実験計画法と自動化ワークフローで実現された遺伝子コード化されたバイオセンサー設計空間の効率的なサンプリング

Summary

このプロトコルは、自動化支援による遺伝子ライブラリの生成と評価を通じて、遺伝的にコードされたバイオセンサーの体系的なグローバル最適化のための方法を提供します。これは、実験を合理化し、特定の設計結果に合わせてバイオセンサーを調整するための遺伝的成分の選択を可能にする実験計画法と組み合わされます。

Abstract

遺伝子コード化されたバイオセンサーは、ハイスループット情報処理のための強力なツールであり、環境または化学入力信号をさまざまな出力に変換できます。これにより、酵素の最適化、菌株開発、微生物プロセス制御など、幅広いバイオテクノロジー応用において、遺伝子発現の動的センシング、直接制御、微調整された制御が可能になります。バイオセンサーの性能を目的に適合させるには、バイオセンサー回路コンポーネント(トランスポーター、入出力モジュールなど)の化学量論を変更したり、関連する宿主とバイオセンサーの分子間相互作用(DNA-タンパク質、タンパク質-タンパク質など)を調整したりすることで、バイオセンサーの性能を改良できます。ただし、ここでは、膨大な数の可能なバイオセンサーの順列により複雑な組み合わせ設計空間が作成され、望ましい表現型性能を提供する構成を特定するためにスクリーニング戦略を慎重に最適化する必要があります。この複雑さは、モノクローナルスクリーニング条件下でのエフェクター滴定分析を必要とする調整可能性などのバイオセンサーの性能特性によってさらに悪化します。したがって、多様な配列と実験空間を探索する必要があるため、フラクショナル サンプリング法はこの目的に特に適しています。このワークフローを支えているのは実験計画法 (DoE) アルゴリズムであり、この組み合わせ実験計画空間の効率的な統計ベースの構造化マッピングと分数サンプリングを可能にするのに適した位置にあります。

報告されているのは、アロステリック転写因子ベースのバイオセンサーの設計空間を効率的にサンプリングし、デジタルとアナログの両方の線量反応曲線を備えた異なる構成を可能にするための、ハイスループットの自動化と計算アプローチを組み合わせたものです。プロトコルは、プロモーターおよびリボソーム結合部位ライブラリーの作成と自動選択から始まります。これらのライブラリとそれに対応する式データは、構造化された無次元入力に変換され、完全な実験計画空間の計算マッピングが可能になります。次に、DoEアルゴリズムを使用してフラクショナルサンプリングを実行し、ハイスループット自動化プラットフォームを使用したエフェクター滴定分析と組み合わせます。このワークフローは、将来のバイオセンサーシステムと遺伝回路の開発と最適化のための不可知論的なフレームワークを提供し、合成生物学コミュニティに規制ツールキットを提供します。

Introduction

遺伝子の発現を調節する能力は、あらゆる形態の生命において不可欠な機能であり、化学的エフェクターから生物物理学的刺激に至るまで、内部と外部の両方の影響に対する動的でリアルタイムの応答を促進します¹。自然界に見られる無数の転写調節システムは、合成生物学によって可能になる代謝工学とバイオテクノロジー研究の増強と加速において大きな可能性を秘めています。原核生物では、細胞内で発生する調節の多くは、アロステリック転写因子(aTF)と多数の低分子エ^{フェクターとの}相互作用によって駆動される一成分調節メカニズムを介して制御されています2。通常、エフェクター結合ドメイン(EBD)とDNA結合ドメイン(DBD)で構成されるaTFは、特定の小分子エフェクターに結合すると分子スイッチとして機能し、ゲノムのプロモーター領域にある特定のDNAオペレーター配列に対するDBDの親和性を調節し、転写の活性化または抑制をもたらします³.この一見単純なメカニズムは、抑制/脱抑制システムから、驚異的な数の低分子エフェクターまたは環境刺激を検出して応答できる活性化剤に至るまで、多くの多様な規制戦略を生み出^{しました4。}その結果、合成生物学は、この多様性を利用して、大量の入力信号を特注の出力、つまり蛍光レポータータンパク質の産生と合成経路の調節に結合できる遺伝的にコードされたバイオセンサーを構築してきました。バイオテクノロジーワークフローに適用すると、このようなシステムは、代謝産物の細胞内濃度のリアルタイムモニタリング、経路の動的調節、およびより効率的な経路、菌株、およびバイオプロセスの開発を支援する簡単な読み出しを可能にします5,6,7,8。

基本的に、バイオセンサーは、特異性、動作範囲、ダイナミックレンジ、感度、傾きなどの多くのパラメーターに従って特徴付けられ、バイオセンサーの線量応答曲線は、リガンド濃度の関数として出力信号を介してこれらのパラメーターを記述します(図1)^{9、10、11、12}.ヒル方程式は、バイオセンサーの性能特性を適合させるために使用でき、上記の各パラメーターについて半経験的証拠を提供し、バイオセンサーシステムを特徴付ける手段を提供すると同時に、アプリケーション主導の結果に向けてシステムを調整するために必要な労力の評価を可能にします。特異性は、他の潜在的なエフェクター分子のアレイと比較して、1つのエフェクターによって誘導されるシグナル出力の相対的な違いとして定義でき、通常、aTFのEBDレベルで変調されます。動作範囲は、バイオセンサーが感知できるリガンド濃度の範囲として定義され、バイオセンサーが応答できる濃度の範囲を決定します。対照的に、ダイナミックレンジは、測定可能な最高の活性化(ON)状態と不活性化(OFF)状態の比率を表し、バイオセンサーがバックグラウンドの自己蛍光¹⁰を超えるエフェクター濃度を確実に報告するための重要なパラメーターです。エフェクター分子の感度は、エフェ^クター13の半分最大濃度(EC₅₀)によって測定される、特定の出力信号を誘発するために必要な濃度として説明される。最後に、曲線の傾きは、プロモーターのオペレーターサイトに対するaTFの協同性(n_H)によって示され、よりデジタルまたはアナログの応答出力プロファイルが得られます。協調性は、オペレーター部位に対する親和性を強化する多量体複合体を形成するリガンド結合aTF間のタンパク質間相互作用から生じ、その結果、飽和リガンド濃度とよりデジタルな応答プロファイルで回路の応答性が急激に増加します¹⁴。

バイオセンサーの線量応答特性は、そのアプリケーションの適合性に大きな影響を与える可能性があり、多くの場合、あらゆる概念的なアプリケーションの「成否」のポイントとなります。バイオセンサーの性能はシステムごとに大きく異なり、動作範囲は通常0.1nM〜10mM¹³ですが、ダイナミックレンジは1.4〜2000倍¹⁵です。さらに、aTFについて報告されているエフェクター化合物の数は多岐にわたりますが(代謝産物、アミノ酸、金属、抗生物質、クオラムセンシングなど)。¹¹、それはすべてを網羅しているわけではなく、エフェクターに適したバイオセンサーが文献にまだ存在しない場合、研究者に課題を提示します。合成生物学は、このような課題に対処するバイオセンサーのエンジニアリングを可能にし、アプリケーションの研究成果により密接に一致するようにエフェクターの範囲と用量反応特性の調整を可能にし、それぞれ前述の両方の問題に対処するために使用されてきました^16,17。エンジニアリングの2つの重要な領域は、合成生物学、バイオセンサーのプロモーター領域、および転写およびタンパク質レベルでの効果を媒介するaTF自体を介して標的にすることができます。プロモーターレベルで性能を調節するためにバイオセンサーの遺伝的要素に焦点を当てたアプローチには、感度、動作範囲、ダイナミックレンジを調整するためのRBS、オペレーター部位、および-35、-10(ヘックスボックス)のエンジニアリングが含まれ、この原稿で概説されている方法論の焦点です(図1)。あるいは、バイオセンサーの選択性と感度を、そのエフェクター結合ドメインの分析およびエフェクター配位に関与する残基の変異(配列相同性および/または構造生物学を使用)によって変更することで、同族エフェ^{クター18、19、20}に対する応答を調節するか、関心のある非同族エフェクター16,17,21に完全に変更することができます.このような調整の取り組みは、バイオセンサーを特定のアプリケーションに向けることができ、これらは通常、代謝コントローラー(フィードバックループ、制御回路)、一次スクリーニングツール(酵素または株の発見)、二次スクリーニングツール(酵素変異体スクリーニング、代謝工学)、およびトランスポーターバイオプロスペクティング22,23,24です.そのような例の1つは、ムコン酸応答性aTF、CatMを、操作されたプロモーター配列と組み合わせて、動的および動作範囲を改善することである。このシステムは、適応実験室進化²⁵に続くGFP蛍光に基づいて最も効果的なムコン酸産生株を単離するために、蛍光活性化細胞選別と統合されました。

