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方法論記事

I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

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DOI：

10.3791/68469

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2025年10月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、コメットアッセイの適用を通じて、FLT3変異細胞におけるI型およびII型阻害剤によって誘発されるDNA損傷の違いを定量化するための効果的な方法を説明しています。

要約

クラス III 受容体チロシンキナーゼである FMS 様チロシンキナーゼ 3 (FLT3) は、急性骨髄性白血病 (AML) 患者で約 30% の変異頻度を示し、重要な治療標的を構成します。代表的な I 型および II 型 FLT3 阻害剤として、それぞれギルテリチニブとキザルチニブ (AC220) が FLT3 変異 AML 管理に臨床的に使用されています。

ギルテリチニブは、活性化されたFLT3タンパク質と不活性化されたFLT3タンパク質の両方を阻害し、AXL標的をさらに阻害して耐性の克服を助けます。AC220は活性化されたFLT3を阻害します。コメットアッセイは、変異細胞におけるI型FLT3阻害剤とII型FLT3阻害剤によって誘発されたDNA損傷パターンを定量化および比較するために体系的に採用されました。実験結果により、AC220 による DNA 損傷はギルテリチニブによる DNA 損傷よりも有意に高いことが明らかになりました。強力なDNA損傷の場合、FLT3阻害剤をDNA損傷修復阻害剤と組み合わせて、DNA修復欠陥を標的にすることができます。この結果は、DNA損傷標的薬の合理的な併用戦略に実験的裏付けを提供します。

概要

急性骨髄性白血病 (AML) は、未分化骨髄前駆細胞の病理学的増殖によって定義されるクローン性造血幹細胞障害を表し、造血抑制と骨髄不全を引き起こします。AML に固有の分子不均一性は、重大な治療上の課題をもたらします1.特に臨床的に重要なのは、FMS 様チロシンキナーゼ 3 (FLT3) 変異が AML で最も一般的な遺伝子変異の 1 つであり、症例の約 30% で発生し、有害な臨床転帰との強い相関関係を示しています2。FLT3受容体チロシンキナーゼは原形質膜で活性化を受けてPI3K/AKTおよびRAS/MAPKシグナル伝達カスケードを媒介するのに対し、FLT3-ITD変異体は小胞体内に保持され、持続的なシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子5(STAT5)のリン酸化を誘導します。これらの遺伝的変化は、主にシグナル伝達の調節不全、制御されていない増殖シグナル伝達、およびアポトーシス抵抗性を通じて、複数の発癌メカニズムを通じて白血病生成を促進します3。

AC220 とギルテリチニブは、典型的な FLT3 阻害剤として、FLT3 発現を抑制することによって細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導しますが、作用機序は異なります。ギルテリチニブ (I 型阻害剤) は、より広範囲の FLT3 活性化変異をカバーするだけでなく、FLT3 と密接に関連する AXL チロシンキナーゼも阻害します。二重阻害により、ギルテリチニブはがん細胞の増殖をより包括的にブロックできます4。AC220(II型阻害剤)は、活性化キナーゼコンフォメーションへの競合結合を通じて阻害効果を発揮し、特異的に高い特異性でATP結合ポケットを標的とします5。この阻害は、細胞周期の停止とDNA複製ストレスの増加につながる可能性があります。

ギルテリチニブは耐性のリスクが低いため、再発/難治性のFLT3変異AMLの単剤療法に適応されます。AC220 は FLT3-ITD 変異に対して効果的かつ選択的であり、臨床奏効率は良好ですが、FLT3-TKD 変異には効果がなく、二次的な FLT3-TKD 変異 (D835 または F691L など) により FLT3-TKD 変異に耐性がある可能性があります。これらの阻害剤は、実証された臨床効果と改善された治療指標に基づいて、AML 治療薬で注目を集めています6。しかし、これらの薬剤の臨床使用は、獲得性耐性とオフターゲット効果によって課題に直面しています。臨床での AC220 の長期使用は FLT3-TKD 変異による耐性につながりますが、ギルテリチニブの長期使用は、FLT3-TKD 変異による耐性をもたらさなくても、複合変異 (TKD と組み合わせた FLT3-ITD など) に制限がある可能性があります 7,8。

