天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル

Summary

このプロトコルは、タンパク質合成における天然産物/小分子阻害剤の特定に最適化されたフルオロメトリックスクリーニング手法を導入します。その実用性から、学部生向けの創薬技術教育や医薬品化学キャンペーンへの応用に適しています。

Abstract

天然産物は、特にがんなど複数の疾患に応用される治療化合物の豊富な供給源です。これらの生体分子を創薬の構造テンプレートとして活用することで、研究者たちは完全合成化合物と比べて開発期間の短縮と生物学的効果の向上を実現しています。タンパク質合成経路は、特に治療困難ながんへの関与から、天然物にとって魅力的な標的として浮上しています。 ストレプトマイセス・グリセウス由来の強力なタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドは、この分野における天然化合物の可能性を示しています。これらの天然物誘導体が薬物様分子に開発される過程で、そのタンパク質合成阻害活性の確認は依然として重要な検証段階です。主な目的は、化合物阻害活性の迅速な評価を可能にする学部生向けのプロトコルを提供することです。このプロトコルは蛍光基質と高度な蛍光顕微鏡技術を用いて、これらの天然産物の抑制能力を体系的に検出・測定します。この研究では、 Pinus sylvestris と Psoralea corylifoliaという2種の植物由来化合物を調べました。シクロヘキシミドを基準阻害剤として用いると、両天然産物はタンパク質合成阻害の度合いに異なりを示しました。

Introduction

タンパク質合成は高度に制御された過程である転写と翻訳を含みます。転写過程で遺伝子のDNA配列がコピーされ、メッセンジャーRNA(mRNA)が生成されます。RNAポリメラーゼという酵素はDNAの二重らせんを分離し、一本の鎖をガイドとして使ってマッチするmRNA分子を作ります。mRNAが完全に形成されると、核から細胞質へ移動し翻訳を行います。翻訳はリボソーム内で行われ、mRNAをテンプレートとして用いてアミノ酸をポリペプチド鎖に組み立てます。このポリペプチド鎖はリボソームの出口トンネルを出ると、機能的なタンパク質に折りたたまれます。転写は主に転写因子、クロマチン修飾、調節RNAによって調節され、翻訳は開始因子、シグナル伝達経路、RNA安定性機構によって調節されます。これらの調節システムにより、細胞は細胞機能を維持し、ストレスや損傷^{に効果的に反応}できます。

ヒトがんの大多数、約85%は固形腫瘍として現れます².これらの腫瘍は具体的な特徴や挙動に大きく異なることがありますが、病因や解剖学^{的姿勢に関係なく}タンパク質合成のアップレギュレーションなど、共通の生理的特徴やパターンを共有する傾向があります。がん細胞は、高いエネルギー要求と制御不能な成長を支えるために翻訳機構を乗っ取り、タンパク質合成の調節を妨げます。この再プログラミングは、ほぼすべての主要ながん性シグナル伝達経路の調節不全の結果であり、細胞の生存、増殖、転移を促進しつつ、細胞死経路を抑制します^。腫瘍細胞ではリボソームを作る機械が過剰に働き、タンパク質産生の増加と細胞分裂の急速化を可能にします。この強化されたタンパク質合成はがん生存に不可欠であるため、このプロセスを標的としブロックする治療法は潜在的な治療法として期待されています⁵。したがって、がん特異的な翻訳因子、独自のリボソーム組成、タンパク質合成を調節するシグナル伝達経路の変化に焦点を当てた研究は、治療効果の改善を伴うより標的的的な阻害剤を生み出す可能性があります。

天然産物(NP)は多様な生物学的活性で知られているため、その足場を用いた選択的タンパク質合成阻害剤の開発は有望^{なアプローチです。}NPはリボソーム結合から開始因子や伸長過程への干渉まで、タンパク質合成機構のさまざまな成分を標的とすることができ、固形腫瘍におけるタンパク質合成阻害剤の医薬品開発において非常に貴重な出発点^{となります。}目的のある活性を迅速にスクリーニングできる能力は、NPヒットを効率的に特定しようとする創薬プラットフォームにとって重要な入り口となります。通常、高スループットの化合物スクリーニングでは蛍光アッセイを用いてリード候補分子を迅速に絞り込み^ます。