上記のエンジニアリング戦略の成功は自明ですが、合成生物学者がバイオセンサーを調整するために利用できる手段の相互依存性により、設計プロセスが複雑になり、バイオセンサーの開発に費やされる期間が長くなる可能性があり、一部の研究者がバイオセンサーを独自のワークフローに実装することを思いとどまらせる可能性があります。図1に示すように、ヘックスボックスを変更することによってバイオセンサーを特定の結果に向けて調整しようとすると、他のパラメーターが誤って減衰する可能性があり、この相互依存性はバイオセンサー工学¹²で認識されている課題です。バイオセンサーチューニングの一般的なアプローチは、合理的設計と指向性進化工学で構成され、前者はシステムの構造的および機構的特徴のアプリオリな理解に依存して、成功の可能性が高いコンポーネントに実験を集中させます。一方、後者は、最適化された特性を示すバリアントを選択するために、ハイスループットスクリーニングと結合したランダム化された突然変異誘発および自然進化に依存しています26,27,28,29,30。効果的ではありますが、どちらの手法にもいくつかの欠点があります:たとえば、特定の構造的または機能的要素に焦点を当てることによるターゲットエンジニアリングは、完全な実験空間の探索が制限される傾向があり、アロステリックまたは二次効果を無視する可能性があります³⁰。ノンターゲットライブラリの生成とスクリーニングは、ガイドなしの方法でデザインを最適化するのに理想的であり、事前のデザイン作業(つまり、ライブラリのデザインと生成)をほとんど必要としませんが、有用な突然変異へのバイアスが必要です。このようなバイアスがなければ、はるかに大きな割合の変異が有害である可能性があり、より多くのスクリーニングが必要になることが予想されます³¹。そのため、バイオセンサーの構成要素(aTF、RBS、オペレーターサイト、ヘックスボックス)の主な効果だけでなく、これらのコンポーネントが互いに相互作用してバイオセンサーパラメータに影響を与える方法も考慮する総合的なアプローチは非常に魅力的です。

構造化された多変量実験と統計モデリングの方法論は、可能な限り最小限の実験数を使用して多次元実験空間を調査するために、プロセスエンジニアリングのワークフローで広く採用されています。実験計画法(DoE)と呼ばれる実験とモデリングを組み合わせたこのアプローチは、研究者が広範なアプリオリな知識を必要としずに、定義された結果に向けて複雑な多変数プロセスを最適化することを可能にします^23,30。通常、構造化された実験探索がより簡単な連続変数の最適化に適用されますが、DoEは遺伝子レベルでの代謝経路の最適化にも使用されています31,32,33。これには、望ましい結果にとって最も重要と考えられる因子を選択する最初のスクリーニングステップと、その後、選択された因子を調整して望ましい出力を得る最適化ステップが含まれ、この場合は、その適用範囲を拡大するために特定のバイオセンサーパラメータを最適化します。重要なことに、この技術を自動化されたリキッドハンドラープラットフォームと組み合わせて、スクリーニングスループットを10³ - 10⁴の中規模ライブラリまで向上させ、データ駆動型ベースでバイオセンサーの性能をグローバルに最適化することができます²³。以下では、バイオセンサー感度のグローバル最適化のためのライブラリの生成、スクリーニング、およびデータ収集を合理化するために、リキッドハンドリングロボット工学を支援する、バイオセンサー最適化へのDoE主導のアプローチを実装するためのプロトコルについて説明します。

Protocol

1. RBS/プロモーター部品の設計

1. DoEプロセスで連続変数として体系的に調整できるバイオセンサー固有の調節要素を特定します。これらの規制要素を個別のモジュールにグループ化します。これには、エフェクター輸送、転写因子発現、および/または出力遺伝子発現を調節するモジュールが含まれます。各モジュールがプロモーターまたはRBS(例えば、それぞれRBS_trans、P_reg、RBS_out、およびP_out)によって転写および/または翻訳レベルで調整可能であることを確認してください。
2. 選択したプロモーターおよびRBS領域内の主要な機能部位(ヘックスボックス、オペレーター部位、RBS配列など)を決定します。
   注:^34、35、36からライブラリを作成するために、多くの特徴付けられたプロモーターとRBSが文献に存在します。ただし、特徴付けされていないプロモーター配列(通常はP_reg プロモーター)については、文献に入手可能な遺伝子配列要素がない場合は、調整可能な遺伝子配列要素を見つけるためのさらなる手順について以下を参照してください。
   1. 目的のセンシング入力を持つaTFのBlastP検索 を介して、 目的のバイオセンサー配列を含む他のオペロンを見つけます。aTFの遺伝子間領域とその調節遺伝子を抽出して、プロモーター配列を取得します。
      注:プロモーター配列の位置と数は、使用するaTFのクラスによって異なります。
3. 複数の配列アライメントツールやその他のモチーフソフトウェアを使用して、ヘキックスボックスやオペレーター部位などの保存されたモチーフの推定プロモーターを検索します。プロモーター配列解析に基づいて、縮退塩基(例:N =任意のもの、R =任意のプリン、Y =任意のピリミジンなど)を使用してランダム化するヌクレオチド配列を選択します。
   注:読者は、プロモーター分析と塩基ランダム化に関する詳細については、ソース出版物に誘導されます²³。

2. 部品ライブラリの組み立てと検証

1. 蛍光マーカー(GFPなど)の上流にプロモーター/RBS配列バリアントを挿入できるように、目的の発現ベクターを特異的に増幅するプライマーを設計および注文します。到着時に凍結乾燥プライマーを滅菌脱イオンH₂Oで最終濃度100 μMに希釈します。
   1. 特定のポリメラーゼのパラメーターに従って、PCRチューブ内の氷上でPCR反応混合物を組み立てます。発現ベクターのバックボーンへの変異のキャリーオーバーを防ぐために、忠実度の高いポリメラーゼが使用されていることを確認してください。プライマーのニーズと目的のPCR産物の長さに応じて、アニーリング温度と延長時間を調整します。
   2. ゲル電気泳動 で PCR産物を分析し、PCR精製またはゲル抽出キットを使用して線形化ベクターを精製します。線形化ベクターDNAの濃度を測定し、-20°Cで保存します。
2. 設計したバリアントライブラリー(RBSまたはプロモーター)を、5'末端と3'末端の両方に30 bpプラスミド相同性アームを持つ一本鎖縮退オリゴヌクレオチドとして線形化ベクターに挿入し、発現ベクターへの標的相同組換えを注文します。
   1. 到着したら、凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを滅菌脱イオンH₂Oで最終濃度100 ng / μlに再懸濁します。
3. オンライン計算機を使用して、線形化ベクトルおよびバリアントライブラリの等モル量の体積を決定します。反応の最終容量が20 μLになり、インサートとベクターのモル比が2:1であることを確認します。
   1. 市販のギブソンアセンブリマスターミックス(X2)のアリコートを氷上で解凍し、選択した計算機によって提供される容量に従ってPCRチューブで反応を組み立てます。
      注:ギブソンマスターミックスは、ラボ^37,38でも作成できます。
   2. 10 μLの2x GibsonマスターミックスをDNAフラグメントに加え、サーモサイクラーなどで50°Cで1時間インキュベートします。
   3. 20 μLのライゲーション産物すべてを、マイクロ遠心チューブ内の200 μLのコンピテント大 腸菌 に適用します。 氷上で30分間インキュベートし、続いて42°Cで45秒間ヒートショックします。
   4. 細胞を氷に2分間戻し、異化物抑制(SOC)培地を含む800 μLの超最適ブロスをチューブに加え、振とうインキュベーターで37°Cで細胞を1時間回復させます。
   5. 50 μLの形質転換細胞を、関連する抗生物質の選択とともに、複数の60 mmルリア-ベルタニ(LB)寒天ペトリプレートに広げます。プレートを37°Cで18時間インキュベートします。
4. 形質転換体のプレートをチェックし、理論上のライブラリ多様性の3倍を表すコロニーの数を計算して、各バリアントの十分な表現をキャプチャします。コロニーの数が少ない場合/ゼロの場合は、等温アセンブリを最適化します。
   注:高忠実度試薬または合成から生成された理想的なライブラリーを検討する場合、オーバーサンプリングが必要です。これは通常、ライブラリの合計サイズの 3 倍です。たとえば、縮退の 4 つの位置 (NNNN) = 4⁴ = 256 個の一意の配列です。したがって、~768コロニーを削ります。
   1. 適切な抗生物質を添加した25 mLのLB培地を含む単一の滅菌125 mLフラスコに、必要な数のコロニーをこすり落とします。フラスコを37°Cで振とうインキュベーター(180 rpm)で18時間インキュベートし、この時間が経過した後、培養物が目に見えて濃くなるようにします。
   2. プラスミドMIDI-PREP精製キットを使用して、調製した形質転換培養物からバリアントライブラリーを精製します。プラスミドライブラリDNAの濃度を決定します。下流のステップには1〜10μgが必要です。ライブラリーDNAが滅菌脱イオンH₂Oを使用して溶出されていることを確認します。
      注:この時点を超えるステップは、 Pseudomonas putida (P. putida)発現宿主におけるバリアントライブラリーのクローニングと検証に焦点を当てます。プロトコルを他の宿主に適応させるには、インキュベーション時間、インキュベーション温度、および形質転換方法の変更が必要になる場合があります。
5. グリセロールストックからストリーキングし、プレートを30°Cで18時間インキュベートすることにより、目的の発現宿主 P.putida のLB寒天プレートを調製します。
   1. LB寒天プレートから P.putida の単一コロニーを摘み取り、10 mLのLB培地を接種し、30°Cで18時間、180 rpmの振とうで増殖させます。
   2. 増殖培養物を18°Cで4000 x g で2分間遠心分離することにより、電気能力のために細胞を準備します。上清を注ぎ、1 mLの滅菌脱イオンH₂Oに再懸濁し、再懸濁した細胞を滅菌微量遠心チューブに移します。
      注: P.プティダ細胞 は、ペレット化するとピンクがかった色に見えるはずです。
   3. 細胞を微量遠心分離機で4 x g で1分間遠心分離し、上清を注ぎ、1 mLの滅菌脱イオンH₂Oに再懸濁します。遠心分離と再懸濁のステップをさらに4回繰り返します。
      注:洗浄中に上清を注ぐと、細胞の損失が発生する可能性があります。これは正常であり、収量には影響しません。
   4. 100 μLの洗浄細胞を0.2 cmのエレクトロポレーションキュベットに移し、1〜10 μgのプラスミドライブラリDNAをキュベットに加え、混合します。
   5. エレクトロポレーターの電源を入れ、0.2 cmキュベットの電圧が2.5 kVに設定されていることを確認し、キュベットをエレクトロポレーションチャンバーに挿入し、パルスします。
   6. 900 μLのSOC培地をキュベットに加え、細胞を混合し、滅菌微量遠心チューブに移します。細胞を振とうインキュベーターで30°Cで2時間回復させます。
6. 形質転換した細胞50 μLを、関連する抗生物質を添加したLB寒天培地の大きな正方形のペトリプレート(230 mm)に広げ、30°Cで18時間インキュベートします。
   注:ライブラリプレート上の適度なコロニー密度(2〜3 CFU / cm²)を確保します。これは、細菌の能力とめっき量に依存します。低すぎる場合は、変換の最適化、または連続した変換ラウンドを使用して、コロニー数を増やすことができます。
7. 配列検証のために、すべての形質転換プレートから25〜50のコロニーを選択します。縮退配列全体で増幅するプライマーを使用し、PCRによって領域を増幅し、サンガーシーケンシングに送って配列の多様性とポリクローナリティを評価します。
   注:ポリクローナリティが問題になる場合は、1 μgのDNAを含むキュベットの複数のバッチに形質転換を広げることで、この影響を減らすことができます。