これら 2 つのクラスの FLT3 阻害剤は、FLT3 の阻害と増殖シグナル伝達経路 (RAS-MAPK、PI3K-AKT-mTOR、STAT5 シグナル伝達) の遮断を通じて複製ストレスを間接的に誘導することにより、二重の治療効果を発揮します。細胞増殖の遮断は通常、細胞周期の停止、代謝障害(酸化還元恒常性の調節不全)、そして最終的にはアポトーシスにつながります9,10。このメカニズムは最終的に、耐性細胞集団における代償性DNA修復適応を活性化するDNA病変を生成します。コメットアッセイは、FLT3変異細胞における阻害剤特異的DNA損傷プロファイルの定量的比較を可能にします。この実験的アプローチは、DNA 損傷の脆弱性を悪用し、それによって後天的な治療耐性を克服する合理的な併用療法を開発するための重要な洞察を提供します。

DNA損傷検出のための最新の方法論には、免疫組織化学分析、DNA断片のアガロースゲル電気泳動、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、および次世代シーケンシング(NGS)が含まれており、それぞれが高い分析感度と特異性を示しています11。ただし、これらのアプローチは、多額の経済的要件、長期にわたる処理期間、および厳しい実験条件によって制約されます。これは、分析精度と運用の簡素化のバランスをとる検出戦略を採用することが不可欠であることを強調しています。

彗星アッセイは、その優れた感度、技術的アクセス性、視覚化されたDNA損傷の定量化、および生物学的システム全体にわたる幅広い適用性により、環境毒性学および遺伝毒性評価に広く利用されています12,13。3つの主要な方法論的バリアントが確立されています:一本鎖/二本鎖切断検出のためのアルカリ彗星アッセイ、二本鎖切断分析のための中性彗星アッセイ、および特定のDNA病変同定のための酵素修飾彗星アッセイ。14名

方法論的原則には以下が含まれます:(1)実験的処理を突破するDNA鎖の誘導。(2)細胞膜および核膜の溶解バッファー媒介溶解により、細胞質/核タンパク質およびRNAが電気泳動バッファーに拡散する一方で、高分子量DNAはアガロースマトリックスに固定化されたままになります。(3)アルカリ変性(pH > 13)により、DNAの巻き戻しと損傷したDNA断片の遊離が誘導されます。(4)断片化されたDNAの電気泳動電界駆動の陽極移動は、球状核構造を保持する無傷のDNAで特徴的な彗星形態を作成し、15,16。DNA損傷の定量化は、尾部DNAパーセンテージ(TDP)のコンピューター分析によって達成され、単一細胞分解能17での遺伝毒性の影響の正確な測定を提供します。

この調査では、検証済みの FLT3 変異 32D 細胞におけるギルテリチニブと AC220 の異なる遺伝毒性効果を比較するための体系的な実験フレームワークを採用しました。実験計画は、(i)FLT3変異特異的DNA損傷モデルの確立、および(ii)アルカリ彗星アッセイ法による薬物誘発性DNA損傷の定量的評価の2つの主要なコンポーネントで構成されていました。FLT3変異32D細胞株は、連続希釈されたFLT3阻害剤に曝露する前に、標準的な in vitro 条件下で維持されました。細胞生存率は CCK-8 アッセイを使用して評価され、その後、非線形回帰分析によって半最大阻害濃度 (IC50) 値が計算されました。5倍のIC50 値がDNA損傷誘導閾値として選択されました。薬物処理された細胞を回収し、その後の分析のためにスライド上の低融点アガロースに包埋しました。電気泳動分離をアルカリ性緩衝液中で24 V(~0.74 V/cm)および300 mAで30分間行い、その間に断片化されたDNAは陽極酸化して特徴的な彗星の形態を形成し、無傷のDNAは球状の核様体配置を保持しました。DNA損傷の定量化は、テールモーメントを測定するコンピューター化された画像解析コメットアッセイソフトウェアプロジェクト(CASP)によって達成され、オリーブテールモーメント値の増加はDNA断片化の程度と直接相関しました。

