この論文は、血管幹細胞の大動脈血管壁への正確な超音波ガイド下送達のためのプロトコルを提示します。この技術は、血管壁を効果的に標的とし、大動脈瘤や解剖における血管修復を促進します。
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この記事について
サマリー
要約
大動脈瘤と解離破裂は、生命を脅かす心血管の緊急事態です。疾患の早期予防と進行の制御は、患者の転帰を改善するために不可欠です。血管幹細胞は、さまざまな血管疾患における血管損傷の修復に重要な役割を果たします。しかし、血管内幹細胞注射療法では、血管壁内での外因性幹細胞の効率的な生着を確保する上で課題に直面します。
大動脈疾患における幹細胞の送達のためのより効果的で低侵襲なアプローチを探求するために、超音波ガイド下精密標的幹細胞送達技術を開発しました。具体的には、この技術は、超高解像度の小動物カラードップラー超音波イメージングシステムを利用して、大動脈疾患マウスモデルの上行大動脈の血管壁を正確に特定しました。続いて、マトリゲルの25μL内に混合した1×10個の6mCherry標識血管幹細胞を29G針を用いて注入した。病気の進行は小動物の超音波によって監視されました。最後に、大動脈を採取し、ライトシート顕微鏡による3Dイメージングを使用して分析し、注入された血管幹細胞を追跡しました。
以上の結果から、注入された血管幹細胞は、最小限の侵襲性で上行大動脈の血管壁に正確に送達され、それによって大動脈瘤や解剖における血管修復を効果的に促進したことが示されました。この超音波ガイド下幹細胞送達技術は、幹細胞移植のための有望で低侵襲な方法を提供し、将来的には大動脈瘤や解離、その他の関連する心血管疾患の進行を臨床で制御する可能性があります。
概要
大動脈瘤および解離(AAD)は、一般的で致死性の高い心血管疾患であり、通常は潜行性の発症と急速な進行を特徴としています。AADの発生率は1.3%から8%の範囲であり、毎年世界中で150,000〜200,000人が死亡していると推定されています1,2。急性の発症と微妙な臨床症状のため、多くの患者は診断時までに重篤な状態にあり、治療のための最適なウィンドウを逃しています。βアドレナリン遮断薬やアンジオテンシン受容体遮断薬などの薬理学的治療は、動脈瘤の拡大をある程度遅らせることができますが、これらの治療法は主に症状の緩和を提供し、AAD3 の発症または進行を効果的に予防することは示されていません。
現在、臨床管理は、大動脈基部再建術、上行大動脈置換術、ベントール手術、大動脈瘤の血管内修復術など、主に外科的介入に依存しています 4,5。しかし、遺伝性AADの患者、特にまだ外科的適応に達していない患者にとって、効果的な病因学的治療は不足しており、薬理学的アプローチは長期的な疾患の進行を制御するのに苦労しています。マルファン症候群(MFS)の患者では、治療によって大動脈拡張を遅らせることができますが、一部の個人は大動脈拡張の速度が速く、大動脈解離のリスクが高くなることが研究で示されています5。したがって、手術基準をまだ満たしていないこれらの患者に効果的な介入を提供することは、依然として重要な臨床的課題です。より的を絞った治療戦略の開発は、大動脈疾患の治療において取り組むべき重要な問題となっています。
AAD の病因は、主に平滑筋細胞 (SMC) の広範なアポトーシスと培地の菲薄化を伴い、大動脈壁の構造的脆弱性につながります。具体的には、大動脈SMCの進行性の喪失はAADの特徴であり、SMCのアポトーシス、細胞外マトリックス(ECM)の分解、免疫細胞の浸潤、および酸化ストレスの増加によって現れます2。血管幹細胞は、血管壁に存在する成体幹細胞の一種で、SMCまたは内皮細胞に分化することができます。正常な生理学的条件下では、幹細胞は静止したままですが、病的な条件下では、幹細胞は活性化され、自己複製と分化を経て組織修復に寄与します6。最近の研究では、血管損傷、特に静脈移植片のリモデリング、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、高血圧、およびAAD7,8,9,10,11,12,13などの疾患または病理学的状態における血管壁幹細胞の重要な役割が強調されています。