3. パートライブラリのクローンスクリーニング - 自動化

1. リキッドハンドラーのセットアップ
   1. リキッドハンドラープラットフォーム上に7つのプログラムを作成し、ピペッティングを集中的に行うステップを軽視します。
   2. 「MTPリキッドトランスファー」プログラムを作成し、リキッドハンドラーが、準備されたリザーバーからレイアウト内の空のマイクロタイタープレート(MTP)に調整可能な容量をピペットでピペットで移すように設定されていることを確認します。
   3. 「MTPにグリセロールを追加する」プログラムを作成し、リキッドハンドラーが100 μLの容量の50%グリセロールをプレートにピペットでピペットで取り込むようにプログラムされていることを確認し、分注および吸引速度が5〜20 μL/sであることを確認します。
      注:50%グリセロールの粘度が高いことを考慮して、別のプログラムが作成されており、制御しないと、飛沫による気泡形成、不完全な吸引、または隣接するウェルの相互汚染につながる可能性があります。
   4. 「DWB Liquid Transfer」プログラムを作成し、容量設定を調整可能な深井戸ブロック(DWB)にピペットで移管するようにリキッドハンドラーをセットアップし、リキッドハンドラーがプレフィルドリザーバーからピペットを切れるようにします。
   5. 「解凍されたMTPから接種する」プログラムを作成し、選択したコロニーを含む解凍されたMTPから5 μLを吸引し、これをレイアウト内の対応するDWBプレートに移すようにリキッドハンドラーがプログラムされていることを確認します。
      注: レイアウト内の MTP と DWB の配置に細心の注意を払い、偶発的な二重接種やプレートの見逃しを避けるために、イベントの論理的な順序を確保してください。
   6. 「アッセイDWBへの転送」プログラムを作成し、リキッドハンドラーが5 μLの細胞を1つのDWBプレート位置から別のDWBプレート位置に移すように設定されていることを確認します。次に、プログラムは、この動作を4回繰り返す必要があり、各移送は異なるプレート位置、すなわち、P1->P2、P1->P3などに接種されます。
      注:このプログラムにより、96のバリアントを異なるアッセイ濃度にシームレスに継代培養できます。
   7. 「アッセイセットアップ - PBS再浮遊(DWB)」プログラムを作成し、リキッドハンドラーが500 μLのPBSでレイアウト内の各DWBをピペットでピペットで移動させ、細胞ペレットが適切に再懸濁されるようにするための混合ステップもプログラムに含める必要があります。
   8. 「アッセイセットアップ - 細胞およびPBS添加(MTP)」プログラムを作成し、このプログラムに200 μLの再懸濁細胞を1つのDWBプレート位置から空のMTP位置に移すステップが含まれていることを確認します。
      注: 3.1のすべてのステップで、プログラミングとリキッドハンドラーのレイアウトは異なります。研究者は、特定の市販のリキッドハンドラーのマニュアルを参照して、実験の能力とニーズに合わせて上記のプログラムを変更する必要があります。
2. バリアントライブラリのカルチャリングとバーコード
   1. 理論上のライブラリサイズを決定し、個々のバリアントの数を計算して、95%のライブラリカバレッジ(3倍のライブラリサイズを推奨)を確保する>(ステップ2.5の注を参照)。
   2. スクリーニングするコロニーの数に応じて、抗生物質を添加したLB培地の必要量を計算します(コロニーあたり200 μL + 10%オーバー)。
   3. リキッドハンドラーソフトウェアを開き、MTPリキッドトランスファープログラムの横にある[実行]をクリックします(補足ファイル1を参照)。準備した培地を対応するリザーバー位置に置き、レイアウトに従って空のMTPでデッキを満たします。200 μLの培地を分注するようにプログラムを設定します。[OK]をクリックして、プログラムの開始を確認します。
      注意: 中断を防ぐために、プログラムの開始を確認する前に、リザーバーとチップがリキッドハンドラープラットフォームに適切に供給されていることを常に確認してください。
   4. 必要な回数だけプログラムを繰り返し、充填されたMTPを通気性のある膜で密封して無菌性を維持します。
   5. 充填されたMTPプレートをコロニーピッカープラットフォームに移し、封印を解除し、プラスミドバリアントライブラリDNAで形質転換された P.putida の正方形のプレートもコロニーピッカープラットフォームに移します。コロニーピッカーを使用して、プレフィルドされた各マイクロタイタープレートウェルに、形質転換剤ライブラリプレートからの単一のコロニーを接種します。
      注:コロニーピッカーヘッドの損傷を避けるために、寒天の最小深さが25 mLであることを確認してください。
   6. 再密封して、30°C(800 rpm)の振とうオフラインインキュベーターに移し、培養物の蒸発を避けるために湿度制御が75%になるようにします。これらを16時間成長させます。
      注:インキュベーション後、培養物は目に見えて密に見えますが、そうでない場合は、培地と抗生物質の要件を再確認してください。
   7. 16時間の成長後、成長したプレートをリキッドハンドラープラットフォームに戻し、開封します。MTPにグリセロールを追加するプロトコルの横にある[実行]をクリックし(補足ファイル1を参照)、画面上のプレートレイアウトがリキッドハンドラードックのレイアウトと一致していることを確認します。[OK] をクリックし、プロトコルの実行を許可します。
   8. 終了したら、プレートを再度密封し、オフラインの振とうインキュベーター(800 rpm)で5分間短時間混合してから、バーコードして-80°Cで保存します。
   9. 手順 3.2.7 を繰り返します。と 3.2.8.すべてのMTPにグリセロールが添加され、混合され、バーコード化され、-80°Cで保存されるまで。
      注:この時点でプロトコルを一時停止して、以下の特性評価ステップに備えることができます。さらに、使用中のリキッドハンドラープラットフォームの容量に合わせて、または一度に作業負荷を軽減するために、異なる実験実行へのプレートのブロッキングを計画することができます。
3. バリアントライブラリスクリーニング
   1. 充填するDWBの数に必要な抗生物質を添加した培地の量を計算します(ウェルあたり~495 μL + 10%オーバー)。
   2. DWB Liquid Transferプログラムの横にある[実行]をクリックし(補足ファイル1を参照)、メディアがプログラムレイアウトの正しいリザーバーに追加されていることを確認します。空の DWB が対応するレイアウト位置に追加され、チップが十分に供給されていることを確認します。495 μLの培地を分注するようにプログラムを設定します。準備ができたら、[OK] をクリックしてプログラムを開始します。
   3. 充填されたDWBを通気性のある膜で密封し、4°Cで一時保管に移し、ステップ3.3.2を繰り返します。必要な数のDWBがメディアで満たされるまで。
   4. 解凍されたMTPプログラムからIncoculate(補足ファイル1を参照)の横にあるRunをクリックし、MTPクライオストックと充填されたDWBがレイアウトに従ってリキッドハンドラープラットフォームに転送されていることを確認します。チップが十分に供給されていることを確認してください。[OK] をクリックして、プログラムを初期化します。
      注:細胞の最適な生存率を確保するために前提条件のプログラムとプレートが準備されている場合にのみ、ストックプレートを氷上で30分間解凍します。
   5. プログラムが終了したら、一晩接種したDWBを通気性のある膜で密封し、湿度を75%制御したオフラインプレートシェーカーインキュベーターに移し、30°C(180rpm)で16時間一晩増殖させます。
   6. クライオストックMTPを再密封し、混合し、ステップ3.2.8に従って-80°C冷凍庫に戻します。
   7. 手順 3.3.4 を繰り返します。3.3.6 に。必要な数のオーバーナイトDWBが接種され、インキュベーターに移されるまで、何度も必要です。
      注:接種中の実行間のタイムラグを考慮し、下流のステップに同じ順序を使用するために、プレートの各バッチがインキュベーターに追加されるタイミングを記録し、次のステップに同じ順序を使用することをお勧めします。
   8. スクリーニングする一晩DWBの数に応じて、異なる濃度のエフェクターと抗生物質を添加した培地の必要量を計算します(ウェルあたり495 μL + 10%オーバー)。各エフェクター濃度には、リキッドハンドラーに独自の個別のリザーバーが必要です。
      注:ON/OFFスクリーニングなどの初期特性評価では、2つのエフェクター濃度で十分です(例:0および1000 μMの最終濃度)。より堅牢な特性評価のための用量反応データを生成するために、この範囲は最低4つの濃度(例えば、0、1、25、および1000 μMの最終濃度)に増加します。リプレッサーシステムは、機能を確認するためにエフェクターを追加する必要はありませんが、概説したシステムのようなアクティベーターの場合は、エフェクターが必要です。
   9. DWB Liquid Transferプログラムの横にある[実行]をクリックします(補足ファイル1を参照)。エフェクターを補充した培地を含むリザーバーが、レイアウトに従って正しい位置にあることを確認してください。空のDWBをリキッドハンドラープラットフォームに追加します。プラットフォームで十分なヒントが利用可能であることを確認します。準備ができたら、[OK]をクリックしてプロトコルを開始し、アッセイDWBを生成します。
   10. 充填後、アッセイDWBを通気性のある膜で密封し、4°Cの一時保管場所に移し、リキッドハンドラープラットフォームにさらに空のプレートを補充します。
   11. 必要な数のDWBがいっぱいになるまで、手順3.3.9と3.3.10を必要な回数繰り返します。
   12. Transfer to Assay DWBプログラムの横にあるRunをクリックします(補足ファイル1を参照)。エフェクターを添加した培地を含む非密封アッセイDWBが、リキッドハンドラーレイアウトの正しい位置に追加されていることを確認します。
   13. ステップ3.3.4で接種した増殖 したP.putidaを含む 一晩DWBを移し、開封します。リキッドハンドラープラットフォームに、レイアウトが厳密に遵守されていることを確認します。プラットフォームで十分なヒントが利用可能であることを確認します。準備ができたら、[ OK ] をクリックしてプロトコルを開始します。
       注:アッセイプレートへの継代培養の移送と配列は、通常、リキッドハンドラープラットフォームのサイズに応じてバッチで行う必要があります。
   14. プログラムが終了したら、シールを貼り、アッセイプレートを30°C、湿度75%のオフラインインキュベーターに16時間(180 rpm)移し、この段階での最終アッセイ容量は500μLになります。
   15. 接種後に一晩DWBを廃棄し、必要なすべてのアッセイDWBが接種され、オフラインインキュベーターで増殖するまで、必要に応じてステップ3.3.12から3.3.14を繰り返します。
   16. インキュベーターからDWBを取り出し、遠心分離機に移し、細胞を4000 x g、18°Cで5分間ペレット化します。上清を注ぎ、遠心分離したDWBをリキッドハンドラープラットフォームに置きます。
       注:細胞ペレットの量は、エフェクターの濃度またはバリアントによって異なる場合があり、さらに、一部のペレットは他のペレットよりも目に見えて蛍光的に見える場合があります。
   17. スクリーニングするDWBの数に基づいて、必要な1x PBSの量を計算します(ウェルあたり500 μL + 10%以上)。
   18. アッセイセットアップ - PBS再懸濁液(DWB)プログラムの横にある[実行]をクリックし(補足ファイル1を参照)、分注量を500 μLに設定し、1x PBSが正しいリザーバーに追加されていることを確認してから、リキッドハンドラーのレイアウトに従って遠心分離プレートを配列します。十分なチップが利用可能であることを確認してください。[OK]をクリックしてプログラムを開始します。
       注:細胞の洗浄は、自家蛍光を生じさせる可能性のある残留増殖培地を除去するために行われます。
   19. 再密封し、リキッドハンドラーから再懸濁したプレートを取り外します。プレートの下側をチェックして、ペレットが完全に再懸濁されていることを確認してください。ペレット化されたDWBをリキッドハンドラーに移し続け、手順3.3.18を繰り返します。すべてのプレートが再懸濁されるまで。
   20. Assay Setup - Cells and PBS addition(MTP)プログラムの横にある Run をクリックします(補足ファイル 1 を参照)。ステップ3.3.18から再中断されたDWBを転送します。提案されたレイアウトに従ってリキッドハンドラーに。レイアウトに従って、空のMTPをリキッドハンドラーに移します。分注量が 200 μL に設定され、十分なチップが利用可能であることを確認します。[OK]をクリックしてプログラムを開始します。
   21. 充填されたMTP(最終アッセイ容量200 μL)をオフラインのマルチモードプレートリーダーに移し、プレート内の各ウェルの適切な励起発光波長(sfGFP lEx/lEm = 488/520など)およびOD₆₀₀ で相対蛍光を測定します。
       注:励起発光波長の設定は、発現ベクターにコードされる蛍光遺伝子の選択によって異なります。プレートリーダーのゲイン設定が全体的に一貫していることを確認し、検出器を飽和させることなく低バリアントと高バリアントを区別できるようにします。
   22. 手順 3.3.20 を繰り返します。と 3.3.21.すべてのアッセイDWPがMTPに転送され、測定されるまで。