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プロトコル

1. FLT3-ITD変異を有する32D細胞におけるDNA損傷モデルの構築 18

  1. 細胞回収
    1. 鉗子を使用して、凍結保存されたFLT3-ITD変異体32D細胞(-80°Cで保存)を迅速に移します。鉗子を使用してクライオバイアルを取り出し、すぐに温度調節されたウォーターバス(37°C±0.5°C)に正確に60秒間浸漬し、制御された解凍を完了します。
      注:解凍中は、水浴内で凍結バイアルを断続的に振って、均一な加熱を確保してください。
    2. 凍結保存したサンプルを150 × g で25°C±1°Cで5分間遠心分離します。 細胞ペレットを保持しながら、滅菌血清学的ピペットを使用して上清を慎重に吸引します。
    3. 1 mLの完全増殖培地(RPMI 1640 + 10%ウシ胎児血清+ 1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を凍結保存チューブに加えます。10回の連続したピペッティングサイクル(1 mL容量)で穏やかな粉砕を行い、完全な再懸濁を確保します。細胞懸濁液を100 mmの細胞培養皿に移し、7 mLの完全培地を加えて、最終容量8 mLにします。
    4. 培養容器を水平5回、回転5回で穏やかに撹拌します。細胞を37.0°C±0.2°C、5%CO2、95%湿度の加湿インキュベーターに維持します。実験処理の前に24時間インキュベートします。
  2. 細胞生存率評価
    1. 実験のために、対数成長期のFLT3-ITD変異体32D細胞を、細胞状態が良好なものを選択します。
      注:対数成長期の細胞は通常、分裂サイクルが短く、細胞分裂の頻度が高い。
      1. FLT3-ITD変異32D細胞の形態や増殖状態を電子顕微鏡で観察します。細胞増殖閾値の基準が満たされていることを確認します:滑らかなエッジ、均一な分散、凝集体が少なく、細胞サイズが均一で、無傷の原形質膜の完全性、および細胞破片が5%<単一の小球の形をしたche細胞を探します。
    2. セルカウンターを使用して、細胞懸濁液の濃度を測定します。
      注:細胞懸濁液を混合します(最大ピペット速度50%で1 mL滅菌チップを使用して10回連続ピペッティングサイクル)。
    3. 反復希釈を使用して、完全増殖培地中で細胞懸濁液を2.0×105細胞/mLに標準化します。ピペットを使用して、50 μLのアリコートを96ウェル平底プレートの中央ウェル(B2-G7)に分注します。周辺ウェル(A1-H12)に100 μLの滅菌PBSを充填して、湿度を維持し、エッジ蒸発の影響を最小限に抑えます。
    4. FLT3阻害剤含有培地の調製:12ウェル細胞培養プレートで9つのウェルを選択し、FLT3阻害剤濃度ラダー(0、3.90625、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、および1000 nM)に従って標識します。10.0 μMと標識されたウェルに400 μLの完全培地を加え、残りのウェルに200 μLの完全培地を加えます。
      1. ギルテリチニブ希釈:ピペットガンを使用して、1000 nMで標識された各ウェルに4 μLの100 μMギルテリチニブ試薬(ジメチルスルホキシド中のギルテチニブ)を加え、溶液を完全に混合します。200 μL の 1000 nM ギルテリチニブを 500 nM と標識されたウェルにピペットで入れ、混合します。次に、200 μLの500 nMギルテリチニブを250 nMと標識されたウェルにピペットで入れて混合します。毎回、前の希釈液200 μLを次のウェルに取り、混合して所望の濃度にします。
      2. AC220希釈:ピペットガンを使用して、1000 nMを標識した各ウェルに4 μLの100 μM AC220試薬(ジメチルスルホキシド中のAC220)を加えます。他の井戸については、手順1.2.4.1に従います。