組織特異的な局所注射や全身静脈内注入など、幹細胞送達のための既存の技術は比較的進んでいますが、幹細胞の大動脈壁への送達には大きな課題があります14,15。大動脈の急速な血流は、血管壁の動的な収縮と弛緩と相まって、効率的な細胞送達を達成し、血管組織に移植された細胞の長期的な生存を確保することを困難にします。
この研究では、超音波ガイド下での血管壁幹細胞の低侵襲で正確に標的を絞った送達を可能にする、新しい閉鎖血管壁エピメンブレン注入技術について説明します。このアプローチには、開胸術や開腹術を必要とせずに簡単に実行できるという利点があり、関連する合併症を回避できます。また、注入プロセス中の柔軟性も向上し、免疫反応やその他の副作用を最小限に抑えながら、必要な領域に幹細胞を目標濃度にすることができます。さらに、組織光学的透明化技術の進歩により、マウスの全身の細胞内分解能イメージングが可能になり、組織構造の高解像度三次元再構成、病理学的メカニズムの調査、疾患モデリング、薬物スクリーニングなどに幅広い応用が可能になりました。ライトシート顕微鏡と組み合わせると、この技術は高い空間分解能の3Dイメージングを提供します16。このアプローチを用いることで、注入された血管幹細胞を追跡し、その遊走能力を観察することができます。したがって、超音波ガイド下幹細胞送達は、幹細胞移植のための有望な低侵襲法を表しています。
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プロトコル
すべての実験手順は、首都医科大学の動物研究委員会の規則に従って実施され、首都医科大学の動物福祉および倫理委員会によって承認されています。
1. 注入した血管幹細胞の調製
注:血管幹細胞の注入後の状態および効果を検証するために、Sca1+細胞は、前述の17,18,19のように免疫磁気ビーズ選択を用いて単離され、その後の細胞位置および分布の観察のためにmCherryレポーターを有するレンチウイルスでトランスフェクションされ、次いで培養される。継代5以前の細胞で、良好な増殖条件およびmCherry標識Sca1+発現を有する細胞を、その後の実験20に使用する。
- 6-8週齢のC57BL/6Jマウスから大動脈を採取し、顕微鏡下で外膜組織を分離し、約0.5mmまでミンチします。0.04%ゼラチンを5%CO2インキュベーターで37°Cの培養フラスコの底に塗布し、細胞の接着と増殖を促進します。20分後、ゼラチンを吸引し、ひき肉した組織を培養フラスコ17,21の底に置き、底を上に向けて2〜3時間待ちます。組織が培養フラスコの底部にしっかりと付着した後、培養フラスコの底を下向きに置き、フラスコに培地を加え、5% CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートします。
- 3時間後、培養フラスコを取り出し、20%ウシ胎児血清、10 ng/mL LIF、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM培地を加えます。
- 3日後、細胞が組織から移動し、80%〜90%のコンフルエンスに達したら、0.05%のトリプシンを添加し、1:3の比率で継代培養します。
- 継代3では、培地を15%のウシ胎児血清を含むDMEMと交換します。継代5では、培地を10%ウシ胎児血清を含むDMEMと交換します(他の成分は変更されません)。
- 外膜血管細胞を消化し、抗Sca1+ マイクロビーズと氷上でインキュベートします。磁気細胞選別システムを備えたカラムに細胞懸濁液を加え、それらを回収します18。継代5以前の良好な増殖条件の細胞を、その後の実験に用いてください。
注:細胞の活力を確保するために、 in vivo 注射用の細胞は、トリパンブルー染色によって決定されるように、≥90%の生存率を持つことが推奨されます。 - 注射の1時間前に、0.05%トリプシンを細胞に加え、血球計算盤を使用して細胞をカウントし、室温で200 × g で5分間遠心分離して上清を除去します。
- 幹細胞移植の担体として、4×107 細胞/mLの濃度でマトリゲル(4°Cで解凍済み)に細胞を再懸濁し、in vivo成長環境を模倣します。混合物を穏やかにボルテックスし、注入の準備ができるまで氷の上に保ちます。
2. マウスの術前準備
- マウスを注射の12時間前に、水を制限せずに絶食させます。.