4. データ処理/変換と差分ランキング

1. 記録されたGFP蛍光(RFU)を、評価されたエフェクター濃度(0および1000 μM)ごとに各バリアントについて記録されたOD₆₀₀ 測定値で割ることにより、収集されたデータの正規化を実行します。
   注:ほとんどのプレートリーダーは、データ収集中にOD₆₀₀ で蛍光を自動的に正規化するようにプログラムできます。
2. ON/OFFを計算して、1000 μM(ON)のRFU/OD₆₀₀ を0 μM(OFF)のRFU/OD₆₀₀ で割ることにより、各バリアントのダイナミックレンジを取得します。ベースバイオセンサーコンストラクトのON/OFFを使用して、すべてのバリアントのON/OFF値を散布図としてプロットし、ベースレベルを超える活性を示すバリアントを決定します。
   注:プロトコルで使用された最初のバイオセンサー構築物のON/OFFは、野生型配列²³の初期特性評価に基づいて3.6倍であると決定された。
3. 詳細な特性評価を行うには、可変傾きを持つヒル関数を使用して用量反応データを当てはめ、分析ソフトウェアを使用してEC50および/またはヒル傾き値を抽出します。
   注:感度とEC₅₀を推定するには、応答が低活性化から高活性化に遷移する範囲(通常は曲線の最も急な部分)にまたがる少なくとも4つのデータポイントを収集します。データポイントが多いほど解像度と精度が向上しますが、感度ランキングを推定するには4ポイントで十分です。
4. バリアントの完全なセットから、バリアントのサブセット (例: N = 100) を選択し、目的のランキング (この場合は EC₅₀) をバランスよくカバーします。これを行うには、EC₅₀ の広い範囲にまたがるバリアントを特定し、ランクの高いバリアントとランクの低いバリアントが比例して代表されるようにします。冗長なバリアント(たとえば、ランキングが似ていて、配信範囲への影響が最小限のバリアント)を削除します。
5. 最終的なバリアントサンプルライブラリ(例:N = 100)を選択した後、次の線形対数(lin-log)変換式(式1)を使用してデータを変換します。
   式1:
   
   どこ
   
   
   
6. EC50 値の場合、最高値 (最も感度の低い値) に +1 を割り当て、最も低い値 (最も感度が高い) 値に -1 を割り当てます。幾何平均0は、中間発現レベルに対応します。

5. 最終的なスクリーニング設計の生成/DoE

1. バイオセンサー設計空間を体系的に探索するには、最終スクリーニング設計(DSD)を使用します。この設計は、特定のシステムのニーズに合わせて研究を調整しながら、設計空間を効率的に探索できるため、好まれます。
2. DOEカテゴリをクリックし、統計ソフトウェアで[最終的なスクリーニング計画]ボタンを選択します(補足ファイル2を参照)。
3. 実験因子(例:RBS_trans、P_reg、RBS_out、P_out)を連続変数として定義し、連続ボタンをクリックして名前を付け、値を+1と-1に設定します(補足ファイル3を参照)。
4. [ 応答の追加 ]ボタンをクリックし、名前をカスタマイズして、目的の応答(例:ON、OFF、ON/OFF、EC50、Slope)を定義します( 補足ファイル4を参照)。
   注: 目標ドロップダウンをクリックし、設計の目的(探索と最適化など)に応じて[ なし ]または [最大化 ]を選択して、応答の目標を設定します。
5. 因子と応答が定義されたら、[ 続行] をクリックして[計画オプション]タブを開きます。 [ブロック不要]を選択し、[ デザインを作成 ]ボタンをクリックします( 補足ファイル5を参照)。
   注: ブロックを追加して、迷惑な要因 (主な関心事ではない要因) から設計を隔離できます。これにより、実験が複雑になる可能性があります。ただし、研究者の裁量で使用します。
6. ソフトウェアは、テストする要因の特定の組み合わせを概説する実験計画表を生成します。対応するlin-log変換ライブラリからの遺伝的部分を使用して、対応する17のコンストラクトを生成します。[ テーブルを作成 ]をクリックして、設計テーブルを保存してエクスポートします( 補足ファイル6を参照)。