        注:残留溶液を避けるために、ピペット内のFLT3阻害剤原液がウェルに完全に移されていることを確認してください。希釈を続行する前に、溶液が十分に混合されていることを確認してください。
    5. インキュベーション:ピペットを使用して、FLT3阻害剤含有培地を指定されたウェル(50 μL /ウェル)に分注します。96ウェルプレートを生理学的培養条件(37.0°C±0.2°C、5%CO2、95%湿度)下で正確に72時間±15分間維持します。
    6. ピペットを使用して、10 μLのCCK-8試薬をすべての実験ウェルおよびブランクコントロールウェルに分注します。プレートを光から保護し、常酸素条件(37°C、5%CO2)で2.0時間±10分間インキュベートします。
      注:気泡の形成を最小限に抑えるために、2 mmのチップ浸漬深さで低速ピペットで試薬を分注します。OD測定値との干渉を防ぐために、サンプル添加中に気泡を避けてください。
    7. インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを使用して450 nmでの吸光度を測定します。結果を記録します。
    8. IC50 計算式に従って阻害率を計算します。
      阻害(%)= figure-protocol-1 ×100%
      薬物実験井戸は、薬物で処理された細胞井戸を示します。細胞対照井戸は、薬物で処理されなかった細胞井戸を示します。ブランクコントロールウェルは、細胞のない培地のみを示します。
    9. 4 パラメータのロジスティック モデルを使用して、非線形回帰によって正規化された用量反応データを分析します。曲線のフィッティングボタンをクリックして、曲線のフィッティングを行います。モデル収束(R2 > 0.98、残差平方和 < 0.15)から半最大阻害濃度(IC50)を導き出し、1000回の反復ブートストラップリサンプリングを通じて95%信頼区間を計算します。
  3. FLT3阻害剤により誘導されたFLT3‐ITD変異を有する32D細胞のDNA損傷実験
    1. DNA損傷評価のために、増殖スパート(集団倍加時間<24時間)を示すFLT3-ITD変異32D細胞を選択します。
    2. セルを数えます(詳細については、手順1.2.2を参照してください)。
    3. 細胞播種:直径6 cmのディッシュとディッシュあたり4 mLの細胞懸濁液を使用して、細胞懸濁液の密度をディッシュあたり1×106個の細胞に調整します。
    4. 阻害剤濃度ごとに3回の繰り返しを調製します:55 nMギルテリチニブ:4 mLの培地+ 2.2 μLの100 μMストック、0.15 nM AC220:4 mLの培地+ 6 μLの100 nMストック。溶液をボルテックス混合し、37°Cで15分間平衡化します。チューブを軽く振って、適切に混合できるようにします。元の培地を吸引し、滅菌血清学的ピペットを使用して、新たに調製した阻害剤含有培地4 mL/ディッシュと交換します。
    5. 処理した細胞を生理学的条件(37°C、5%CO2、95%湿度)で定義された間隔(0、2、4、6時間)インキュベートします。タイムゼロコントロールを即座に処理し、ベースラインのDNA損傷評価を行います。
    6. トリパンブルー排除アッセイ
      1. 収集した細胞を150 × g で1分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を1 mLの培地で再懸濁します。
      2. 100 μLの再懸濁細胞をプラスチック製の遠心分離管にピペットで入れ、100 μLのトリパンブルー染色(2x)を加え、穏やかに混合し、3分間染色します。
      3. セルを数えます(詳細については、手順1.2.2を参照してください)。
      4. 細胞生存率を次のように計算します。
        細胞生存率 = figure-protocol-2 × 100%
        注:生存率≥90%のサンプルのみが彗星アッセイ用に処理されました。

