捕らえる保護テープ3メートル6851 PN36851
両面ポリアクリル粘着テープ(800mm×1200mm)接着剤研究、ARcare90106NB
ウシ胎児血清(FBS)ギブコ12483-020
フィナムティーフィルターXL リエンシュ&リエンシュHeld GmbH &Co. KG、ハンブルク、ドイツ420.69.00
0.2mL PCRチューブ用フラットキャップ(8本入り)ザルシュテット65.989.002
頑丈なプラスチックスプリングクランプベンチマーク1024-554
HEPAモジュール–110-130V 60Hzモデルオープントロン999-00109
保冷剤(冷凍、1400mm×1800mm)該当なし該当なし
Inkscapeソフトウェア該当なし該当なし
レーザーカッターユニバーサルレーザーシステムVLS3.75
外径0.07インチのミニチュア酢酸エチルビニル(EVA)チューブ米国イリノイ州マクマスターカー1883T3
マルチチャンネル電動ピペット P20 (Gen2)オープントロン999-00005
マルチチャンネル電動ピペット P300 (Gen2)オープントロン999-00006
ネールポリッシュサリー・ハンセンSBS-006861オプション、PMMAインクの着色用
オープントロン OT-2オープントロン999-00111
P1000ピペットギルソンFA10006M
P200 8チャンネルピペットギルソンF144072
P200ピペットギルソンFA10005M
ペーパータオル該当なし該当なし
パラフィルム株式会社ベミスカンパニー52859-079
クッキングシート  該当なし該当なし
パスツールピペットVWRの14672-380
ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S)シグマ・アルドリッチP4333
ポリ(メタクリル酸メチル)(PMMA)シグマ・アルドリッチ182230
ポリカーボネートフィルム(760mm×1300mm)マクマスター・カー85585K102
ポリジメチルシロキサンモノマーおよび架橋剤(PDMS、1500 mm x 2700 mm)エルズワース接着剤4019862
精密ナイフ該当なし該当なし
硬質アクリルサポート(ウェルプレートの底にフィットするサイズ)マクマスター・カー8560K239
硬質段ボールサポート該当なし該当なし
ルーラー該当なし該当なし
はさみ 該当なし該当なし
重炭酸ナトリウム(蒸留水中0.8M)シグマ・アルドリッチS6014
アルミブロック付き温度デッキ(Gen2)オープントロン999-00097
トレースホイール HEEPDD(アマゾン)B07YQWB284
透明テープ 該当なし該当なし
トリパンブルーギブコ15250-061
トリプシンギブコ25200-056
ピンセット該当なし該当なし
ボルテックスミキサー 該当なし該当なし

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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