6. ステップ2を繰り返します - DoEに情報に基づいた遺伝子デザインの設計と組み立て

1. 最終的スクリーニングデザイン(DSD)計画に従って多変量プラスミドの構築を開始します。
   1. 初期変数(プロモーター、RBSなど)を特定します。プレマーを設計および注文して発現ベクターを線形化し、プライマーが標的可変領域に隣接するようにし、既存の配列要素を確実に除去します。
   2. 各調節ノード(P_out P_reg RBS_out RBS_trans)の事前定義されたライブラリレベル(例:-1、0、+1)に対応するバリアント配列を特異的に増幅するプライマーを設計および注文します。各プライマーに、発現ベクター挿入部位を相補的な30 bpの相同性アームが含まれていることを確認してください。
   3. ミニプレップ を介して 、同定された変数の+1、0、および-1ライブラリレベルに対応する関連するクライオストック培養物からプラスミドDNAを精製します。
2. 線形化発現ベクターおよびライブラリーフラグメントのPCR反応を氷上で設定し、ステップ2.1.1および2.1.2で概説したように生成物の濃度を測定します。
   1. プロトコルのステップ2.3〜2.4を繰り返して、線形化した発現ベクターとライブラリフラグメントのギブソンアセンブリを実行します。この段階では、標準サイズのシャーレが使用されていることを確認してください。
   2. サンガーシーケンシングを使用してコロニーをスクリーニングし、提案された各DSDデザインの正しいコンストラクトアセンブリを確認し、 P.putida の形質転換に進みます(ステップ2.5〜2.6)。
   3. PCRを使用して、形質転換コロニーに正しいプラスミドが存在することを確認します。確認された形質転換体を選択し、抗生物質を添加した10 mLのLBに接種し、30°Cで18時間(180 rpm)一晩増殖させます。クライオストック(25%グリセロールファイナル)を作成し、-80°Cで保存します。

7. スクリーニングとデータの合理化

1. クライオストックから、関連するDSD設計コンストラクトで形質転換した P.putida を、抗生物質を添加したLB寒天培地にストリークし、30°Cで一晩18時間インキュベートしてコロニーを増殖させます。
   1. 提案されたDSDデザインに対応する各プレートから3つの単一コロニーを選択し、抗生物質を添加した10 mLのLB培地で30°Cで18時間培養します。
   2. 翌日、エフェクターの濃度勾配が0 mMから1 mM(最終濃度)の範囲でDWBをロードし、ウェルあたり総容量50 μLにロードします。一晩培養物を新鮮なLBに1/100希釈し、濃度勾配を横切ってDWBに450 μLの培養物を加えます。
   3. 手順 3.3.14 と 3.3.16 を手動で繰り返して成長した DWB を取得し、手順 3.3.18、3.3.20 にスキップして手動で実行します。と 3.3.21.をクリックして、提案された各バリアントの RFU/OD データを取得します。
2. ヒル関数(可変傾き)を使用して線量反応(RFU/OD)データをあてはめ、EC₅₀、ヒル勾配、ダイナミックレンジ、動作範囲などの最適化に適したパラメーター(因子)を抽出します。結果のデータをlog10に変換し、抽出したパラメータをテストされた各設計のDSDテーブルに入力します。
   1. 2レベルのスクリーニング分析を実行して、バイオセンサーの性能に影響を与える重要な要因を特定します。Lenth の t 比と半正規プロット分析^{23, 30} を使用して、どの因子が期待される分布から逸脱しているかを判断し、モデルに保持します。遺伝の影響を維持し、相互作用でのみ重要な要因も個別に含まれるようにします。
   2. 標準最小二乗回帰 (SLSR) モデリング³⁰ を、特定された有意な因子のみを組み込んで、応答変数ごとに個別に実行します。残差プロット、適合不良検定、R²値などの回帰モデル診断を評価して、適切なデータ適合を確認します。
   3. 応答プロファイラーを使用して、目的のバイオセンサー特性に基づいて最適な因子設定を決定します。各応答の目的関数 (たとえば、ダイナミック レンジを最大化し、EC₅₀ を最小化する) を定義して、システムの制約とトレードオフを考慮しながら、すべての応答にわたって最適なバランスを達成する因子設定を生成します。
3. バリアントライブラリに戻り、プロトコルのステップ6.1〜6.2に従って、応答プロファイラーによって提案されたモジュールに従って最適化されたバイオセンサーを構築します。用量反応特性評価 により 、最適化されたコンストラクトの性能を検証します。

Results

最初に、バイオセンサーの機能に影響を与えると考えられるモジュールをバリエーション用に選択する必要があります。これには、リガンドの細胞内濃度、ひいてはバイオセンサー出力に影響を与える可能性のある輸送タンパク質の調節が含まれますが、aTF自体の相対的な転写および翻訳レベル、および蛍光レポーターまたは出力遺伝子も含まれます(図1)。 図2 は、バイオセンサー最適化のためのDoEベースの実験の開発に使用される典型的なワークフローを示しています。調節要素を、特にオペレーターサイト、ヘックスボックス、またはRBSでの配列レベルでの変更を通じて、合成生物学 を介して 操作可能な個別のモジュールに編成することから始まります(図2A)。そのため、DoEワークフローの次のステップは、バリアントのライブラリを生成するための配列部位のランダム化です(図2B)。スクリーニングされたコロニーの数は、ランダム化の程度4^N(Nはランダム化された塩基位置の数に等しい)に比例する必要があるため、ランダム化の程度は慎重に検討する必要があります。各一意のプロモーターまたはRBS配列をDoEの一意のカテゴリ変数として扱うことは、ライブラリの特性評価による連続変数への変換は、ランダム化によって獲得された機能の範囲を測定し、上部、中央、およびを定義するために必要なトリアージステップであるため、必要なコンストラクトの数を実験的に実行不可能なレベルまで増加させます。 そして機能の下限。これは、レポーター遺伝子を介したRBSまたはプロモーターバリアントの強度の尺度としてのライブラリーの出力の分析によって最初に達成されます(図2C)。図のように、連続変数をレベルに離散化して、DoE がさまざまな組み合わせを探索し、これらのバリアントの影響を記述するモデルを開発するために使用できるレベルに離散化します。次に、各因子の活性範囲を組み合わせて記述する3つのレベルを使用してスクリーニングデザインを実装します(図2D)。提案された設計の組み立てとテストを通じて、実験空間が効率的に探索され、要因間の相互作用が明らかになります。得られたデータの統計分析を使用して、どの要因の組み合わせがバイオセンサーの出力に最も大きな影響を与えるかを判断し、SLSRを使用してさまざまな基準の下でのシステムの動作を予測し、ダイナミックレンジや感度の向上などの特定の結果に向けてバイオセンサーの最適化を促進します(図2D)。

図 3 aTF調節プロモーターライブラリーの組み立てとスクリーニングを実証します。縮退オリゴヌクレオチドを使用した等温アセンブリを実行して、プラスミドでコードされたライブラリを作成し、各プラスミドを特定の位置で一意にランダム化しました。ライブラリの多様性の程度によって、最終的にスクリーニングされるコロニーの数が決まり、理論上のライブラリサイズが大きいほど自動化の恩恵が大きくなります。TphRと相同オペロンのプロモーター配列解析は、ランダム化位置、特にある程度の変動を示し、したがって絶対に必須ではなく活性を調節する可能性のある塩基を知らせるために使用された塩基保存のマップを提供しました²³.-35 および -10 の六角ボックスのそれぞれにある 3 つの塩基は、オペレーター部位の 6 つの塩基に加えて、完全な無作為化の対象となりました (図3A)、理論上のプロモーターライブラリは~500,000になります。その後、プラスミドライブラリーを使用して宿主株を形質転換しました。この段階では、に示す一般的なトラブルシューティングアプローチで十分なライブラリカバレッジを得るためには、良好な変換効率が重要です。 図3B.DNA濃度、形質転換方法、クローニング設計を最適化することで、形質転換体の収量を大幅に向上させることができます。 図3C 形質転換体を取得する際の典型的なワークフローを示しており、特性評価作業を開始する前に、固有のバリアントに対応する個々のコロニーを培地中で最初に増殖させる必要があります。理論上のライブラリサイズをカバーするには、膨大な数のバリアントをピックしてプレートに配列する必要があります。リキッドハンドラーやコロニーピッカーなどの自動化システムを活用すると、この労働集約的なステップを簡単にすることができます。ステップ1 図3C は、リキッドハンドラードックに手動でロードされたMTPへの成長培地の移送と、その後コロニーピッカーによる自動接種を示しています。プレートを密封してオフラインインキュベーターに移すなど、一部の段階は手動ですが、必要に応じて自動化することもできます。培養物の成長に続いて、リキッドハンドラーを使用して、グリセロールを添加してクライオストックを生成することもできます。 図3C.この段階では、プレートのバーコード化により、ピッキングされたすべてのバリアントが特定のプレートとウェルの位置にリンクされ、さらなる下流の特性評価のために簡単に参照できるようになります。自動化されたアプローチの大きな利点の1つは、労力の削減とは別に、図書作成の段階でのミスが引き越されにくく、人的ミスが少ないことです。ステップ2 図3C は、ライブラリ調製の自動特性評価フェーズを示しています。これが始まります via リキッドハンドラープラットフォームを使用してDWBに培地を充填し、その後、バーコード付きのクライオストックを使用して接種します。この段階での自動化により、ピペッティングのエラーと労力が最小限に抑えられます。次に、プレートを密封し、手動でオフラインインキュベーターに移して増殖させ、その時点でエフェクター化合物の新鮮なディープウェルプレートへの配列を開始できます。部品ライブラリの初期スクリーニングの目的では、ベースコンストラクトと同等かそれ以上の活性を示す非機能バリアントを事前スクリーニングし、強化された活性を示すバリアントプールを濃縮するために使用できるため、単純なON/OFFスクリーンが望ましい場合があります。これには、大規模なライブラリースクリーニングプロトコルでは法外になる可能性のあるチップとプレートの材料費を削減できるという追加の利点があります。ただし、より複雑なバイオセンサーの性能指標の最適化が必要な場合 (例: EC₅₀)、追加のエフェクター濃度が必要になります。培養物の増殖に続いて、プレートはリキッドハンドラープラットフォームに戻され、リキッドハンドラープラットフォームは、アッセイの期間中、もう一度手動でインキュベーターに戻される前に、エフェクター化合物を含むプレートの接種を開始します。 図3D データ収集前の最後の自動化ステップを示します。成長とバイオセンサーの活性化のための期間が経過した後、プレートはオフラインのインキュベーターから取り出され、リキッドハンドラープラットフォームに戻されます。蛍光データの収集を妨げる可能性のある残留増殖培地を除去するには、遠心分離、上清の除去、および1x PBSによる細胞の洗浄が必要です。リキッドハンドラーを使用すると、培養物の自動再懸濁により、洗浄された細胞をスクリーニングのために96ウェルフォーマットのMTPに移すなど、プレートの迅速な処理が可能になります。データ収集は手動または自動で実行でき、一部のリーダーには、リキッド ハンドラーと接続してデータ収集プロセスをさらに自動化できるプレート スタックが搭載されています。エフェクターの存在下 (ON) とエフェクターの非存在時 (OFF) でのバイオセンサー活性化の比率を比較することにより、バイオセンサーの活性化の程度 (倍数変化) を使用して 5,000 のバリアントを評価し、バイオセンサーの機能を決定しました。ベースコンストラクト(3.6倍)を超える活性を持つバリアントのみが、散布図の赤ピンクの網掛け領域(図3D).濃縮されたバリアントプールのプレートとウェルの位置に基づいて、ワークフローのステップ1で生成された元のバーコード付きクライオストックプレートを参照することで、生物学的複製または異なるエフェクター濃度を使用した堅牢な特性評価を実行できます。