2. 試薬の調製と細胞サンプルの調製

  1. 溶解溶液(2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris、pH 10、1%Triton X-100、10%DMSOを含む)を冷蔵庫を使用して4°C±0.5°Cで30分間平衡化します。
  2. 低融点アガロース(LMA)を95°Cで15分間溶かし、凝固を防ぐために37°Cのウォーターバスに保管します。
  3. アルカリ電気泳動バッファー(300 mM NaOH、1 mM EDTA、pH >13)を電子天秤を使用して12 gのNaOHを計量し、2 mLの500 mM EDTA溶液をピペッティングし、次にddH2Oを添加して最大1 Lのバッファーを作ることにより調製します。
  4. 細胞採取
    1. 細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に集めます。細胞懸濁液を800 × g で5分間遠心分離します。真空ろ過を使用して上清を吸引します。
      1. 広口径の1 mLピペットチップを使用して、細胞を1 mLの完全培地に穏やかに再懸濁し、続いて10回垂直反転させます。
      2. 手順1.2のようにセルを数えます。
      3. 細胞懸濁液を15 mL遠心分離管内で150 × g で5分間遠心分離し、完全な培地を除去します。洗浄した細胞をカルシウムフリーPBSで~5.0×105 細胞/mLに再懸濁します。

3. 彗星アッセイ手順

  1. 事前にコメットアッセイスライドと細胞サンプルを準備します。LMAアガロースと細胞懸濁液(5×105細胞/ mL)の10:1(v/v)混合物をピペットを使用して1.5 mLチューブに調製し、穏やかに混合します。スライド表面から2 mmの距離を保ちながら、45°の角度で保持されたピペットを使用して、アガロース細胞混合物の55 μLアリコートをコメットスライドに分注します。混合物でコーティングしたスライドを4°Cで30分間置き、光を避けます。
    注:LMAと細胞混合物をコメットアッセイスライドに添加する際は、懸濁液をゆっくりと均一に分注して、気泡の形成を防ぎ、均一なゲル分布を確保します。
  2. 固化したスライドを予冷した溶解溶液(2.5 M NaCl、100 mM EDTA、10 mM Tris、pH 10、1%Triton X-100、10%DMSOを含む)に沈め、光保護条件下で4°Cで≥1時間溶解します。
  3. 溶解後、ライセートからスライドを取り外し、ピペットガンを使用してパドルの周りの液体をできるだけ多く吸い上げます。次に、スライドをアルカリ電気泳動バッファー(300 mM NaOH、1 mM EDTA、pH >13)に入れ、光を避けるように注意しながら、4°Cで1時間予備平衡化します。
  4. 電気泳動: スライドを電気泳動チャンバーに配置し、スライドを浸すのに十分なアルカリ性電気泳動溶液を加えます。DNA損傷を最小限に抑えるために、事前に平衡化されたバッファー(4°C)を使用して、定電流(300 mA)で24 V(0.74 V / cmに相当)で30分間電気泳動を行います。
  5. 中和:電気泳動後、ピペットガンを使用してスライドからアルカリ電気泳動溶液を吸引し、スライドをdH2Oに2 x 5分間浸し、次に70%エタノールに5分間浸します。スライドをインキュベーターで37°Cで15分間乾燥させます。
  6. 染色:ウェルあたり100 μLの1x YeaRed核酸染色液のアリコートを塗布し、光保護条件下で周囲温度で30分間インキュベートします。穏やかな水洗いに続いて37°Cで熱乾燥させて余分な汚れを取り除きます。
  7. イメージング:4倍対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して蛍光可視化を実行し、標準化された露光条件下でデジタル画像取得を行います。

4. データ処理

  1. 定量的画像解析を実行して、尾部 DNA (%)、オリーブ尾モーメント、尾部長 (μm) などの標準的な彗星パラメータを決定します。
    1. ソフトウェアのインターフェイスを開きます(図5)。
    2. イメージをソフトウェアにインポートし、[ ファイル]、[ ファイルの選択 ]の順にクリックして、解析するイメージをソフトウェアにインポートします。次に、マウスボタンを押したまま、青いボックスが表示されるまでドラッグします。青いボックスをドラッグして、分析するセルがボックス内に囲まれていることを確認します。図の [調整] オプションを使用して、セル全体を含めるようにフレームの位置を調整できます (図 5)。
    3. 解析を開始する前に、[ 開始]をクリックし、[ 解析]をクリックします。単一セル分析の結果は、右側の「プロファイル」の下に表示されます。各セルを分析したら、[ 保存] をクリックします。検出可能なパラメータは「プロファイル」の右側に表示され、下部には各種パラメータの数値が表示されます。最後に、[ ファイル] |結果をエクスポートします。得られた結果には、HeadArea、TailArea、HeadDNA、TailDNA、HeadDNA%、TailDNA%、HeadRadius、TailLength、CometLength、HeadMeanX、TailMeanX、TailMoment、およびOliveTailMomentが含まれます。