世界中の科学者は、生物系の解析に不可欠なツールとして蛍光ベースの技術に依存しています。これらの手法は細胞プロセスの研究に広く用いられており、研究者は生体分子相互作用をリアルタイムで追跡^{できます。}生体直交クリック化学反応と組み合わせることで、これらの手法はタンパク質合成の正確な可視化^{を可能にします。}本例の蛍光タンパク質合成アッセイは、細胞透過性のアルキンを含むプロマイシン類似体である O-プロパルギル・プロマイシン(OPP)を利用した非放射性のタンパク質合成評価技術です。細胞処理後、OPPは伸長するポリペプチド鎖のC末端に組み込まれ、翻訳終止を引き起こします。これらのアルキン標識された切断タンパク質は、5つのFAM-アジドと結合した銅触媒クリック化学を用いて検出されます。

この蛍光測定法は貴重な研究ツールであり、学部生の教育に役立つ化学生物学的手法として利用可能です。最小限のデータ処理でアクセスしやすく効率的なプロトコルを提供することで、学生に現代の創薬技術の実践的な経験を提供し、創薬プロセスを加速させます。新しいタンパク質合成阻害剤の需要が高まる中、このアプローチは学部生に意義ある研究機会を提供するとともに、がん治療の進歩にも貢献します。

Protocol

1. キットからの試薬調製

注意:試薬は十分に混ぜて、スピンダウンし、使用まで氷に保管してください。

1. タンパク質合成阻害キット、PBSバッファー、細胞培養培地、細胞培養処理プレート、15 mL円錐形無菌ポリプロピレン遠心分離機チューブ、2 mL遠心分離機チューブ、p10、p20、p200、p1000ピペットおよび適切なチップを整理・入手してください。
2. 洗浄バッファーを準備します。
   1. 10倍のウォッシュバッファーを37°Cで解凍し、バイアルを手にカップ状に持って溶かします。手の体温を使って解凍し、解凍が完了しているか頻繁に確認しましょう。
   2. 10倍のウォッシュバッファーを1:10の脱イオン水で遠心分離機のチューブで希釈します。逆行かリサスペンションでピペットで上下に混ぜます。使用まで氷で保管してください。
3. 固定液を室温で解凍します。使用まで氷で保管してください。
4. 透過バッファーを準備しろ。
   1. 10倍の透過バッファーを37°Cで手にカップして解凍します。手の体温を使って解凍し、解凍が完了しているか頻繁に確認しましょう。
   2. 10倍のストックを1:10の脱イオン水で遠心分離機のチューブで希釈します。成分を反転またはリサスペンションでピペットで上下に混ぜます。使用まで氷で保管してください。
5. タンパク質400倍の標識、100倍蛍光アジド、100倍シクロヘキシミド、DNA染色、そして20倍還元剤を室温で解凍します。使用中は暗い環境で氷を保管してください。使わないときは、染料をホイルで覆うか、2°Cの冷蔵庫で保管してください。

2. 対照群および実験細胞の標識

注:このプロトコルは安定接着型上皮性乳がんMDA-MB-231細胞を用いて開発されました。どの接着細胞株でも使用できます。以下に挙げるすべての工程は96ウェルプレートを使用し、すべての体積と濃度は2つの試験化合物と2つの対照群で計算され、作業体積は100μLです。