図4は、感度を最適化するためのプロモーターライブラリーの開発を目的とした、最初のライブラリースクリーニングからトリアージされたバリアントのスクリーニングを示しています。前のワークフローでスクリーニングされた5,000のバリアントのデータを使用して、最初のON/OFFスクリーニングから親配列よりも活性が高いと判断された226のバリアントのトリアージプールをさらに特徴付け、感度に従ってランク付けし、DSDを設計できるレベルとして機能しました。最初のステップとして、カテゴリ変数 (この場合は P_out top バリアント) を、広い感度範囲にまたがる連続変数に変換する必要があります。感度をスクリーニングするには、プロットされたヒル関数から EC₅₀ データを取得するために用量反応曲線が必要です。これにより、めっき作業が劇的に増加し、図4Aに示すように、アッセイのセットアップとスクリーニングのプロセスを簡素化するためのリキッドハンドラーを使用した自動化に適しています。図3Cのステップ2で確立したワークフローに従って、増殖培地と抗生物質で満たされたDWBに接種するために、バリアントの濃縮プールに対応するプレートバーコードとウェル位置を用いて接種した。実験の堅牢性を高めるために、バリアントは生物学的3回でスクリーニングされました。プレートをオフラインインキュベーターに移して増殖させた後、リキッドハンドラーを使用して、新鮮なDWBに0、1、25、および1000 μMのエフェクターを添加した増殖培地で充填し、労力を削減しました。アッセイに必要なプレートの数を減らすために、曲線の下部、中央部、上部を網羅する濃度範囲を選択し、図4Aに示すように、中間点の濃度で各バリアントの相対的な感度が明らかになりました。各エフェクター濃度でバリアントプールを接種し、蛍光とOD₆₀₀を分析した後、用量反応曲線をプロットし、非線形回帰分析を使用してEC₅₀を決定しました。この段階では、ライブラリサイズをさらに縮小するために、図4Bに示すように、一意のEC₅₀値を持つ各バリアントの生のライブラリが生成され、上位100の最も堅牢なバリアントが進められました。ただし、このライブラリを DoE で使用する前に、一意のバリアントを、その中に含まれる感度の範囲を表すランク付けされたライブラリに変換する必要があります。これは、データのlin-log変換を実行し、各バリアントが最も感度の高い(-1)から最も感度の低い(+1)にランク付けされるようにデータをランク付けおよび再スケーリングし、データセットの幾何平均を表す中間点値(0)を定義することによって実現されました図4C。生データの変換により、図4Dに示す青いプロットが生成され、そこから+1、0、および-1に対応する離散的なP_アウトシーケンスが、P_アウト因子レベルとして最終的なスクリーニングデザインに進められました。

図5 DSD生成からモデリング、DoE支援学習に基づくバイオセンサーのグローバル最適化までのライブラリ生成後の完全なワークフローを実証します。 図5A 一般的なバイオセンサーを3つのモジュールに分解し、1ノード(トランスポートモジュールとレギュレーターモジュール)または2ノード(出力モジュール)のいずれかを備えています。の例に従ってください。 図4、RBSまたはプロモーターライブラリが開発され、各因子の最大の変動を網羅するために+1、0、および-1の範囲のレベルが選択されます。通常、スクリーニングされたライブラリのサイズによって、設計空間を完全に探索するために必要な実験の数が決まります。たとえば、各ライブラリのサイズが 22 の場合、これは 22 に相当します⁴ (234,256)の組み合わせ。DoE は、構造化されたスクリーニング デザインを通じて組み合わせの数を減らすことで、実験の作業負荷を簡素化することを目指しています。多くの方法論が可能ですが、DSDは、交絡する二次効果を回避しながら、主要な要因と2因子相互作用を特定できるため、バイオセンサーの開発に最適です。また、DSD設計では3レベルを利用するため、曲率(非線形性)を推定することが可能です。 図5A 4つのモジュールのそれぞれが異なるレベルに設定されている典型的なDSD出力を示します。各レベルは特定のプロモーターまたはRBSバリアントに対応するため、等温アセンブリを使用して、DSDの推奨設計に対応する遺伝的構築物を生成します。推奨されるコンストラクトで宿主株を組み立てて形質転換した後、各コンストラクトの性能に対する信頼性を高めるために、全範囲のエフェクター濃度を使用して用量反応曲線が得られます 図5B.DSDはコンストラクトの数を劇的に減らすため、このステップは多くの場合、手作業で、または必要に応じて自動リキッドハンドラーを使用して実行できます。 図5C DSD画面から提案された組み合わせを構築およびテストし、ヒル係数(n_H)とEC₅₀ テストされた各組み合わせの出力。実験の目的は、両方の n に対してグローバルに最適化されたバイオセンサー構造を開発することでした。_H とEC₅₀ 4つの調節リンパ節の発現を調節して、両方のパラメーターを最大化します。各調節因子は、lin-log変換プロモーターおよびRBS部品ライブラリ(-1〜+1)に対応するx軸に沿って発現度とともに、独自の列に表示されます。両方のECでノードの式を変更した場合の影響₅₀ と n_H は、サブプロットの曲線で示されます。プロファイルプロットは、バイオセンサー最適化の直感的でない性質を強調しており、1つの調節ノードの調整が出力パラメーターに反対の影響を与える可能性があります。たとえば、RBS_トランス は、n と強い相関関係がないことが示されています。_H,_{ただし、ECとは正の相関があります50} 非線形に。RBSの場合、高次(非線形)相互作用も暗示されます_アウト 強度が増加すると、勾配が増加します(N_H) と同時に感度が増加します (EC₅₀)、その結果、よりデジタルな勾配を持つ曲線が得られ、エフェクター濃度の増加に対する反応がより鋭くなります。これらのモデルから、バイオセンサーの調整の直感的でない側面をより明確にレンダリングできるため、グローバル最適に向けてレギュレーションノードを最適化できます。モデルを使用して、両方のECのグローバル最適値を予測しました₅₀ と n_H 、プロットの赤い線は、各調節ノードの最適レベル(図5C). 図5D 最高のパフォーマンスを発揮するDSD設計(緑)およびグローバルに最適化された構築物(ライラック)と比較して、最初の親バイオセンサー構成物(青)の用量反応プロファイルを示します。モデルを使用して、ECを最大化するための理想的なモジュール強度を予測します₅₀ と n_H、RBS に対応するバリアント_トランス (-1)、P_登録 (-0.7)、P_アウト (-0.3)、RBS_アウト (+1) の強みを組み立て、最適化された構成で特徴付け、EC の強化を示しました₅₀ と n_H (図5D).DSDとグローバルに最適化されたバイオセンサーの両方が同様のECを表示しますが、₅₀ (0.8 対 0.7 μM)、n_H ECを損なうことなく大幅に改善されました₅₀ すでに達成された利益。この結果は、直感に基づくアプローチに対するデータ駆動型設計の利点を明確に示しており、バイオセンサーのチューニングプロセスを合理化および簡素化する手段としてのDoEの検証に役立ちます。