- 麻酔導入チャンバーと超音波プラットフォームを75%エタノールで完全に拭きます。
- 眼軟膏を塗布し、マウスを麻酔導入チャンバーに入れ、酸素流量を1 L / minに設定し、イソフルラン濃度を2〜3%に調整します。疼痛反射が消え、麻酔が成功したことを示すまで待ってから、マウスをチャンバーから慎重に取り出します。
- マウスの鼻と口を麻酔マスクの下に置き、イソフルラン濃度を1.5〜2%に調整します。マウスを37°Cのプラットフォーム上で背側に配置して、腹部への露出を最大化します。
- プラットフォーム上の4つの電極に導電性ゲルを塗布し、医療用テープを使用してマウスの4本の足を電極に固定し、生理学的状態を監視します。
注:オペレーターは、滅菌手袋、マスク、サージカルキャップ、滅菌サージカルガウンを着用します。 - 滅菌綿棒を使用して脱毛クリームを注射部位に塗布し、1分間放置してから、新しい綿棒で優しく拭き取ります。ヨウ素チンキ剤3倍を使用して注射部位を消毒します。
- 手術部位をドレープし、滅菌シリンジを無菌的に調製し、滅菌フィールドを維持します。
3. 血管壁細胞の超音波ガイド下注射
注:すべての超音波検査は、超音波画像診断システムとソフトウェアを使用して行われます(資料の表を参照)。中心周波数が40MHzで、29Gの針を使用するプローブを使用します。
- 超音波プラットフォームを床に対して約30°の角度に調整します。オペレーターに動物の右側を向き、動物の頭を左に向けてもらいます。脱毛および消毒された領域に超音波ジェルを塗布します。
- プローブを胸骨の右側に配置して、大動脈弓の長軸を表示します。
- マトリゲル中の1 × 106 血管壁幹細胞の懸濁液25 μLを29 G針にロードします。注射前に針先を滅菌アルコールで拭いて、幹細胞の異所性移植を最小限に抑えます。
- 細胞懸濁液を含むシリンジを超音波ガイド下注射装置に固定し、針の方向がプローブと位置合わせされ、胸壁に対して45°の角度になるようにします。
- 注射針をゆっくりと超音波視野に導き、焦点面に調整して、注射経路のマーキングラインに合わせます。
- 針が皮膚の端に近づいたら、鈍い鉗子を使用して皮膚と腹壁をつかみ、針を胸壁を通して急速に進めます。
- 超音波ガイドの下で、針を無名動脈と大動脈弓の間の外膜領域に向けます。シリンジを上下にそっと取り外して、針の位置を確認します。
- シリンジを押して、細胞懸濁液を標的領域に注入します。
- 注射針をゆっくりと引き抜き、標準的な手順に従って穿刺部位を消毒します。
注:外科的処置の後、マウスは完全に意識があり、胸骨の横臥を維持できるようになるまで37°Cの加熱パッドに置き、加熱パッド上で継続的に監視する必要があります。その後、動物を新鮮な寝具のある清潔なケージに移します。猫背の姿勢や活動の低下など、術後の合併症の可能性を評価するために、24時間ごとに継続的なモニタリングを実施する必要があります。
4. 血管組織の清澄化
- mCherryで標識したSca1+ 幹細胞を、無名動脈と大動脈弓の接合部の外膜領域に注入します。4週間後、CO2を使用してマウスを安楽死させ、灌流後に大動脈組織を採取します。
- 大動脈組織を4%パラホルムアルデヒドで室温で4時間固定し、続いてPBS洗浄を3×1時間行います。組織を組織透明溶液に移し、37°Cの振とうプラットフォーム上で2日間インキュベートして透明性を確保します。
注:参照されている組織透明化溶液は、ddH2O11に溶解した10%N-ブチルジエタノールアミンと10%Triton-X-100の混合物です。 - ティッシュをPBSで室温で3 x 2時間洗浄します。組織をCD31一次抗体(1:100)を含むPBSに移し、4°Cで24時間インキュベートします。
- PBSで3 x 1時間洗浄した後、組織をロバ抗ヤギ(1:800)と室温で3〜4時間インキュベートし、続いてPBSを3 x 1時間洗浄します。
- 組織を屈折率マッチング溶液に移し、透明性を維持するために少なくともさらに2日間インキュベートします。
注:参照された屈折率マッチング溶液は、ddH2O11に溶解した45%アンチピリン、30%ニコチンアミド、および0.5%N-ブチルジエタノールアミンの混合物です。 - 2%アガロースゲルを調製し、加熱して溶かし、アガロースゲルに透明組織を埋め込み、直径5mmの円柱状を保つために冷まします。ライトシート顕微鏡のステージに固定し、3Dスキャンします。次の仕様の下で: 照明対物レンズ: 10x 0.3 開口数 (NA) 水浸レンズの 2 ユニット。検出対物レンズ:10x 0.5 NAマルチイマージョンレンズ1ユニット。倍率チェンジャー:1倍/0.75倍、撮像を行いました。
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結果
血管幹細胞の超音波ガイド下送達
この研究では、小動物カラードップラー超音波画像診断システムを使用して超音波ガイド下注射を行いました(図1A、B)。処置中、マウスを加熱された超音波プラットフォームに固定し、必要に応じてプラットフォームと超音波プローブを調整しました(図1C)。
図1:超音波ガイド下注射装置と動物プラットフォーム上でのマウスの最適な位置決め。 (A)統合鉄道システムの概要。(B