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結果

コメットアッセイは、FLT3変異細胞株におけるギルテリチニブとAC220によって誘導される異なるDNA損傷プロファイルを定量化するために体系的に採用されました。分析により、ギルテリチニブで未処理の細胞集団と AC220 の間の DNA 損傷の差は統計的に有意ではないことが示されました (P > 0.05)。テールDNA(%)およびオリーブモーメントテール(OMT)値の用量依存的な増加は、2〜6時間の曝露後に統計的有意性(P < 0.05)を達成しました。OMTは、尾部のDNAの割合と「頭尾蛍光の重心間の距離」の積を表します。テールDNA(%)とオリーブモーメントテール(OMT)の違いは、AC220がギルテリチニブよりも細胞に多くのDNA損傷を引き起こすことを示しています(図3および図4)。結論として、この実験パラダイムは、コメットアッセイが変異細胞モデルにおけるFLT3阻害剤のDNA損傷の違いを評価するのに役立つことを決定的に確立します。

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ディスカッション

彗星アッセイは、遺伝毒性評価方法論の大幅な進歩を表しています。この技術は、技術的なアクセシビリティ、単一セルの分解能、電気泳動移動プロファイルによる損傷パターンの直接視覚化により、従来のアプローチに比べて明確な利点を提供します。AML治療薬の開発では、コメットアッセイにより、標的検証段階での候補薬剤の遺伝毒性プロファイルの体系的な評価が可能になり、前臨床最適化のための重要な薬力学的データが提供されます19,20。

実験プロセスには、結果の信頼性と再現性を確保するための重要なステップがいくつかあります。まず、実験中は、すべてのスライドの溶解条件と溶解時間を一定に保つ必要があります。細胞を取り扱うときは、紫外線や特定の化学物質によるDNA損傷の可能性を避けるために、実験中に不要な光を避ける必要があります。アガロースゲルがスライドから落ちるのを防ぐために、アガロースゲルはウェルを完全に覆う必要があり、スラ...

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、江蘇省高等教育機関科学技術革新研究チーム(2021年)、江蘇職業大学工学技術研究センタープログラム(2023年)、浙江省医療衛生科学技術プログラム(2025KY1861)、中国江蘇省高等教育機関自然科学重点財団(助成金番号24KJA310008)、蘇州職業衛生学院のプログラム(助成金番号。SZWZYTD202201、szwzy202406)、および東吳大学放射線医学と防護の国家重点研究所のプロジェクト(GZK12023013)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTAビヨタイムST066
1x YeaRed 核酸染色イェン10202ES
32DセルコビオエCBP60995
AC220ターゲットモールT2066
セルカウンティングキット-8道珍島CK04
細胞計数プレートチウジンXB-K-25
CO2インキュベーター熱51032872
コメットアッセイソフトウェアプロジェクト(CASP)
彗星アッセイキット トレヴィゲン4250-050-K
細胞化5バイオテック16280004
FBSのパンST30-3302
ギルテリチニブターゲットモールT4409
GraphPad プリズム 9.0
高速遠心分離機熱 9AQ2861
L-1000XLS+ ピペットレイニン17014382
L-20XLS+ ピペットレイニン17014392
液体窒素タンクムヴェクリオゲYDS-175-216
Multiskan FCマイクロプレート光度計熱1410101
Na2OHダマオ1588
PBSのソーラービオP1020
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100xビヨタイムC0222
RPMI 1640 ミディアムギブコC22400500BT
三眼生細胞顕微鏡モティック1.1001E+12
超低温冷凍庫ヘアV118574

参考文献

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

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