図1:遺伝的にコードされたバイオセンサーパラメータの調整。 aTF、オペレーターサイト(OS)、ヘックスボックス(-35、-10)、RBSコンポーネントを含む、遺伝的にコードされたバイオセンサーの遺伝子モジュールのレイアウト。色付きのボックスは、リガンド-aTFアフィニティー(灰色)、aTFオペレーター(ピンク)、RNAP-Hexbox(緑)、RBS(オレンジ)など、通常バイオセンサーパラメーターに影響を与える相互作用に対応します。各パラメータが線量反応特性に及ぼす影響は、代表的なグラフ内に示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:典型的なDoEバイオセンサー最適化ワークフローの概要。 (A)ターゲットエフェクターをインポートする輸送タンパク質をコードする輸送モジュール、aTFに関連するレギュレーターモジュール、およびsfGFPなどのレポータータンパク質をコードする出力モジュールを示すバイオセンサーコンポーネントのモジュール化の概要。また、RBS_trans、P_reg、P_out、 RBS out などの調節ノードも示されており_、 これらはバイオセンサー パラメーターを探索するために無作為化の対象となる遺伝的ノードに対応します。(B)プロモーターとRBSを含む、塩基ランダム化に適した配列要素の選択。プロモーターの親配列は一番上の行に示され、最終化された変異体配列は以下に示され、星は変化していない塩基を示しますが、K、M、およびNはそれぞれグアニン/チミン、アデニン/シトシン、または任意のヌクレオチドを指します。プロモーターは、ヘックスボックスまたはオペレーター部位を標的とすることで、より大きなランダム化の可能性を提供し、配列の複製や間隔の変更も含めることができます。RBSライブラリは、より限られたランダム化オプションを提供しますが、最大多様性が小さいため、スクリーニングが大幅に容易です。(C)バリアントの発現レベルを特徴付け、ランク付けされたlin-logライブラリに変換して、カテゴリバリアント因子をDoE による 分析により適した3つの離散レベルに変換します。(D)実験空間のマッピングは、各モジュールの3つのレベルの多重化された組み合わせを使用して実行され、バイオセンサーの性能を望ましい結果に向けて調整するための設計の選択を通知するために使用できるモデルを生成します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:バイオセンサーのモジュール化、プロモーターライブラリの構築、および自動化されたワークフロー。 (A)aTFプロモーター中の特定の配列のランダム化と、等温アセンブリ を介して バイオセンサー構築物への挿入の例。太字は、縮退オリゴヌクレオチド合成中に提供されたキーに従ってオペレーター部位またはヘックスボックスでランダム化された位置を示します。(B)得られたバイオセンサーバリアントライブラリーのクローニング宿主への形質転換を説明するパネル 大 腸菌 、および形質転換体の収量に応じた次のステップ。変換効率が低いと、理論ライブラリのカバレッジが低下し、設計空間の探索が不十分になる可能性があります。この段階でのトラブルシューティングは、一般的なトラブルシューティング対策の概要とともに、バリアントのかなりの部分を特性評価に利用できるようにするために不可欠です。(C)プロトコルに概説されているステップ1および2のワークフローで、赤い針の記号は手動ステップを示し、歯車は自動ステップを示します。ステップ1のワークフローでは、コロニーの選択からクライオストックの生成までのプロトコルの主要なステップを強調しています。ステップ2のワークフローでは、用量反応曲線によるアッセイのためのクライオストックの復活と再配列を示します。(D)蛍光およびODの測定前の細胞の洗浄およびアッセイプレートへの移送を含む、スクリーニング前の最終手順を示すパネル。5000のスクリーニングされたバリアントプールがパネルに示されており、オレンジ色のボックスで強調表示されている親プロモーター配列(3.6倍)を超えるオン/オフを示すバリアント。バリアントの多くは1付近に集まっていることがわかり、おそらく配列レベルでのランダム化が機能の喪失を引き起こすため、パフォーマンスが低く、変動性が低いことを示しています。プロットにボックスで囲まれた226のバリアントは、堅牢な特性評価のために進められました。データは、Alvarez Gonzalez et^{al 23} による元の出版物から引用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:プロモーターライブラリーのトップバリアントスクリーニングとlin-log変換 による 離散化。 (A)RBSまたはプロモーターライブラリーの発現データを生成するための標準手順の概要。適切な範囲の発現レベルを表すトリアージされたバリアントを使用して、リキッドハンドラーを使用して、トリアージされた226バリアントの用量反応曲線を導き出すために、所定濃度のエフェクターがあらかじめ充填されたアッセイプレートを生成します。(B)EC₅₀ の決定と、特徴付けられたライブラリを100のバリアントにさらに削減した後、データは、プロモーターのランダム化から生成されたさまざまな感度の組み合わせを示す棒グラフとしてプロットされます。(C)EC₅₀ データは、lin-log レート方程式を使用して変換され、連続データ セットを DSD の因数分解により適したカテゴリ データ セットに変換されます。(D)変換されたEC₅₀ バリアントデータは、簡略化されたスケールに縮小され、_EC50 活性が高いものから低いものまでランク付けされています。この中から、上部 (+1) の幾何平均 (0) および下部 (-1) のバリアントに対応する 3 つのレベルが選択され、実験空間を探索するために DSD に繰り越されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:DSDの実験計画、テスト、およびモデルベースの学習成果。 (A) RBS_trans、P_reg、P_out、_{および RBSout} モジュールの lin-log 変換ランク付けライブラリに基づく DSD 設計テーブルの生成を示す概略図ワークフロー。DSD設計表は、実験空間を効率的にマッピングするための最小数の組み合わせを提案します。出力例が示されており、+1、0、および-1は、lin-log変換で記述されているように、各規制ノードの上位、中間、および下位のパフォーマンスバリアントを参照します。これらは等温アセンブリ を介して 構築され、特性評価のために発現宿主に形質転換される前にシーケンシングによって確認されます。(B)形質転換後、細胞を成長させ、広範囲のエフェクター濃度に対してアッセイし、蛍光出力を測定して用量反応曲線を生成します。nH や EC50 などのさまざまなパラメーターが用量反応曲線から抽出され、DSD に供給されて各因子の予測モデルが生成されます。(C)モデルを使用して、調節モジュールの発現レベルを変更することにより、1つのバイオセンサーパラメーターを調節することの影響を予測できます。重要なのは、調節ノードのグローバルチューニングが可能になり、各サブプロットの赤い破線で示される1つまたは複数のバイオセンサーパラメーターを同時に最大化できるようになることです。(D)モデルを最大感度に向けて最適化すると、グローバルに最適化されたコンストラクト(ライラック)が得られ、その用量反応曲線は、最もパフォーマンスの高いDSDコンストラクト(緑)と親バイオセンサーコンストラクト(青)に対してプロットされます。抽出された_nH および_EC50 パラメータがプロットの下に示されており、最高のパフォーマンスのDSDコンストラクトよりも両方のパラメータが改善されていることを示し、DSDから生成された予測モデルの有効性を検証しています。データは、Alvarez Gonzalez et^{al 23} による元の出版物から引用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:バイオセンサーライブラリの調製とアッセイのセットアップに使用される自動リキッドハンドリングプロトコルステップ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2から補足図6:決定的スクリーニングデザイン(DSD)の段階的な生成。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

幅広い遺伝的多様性を網羅する遺伝的要素のライブラリは、DoEベースの方法論の成功に不可欠です。 図2Aに示されているように、理論上のバリアントの数は、突然変異誘発の標的となる位置の数と無作為化の程度とともに増加し、このライブラリサイズの増え続けることで、重大なスクリーニングのボトルネックが生じます。ターゲット位置の数やランダム化の程度を減らすことで、スクリーニングが必要なバリアントの数を減らすことができ、チューニングへのより的を絞ったアプローチが必要な場合、またはシステムに関する重要な先 験的 知識がガイドとして存在する場合、魅力的なアプローチです。しかし、バイオセンサーのように、多くの重複する特徴を特徴としたり、十分に特徴付けられた遺伝的要素を持っていなかったりするシステムの場合、ライブラリサイズの要件を回避することは困難です。自動リキッドハンドラーを使用すると、特に用量反応曲線などのより高度な機能をプロットするためにデータポイント収集を増やす必要がある場合、特にON/OFFなどの2つのデータポイントコンパレータと比較して、データポイント収集を増やす必要がある場合に、コロニーのピッキングとバリアントの培養の労力が簡単になります。自動化されたワークフローを含めることで節約される時間を具体的に定量化することは困難ですが、 その実装の主な利点は、他の並列実験に費やすことができる時間にあります³⁸。