1. 付着する哺乳類細胞の培養
   注意:細胞は健康な指数関数的増殖を維持し、接触阻害や分化を防ぐために80〜90%の合流率に達する前に通過する必要があります。
2. クライオ保存細胞のバイアルを室温まで解凍し、適切な培地で希釈します。
3. 懸濁液を遠心分離して細胞にペレットを送り込み、上清液を吸引します。ペレットを新鮮な培地に再懸浮させ、適切な細胞密度の新しいフラスコに移します。
4. 細胞が80%の濃度に達したら、培地を取り出し、フラスコから古い成長培地を吸引します。その後、トリプシンを阻害する残留血清を除去するために、細胞を無菌PBSで洗浄します。トリプシン-EDTA溶液を細胞層に加え、3〜5分間、または細胞が37°Cで剥離するまで培養します。
5. トリプシンを不活性化するために完全な血清を含む培地を加え、細胞懸濁液をチューブに移し、優しく混ぜて細胞数を数えます。
6. スクリーニングプレート内の種子細胞は、適切な分割比率(例:1:3または1:5)で細胞を希釈し、新しい培地で新しいフラスコに浸し、通常37°C、5%_CO2で培養して所望の細胞濃度を得ます。
   注:ここで述べた実験では、細胞株を1ウェルあたり2 × 10⁴ (96ウェルプレート)でプレートし、37°Cで12時間培養しました。

3. 化合物の添加

1. マスターミックスAを準備します。
   1. 遠心分離機のチューブに「A」とラベルを付けてください。培養培地598.5 μLとタンパク質ラベル1.5 μLをピペットで「A」に注入します。混合物を均一にするためにピペットで上下に再懸浮させてください。
2. マスターミックスBを準備します。
   1. 遠心分離機のチューブに「B」とラベルを付けてください。ピペットで1.5 μLのタンパク質ラベル、6.6 μLのシクロヘキシミド、591.9 μLの培養培地を「B」に抽出します。混合物を均一にするためにピペットで上下に再懸浮させてください。
3. 細胞に対して、望ましい化合物(図1)、陽性および陰性対照を投与します。
   1. インキュベーターから細胞を取り出し、吸引によって培地を除去します。プレートを傾け、セルの攪乱を防ぐために井戸の中央ではなく側面から吸引してください。
   2. ピペットで1μLの試験化合物をウェルに、1μLの試験化合物載体(0.1% v/v DMSO)を井戸に注入します。重複研究の場合は、各サンプルを2つ目の井戸に追加し、このプロセスを繰り返します。これらのウェルにマスターミックスAを99 μL加えます。細胞の動態的破壊を防ぐために、ピペットをウェルの側面に斜めに優しく挿入します。
      注:化合物スクリーニングにおける最大DMSO濃度は細胞タイプやアッセイによって異なりますが、一般的なガイドラインは以下の通りです:0.1〜0.5%のDMSO(ほとんどの細胞ベースのアッセイで一般的に安全で毒性が最小限)、および1%(DMSOは多くの細胞型で短期アッセイで一般的に使用され許容される最大値)です。
   3. マスターミックスB100 μLを2つのウェルにピペットします。ピペットはウェルの側面に斜めに挿入し、細胞の破壊を防ぎます。
   4. プレートを優しく叩き、必要な成分をセルに取り込むようにします。細胞を37°Cで0.5〜2時間培養します。

4. 実験の終了と細胞洗浄

1. 培養培地を吸引で除去します。プレートを傾け、セルの攪乱を防ぐために井戸の中央ではなく側面から吸引してください。
2. 各ウェルに100μLのPBSバッファーを加え、900× g で5分間遠心分離します。
3. PBSバッファーは吸引で除去します。

5. 固定と透過化

1. 各ウェルに100μLの固定液を加えます。細胞は室温の暗い環境で15分間培養します。
2. 吸引によって固定液を除去します。プレートを傾けて、井戸の中央ではなく側面から吸引してください。
3. 細胞を100μLの洗浄バッファーで洗浄し、吸引でバッファーを除去します。このステップを2回繰り返します。
4. 各ウェルに100μLの透過バッファーを加え、室温で10分間培養します。
5. 透過緩衝材は吸引で除去します。プレートを傾けて、井戸の中央ではなく側面から吸引してください。