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ディスカッション
遺伝子変異によって引き起こされるAADは遺伝性AADに分類され、その中でMFSが最も一般的です。AADは、MFS22の最も生命を脅かす合併症です。この状態を調査するために、大動脈瘤を自然に発症するMFSの確立されたマウスモデル(Fbn1C1041G /+マウス)を採用しました。また、このモデルは、他のモデリングアプローチに関連する追加の組織損傷や実験のばらつきも回避します。本研究では、mCherry標識Sca1+ 血管幹細胞を超音波ガイド下で Fbn1C1041G/+ マウスの上行大動脈壁に精密に送達しました。疾患の進行は、小動物超音波画像法を用いてモニターした。さらに、ライトシート顕微鏡は、注入された幹細胞の遊走を追跡するために、大動脈の3Dイメージングと分析に利用されました。私たちの結果は、このアプローチが血管壁を効果的に標的とし、幹細胞の移動能力を維持し、大動脈瘤や解剖における血管修復を大幅に強化することを示していま...
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開示事項
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
謝辞
この研究は、National Science and Technology Major Project(2023ZD0503304)、National Natural Science Foundation of China(32271231)、およびNational Key Research and Development Program of China(2023YFC3606500)からの助成金によって支援されました。3Dイメージングの技術サポートを提供してくださったChao Zheng博士に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1%ゼラチン溶液 | オリセル | GLT-11301 | |
| 1.5 mLマイクロチューブ | アクシーゲン | MCT-150-C | |
| 10 & ムー;Lピペットチップ | ラボセレクト | T-001-10 | |
| 1000 & ムー;Lピペットチップ | ラボセレクト | T-001-1000 | |
| 15 mL遠心分離管 | ラボセレクト | CT-002-15A | |
| 200 & ムー;Lピペットチップ | ラボセレクト | T-001-200 | |
| 5 mLマイクロ遠心チューブ | バイオシャープ | BS-50-M | |
| 50 mL遠心分離管 | ラボセレクト | CT-002-50A | |
| アンチピリン | マックリン | A800873 | |
| 抗 SCA-1 マイクロビーズ キット | ミルテニー・バイオテック | 130-123-124 | |
| ブルカー Luxendo MuVi -SPIM システム | |||
| CD31 | R&D | AF3628 | 希釈比 1:100 |
| キュービック-L | 組織透明化液 | ||
| キュービックRA | 屈折率マッチングソリューション | ||
| DMEMの | ATCCの | 30-2002 | |
| ロバ抗ヤギ二次抗体、Alexa Fluor 488 | インビトロゲン | A11055 | 希釈比 1:800 |
| FBSの | コーニング | 35-076-CV | |
| HBLV-mcherry-PURO | ハンビオ | ||
| ホモジナイザーチューブ | ラボセレクト | HGT-003-200 | |
| 画像誘導針注射装置 | ビジュアルソニックス | ||
| インスリンシリンジ | BDの | 328421 | |
| イソフルラン | アメイシン | 緯度-YFW | |
| ライトシート顕微鏡 | ブルカー・ルクセンド | MuVi-SPIMの | |
| マトリゲル | コーニング | 356234 | |
| マイクロスキャンMS400トランスデューサ | ビジュアルソニックス | ||
| マウスハンドリングおよび生理学的モニタリングプラットフォーム | ビジュアルソニックス | ||
| N-ブチルジエタノールアミン | マックリン | N802391 | |
| ニコチンアミド | マックリン | N814605 | |
| PBSの | バイオシャープ | BL302A型 | |
| Puralube点眼軟膏 | EQULの | 1703321138 | |
| トリトンX-100 | シグマ・アルドリッチ | T9284 | |
| トリパンブルー染色液 | ソーラービオ | C0040 | |
| トリプシン-EDTA | ギブコ | 25200-072 | |
| Vevo 2100 lmagingシステム | イスウェルソニックス | ||
| Vevo 統合レールシステム II | イスウェルサニックス |
参考文献
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