それにもかかわらず、ライブラリサイズが10⁴を超える多くの場合、リキッドハンドラー支援の方法論でさえ実用的ではありません³⁹。このような場合、フローサイトメーターを使用したバリアントの予備スクリーニングは非常に魅力的なアプローチであり、最大10⁷細胞/h⁴⁰のはるかに大きな選別能力を備えています。蛍光活性化細胞選別(FACS)を2ラウンドのポジティブセレクションと少なくとも1ラウンドのネガティブセレクションで使用することは、より広範な特性評価の前に、バイオセンサーの最もパフォーマンスの高いバリアントのトリアージに日常的に採用されてきました16,26,42。FACSを利用したこのようなプロトコルの開発と実行は、他の場所で詳細にレビューされています³¹。最初のトリアージスクリーニングは、上記のプロトコルで概説されているように、プレートベースのリキッドハンドラーアッセイを使用して可能です。図3Dに示すように、単一のエフェクター濃度を使用してON/OFFデータを比較することにより、かなりの機能獲得(メソッドで提供されている3.6倍)を持つバリアントバイオセンサーのみを選択して、より詳細な特性評価を行うことができ、ライブラリ開発と実験実行時間を合理化できます。ただし、FACSとリキッドハンドラープラットフォームはどちらもラボに多額の設備投資が必要であり、多くの場合、運用と保守に一定レベルの技術的専門知識が必要です。寒天プレートベースのスクリーニングは、参入に対する技術的および財政的障壁が低く、gfpまたは青白色コロニースクリーニングと組み合わせて使用され、蛍光の強度に基づいてRBSライブラリーバリアントおよび酵素変異体を選択しています^43,44。しかし、これらもまた、効果的にスクリーニングできるバリアントの数が限られていますが、検出可能であるためには蛍光の有意な違いも必要です⁴⁴。一度に複数の要素の完全に組み合わせた同時突然変異の間の妥協点として、「分割統治」方法論は、代わりに大規模なバリアントライブラリをより管理しやすいスクリーニングブロックに分割することを目的としています⁴¹。モジュール化されたアプローチは実用的かもしれませんが、生物学的成分の性能は、特に転写および翻訳結合が普及している細菌において、コンテキストに高度に依存することが知られているため、組み合わせ設計空間を効果的に探索することはできません。これにより、グローバル最適値ではなく局所的な最大値を対象とする設計選択が生じる可能性があります。

特定の誘導体の輸送と認識は、概説されたプロトコルの主な焦点ではないにもかかわらず、言及に値するバイオセンサー開発のもう一つの重要な特徴を表しています。標的分子に適切な aTF がないことは、研究者にとって大きな課題です。標的エフェクターの構造類似体に結合する既存のaTFの合理的選択は、aTFの特異性を目的のエフェ^クター17に調整するためにコドンランダム化を適用するための理想的なテンプレートを提供することができる。ターゲット配列を解決された構造またはアルファフォールド予測にアラインメントすることで、プロトコル¹⁷に適応可能な、半合理的なランダム化およびランク付けにかけられたアミノ酸残基が疑われるエフェクター結合部位の同定を可能にすることができます。同様に、エフェクターの輸出入に関与するトランスポーターの選択と調節は、バイオセンサーの線量反応特性を大幅に変化させる可能性があります。トランスポーター遺伝子の発現は、複数のFACSラウンドで発現を安定させるために使用されるMucKトランスポーターの発現を制御するP_tac プロモーターとRBSの多様なライブラリにより、バイオセンサー応答の堅牢性を高めることで、バイオセンサー応答の重要なプレーヤーであることが判明しました¹⁷。同様に、異なるトランスポータータンパク質自体のスクリーニングは、PCA応答性バイオセンサーを使用したPcaKトランスポーターの推定セットのスクリーニングにより、3,5-ヒドロキシル化基質を独自に取り込むことができる2つのトランスポーターの同定につながり、そのシステムによって検出可能な化合物のセットを拡大します²⁴。

自動化されたプラットフォームは、DoEの原理を深層学習モデルと組み合わせると、特性評価と探索のためのさらに強力なツールになる可能性があります^46,47。ハイスループットプラットフォームを備えたバイオセンサーの設計空間を最初に探索した後、機械学習アルゴリズムを利用して、特徴付けられていない配列の機能を高い精度で予測しました⁴⁷。このプロトコルで概説されている方法は、クロスRBS配列予測に基づいて開発されたモデルと同様に、プロモーター設計のための新しい言語学習モデルのテストに容易に適用できます⁴⁸。さらに、このようなモデルを統合することで、非機能プロモーター設計に含まれる配列機能データを活用し、バイオセンサー全体のより広範な機能に関する重要な洞察を得ることができます。つまり、これは、偽陽性(例えば、機能しないプロモーター)が必ずしも測定された出力ゼロと同等ではないという、DoEワークフローの決定的な制限に対処する可能性があり、偽の転写やDoEデータへのノイズの要素の導入などの現象があり、識別と制御が困難です。決定的に、実験計画空間全体を網羅するためには、活動範囲が不十分であると設計出力が歪み、データセット³⁰から生成された統計モデルに信頼性が低下するため、生成されたライブラリは幅広い活動を示さなければなりません。ライブラリの変動性が低いことが問題になる場合は、他の配列要素を探索したり、ランダム化の程度を高めたりして実装し、適切なバリアントプールが得られるまでライブラリ間の変動を比較できます。

DoE プロセスの重要な側面には、DSD から得られた一次効果と二次効果の正しい推定と選択が含まれ、統計分析に組み込まれます。DoEは、モデリングベースのアプローチであるため、過学習やバイアスが発生しやすく、反復的なエンジニアリング作業を設計空間の最適ではないセクションに誘導することにより、最適化プロセスを急速に複雑にする可能性があります⁴⁹。そのため、構想の段階とデータの分析の両方で、設計がそのような影響から堅牢に隔離されていることを確認することが重要です。最初のスクリーニング設計段階では、すべての因子が幾何平均(すなわち、0,0,0)に設定されている中心実行は、非線形相互作用をより適切に考慮することにより、モデルのバイアスを減らすのに役立ちますが、大きな実験負荷(1〜3回の追加実行)を追加しません⁴⁹。さらに、ランダム化計画を含めると、実験計画には含まれていないが、測定されている応答変数に影響を与える可能性のある無関係な変数を説明するのに役立ちます。生物学的な文脈では、ランダム化はプレート位置などの時空間効果やバッチ間の変動などの問題に対処し、そのような影響がデータの解釈に大きな影響を与えるのを防ぎます。この初期段階でこのような詳細に注意を払うことで、モデルの堅牢性が向上し、より信頼性の高い結論につながります。DSDが提案する実験を行った後、出力パラメータに有意な影響を与えた要因を解明するために、データの統計分析が必要です。半正規プロットは、効果の大きさを直感的に視覚的に表現し、有意な効果は通常直線に沿って落ちますが、大きな影響のある効果はこの線から逸脱するため、バイオセンサーの最適化において最も重要な要因を簡単に選択できます。これを念頭に置いて、モデルの過剰適合のリスクを減らすために、すべてのモデリングと同様に、効果選択に対して保守的なアプローチを取る必要があります。

バイオセンサーやその他の遺伝子回路を迅速に設計および最適化する能力は、菌株や酵素の開発だけでなく、リアルタイム診断などのバイオテクノロジー分野の研究のペースを大幅に加速させるでしょう。この分野でのDoEベースのスクリーニング方法論の出現は特に有望であり、可能な限り最大の設計空間を探求しながら時間とリソースの効率的な使用を促進し、代謝経路およびバイオセンサーの遺伝回路の最適化にすでに大きな効果をもたらしています31,33,34,51.DoEは、多くの1次、2次、さらには3次相互作用が機能している多因子最適化問題に特に適しています。さらに、バイオセンサーのある側面を設計する努力は、ダイナミックレンジ⁵¹を犠牲にして感度を向上させるなど、しばしば不注意で別のパラメータの犠牲をもたらす。このような隠れた相互作用をマッピングし、バイオセンサーの動作を予測するモデルを作成するDoEの機能により、ビルドテストの学習サイクルが大幅に加速されます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 & マイクロ;L CO-REチップ、滅菌ノンフィルター	ハミルトン	235939
2.2 mL 96ディープウェルプレート、V字型底部の角型ウェル	熱	11594754
300 & マイクロ;L CO-RE チップ、スタックNTR、滅菌	ハミルトン	235985
96ウェルクリアボトム、ブラックマイクロタイタープレート	グライナー	655097
アガロース	インビトロゲン	16500100
組み立てられたプラスミドDNA	ユーザー指定	NA
ClarioStar Plus マイクロプレートリーダー	BMGの	NA
デキシヌクロエチド (dNTP) 溶液混合物	NEB	N0447L
ジメチルスルホキシド(DMSO)	フィッシャーバイオリジェント	BP231-100
DNAラダー 100bp	NEB	N3231L
DNAラダー 1KB	NEB	N3232L
DNAシーケンシング	出典:バイオサイエンス	NA
DNA合成	IDTの	NA
大腸菌 DH5&α;コンポテントセル	NEB	C2987H
ゲルローディング染料、パープルX6SDSなし	NEB	B7025S
遺伝子パルサー/マイクロパルサーエレクトロポレーションキュベット、0.2cmギャップ	バイオラッド	1652082
グラフパッドプリズム10	グラフパッド	NA
ハミルトンスターリキッドハンドラー	ハミルトン	NA
HT マルチトロンプレートシェーカーインキュベーター	インフォーサー HT	NA
JMP統計分析スイート	JMPの	NA
LBブロス(ミラー)	ミラー	L3522
寒天入りLBブロス(ミラー);	シグマ	L3147
マイクロパルサーエレクトロポレーター	バイオラッド	1652100
NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックス	NEB	E2621S型
Q5 高忠実度DNAポリメラーゼ	NEB	M0491S
QIAprep スピン ミディプレップキット	キアゲン	12143
QIAprep スピン ミニプレップキット	キアゲン	27104
QIAquickゲル抽出キット	キアゲン	28706X4
QIAquick PCR精製キット	キアゲン	28104
Qpix 420 コロニーピッカー	モレキュラーデバイス英国	NA
SOC成長媒体	NEB	B9020S
SYBR Safe DNAゲル染色	インビトロゲン	S33102
TAEバッファー(トリス-酢酸-EDTA、50X)	サーモフィッシャー	B49
UltraPureTM Dnase/Rnase フリー蒸留水	インビトロゲン	10977015