6. タンパク質反応と染色

1. リアクションカクテルマスターミックスを準備します。
   1. 遠心分離機管にPBSバッファー651μL、100倍銅試薬7.0μL、蛍光アジド7μL、最後に還元剤35μLを加えます。均一化を保つためにこの混合物を再懸濁させます。
      注意:試薬を追加するときは、この正確な順序に従ってください。準備から15分以内に使用してください。
2. 各ウェルに反応カクテル100μLを加えます。細胞を室温の暗い環境で30分間培養し、光漂白を防ぎます。
3. 遠心分離機セルは900× g で5分間使います。遠心分離機のバランスを取るために、空のプレートを追加して重量を均等に分散させます。混合液を吸引で除去します。
4. 細胞を100μLの洗浄バッファーで洗浄し、吸引でバッファーを除去します。このステップを2回繰り返します。

7. DNA染色

1. 総DNA染色の1倍を希釈し、各ウェルに100μLを加えます。細胞を暗い環境で室温で20分間培養し、光漂白を防ぎます。
2. プレートを900 × g で5分間遠心分離機にします。遠心分離機のバランスを取るために、空のプレートを追加して重量を均等に分散させます。混合液を吸引で除去します。
3. 細胞を100μLの洗浄バッファーで洗浄し、吸引でバッファーを除去します。このステップを2回繰り返します。
4. 100μLの冷却PBSバッファーで細胞を再懸浮させ、イメージング準備を行います。

8. イメージング

1. プレートをプレートリーダーに挿入します。
2. 倍率を20倍に設定してください。
3. GFP 469/525 nmチャネルで核染色を分析します。オートビンニングやオートフォーカスを使って画像画の効果を高めましょう。
4. テキサスレッド586/647nmチャネルを用いたアクティブタンパク質合成を解析します。オートビンニングやオートフォーカスを使って画像画の効果を高めましょう。

Results

このアッセイは蛍光を用いて、さまざまな天然物がタンパク質合成を阻害する能力を可視化・定量化しました。シクロヘキシミド(CHX)は、伸長¹¹の際に転座過程を妨害する作用機序を持つ既知のタンパク質合成阻害剤です。この研究では、緑色の蛍光核染料で生細胞を検出しました。OPPはプロマイシンの誘導体で、新生タンパク質に共有結合します^。MDA-MB-231細胞株は、その広範なアクセス性と信頼性の高い実験性能から適切なモデルとなりました¹³。銅が存在する場合、蛍光アジドはOPPとクリック化学反応を起こし、赤色蛍光による活性タンパク質合成を検出します。検査対象の化合物がタンパク質合成を阻害する場合、細胞は緑色に見え、その後赤色で細胞数が減少します(図2A-D)。がん細胞におけるタンパク質合成を阻害することは、細胞増殖を止めたり遅らせたり、アポトーシスや...

Discussion

このプロトコルは、天然生成物や小分子のタンパク質合成阻害能力を評価するためのフルオメトリックスクリーニング手法を提供します。このプロトコルの簡潔さにより、学部生の研究者は正しく実装でき、科学的知識に実質的な貢献を可能にしています。このプロトコルは生物学的手法や技術の基本的な理解を求め、正確かつ信頼性の高い結果を得るために慎重な実行が必要です。

例えば、プロトコルステップ2.1では、再現性を確保するためにすべてのウェルで均一なセル分布と正確な定量化が求められます。不正確な細胞計数は化合物対細胞比を変化させ、線量反応関係を損なったりデータの解釈を混乱させたりします。ステップ3.3.2では、細胞へのせん断応力を防ぐために、斜めに化合物を加えます。同様に、ウェルの端でプレートを傾けて細胞単層を乱さないように吸引液を送ります。細胞剥離は機械的障害が発生したことを示しています。¹⁵。剥離細胞は顕微鏡で非接着型の球状細胞として識別可能で、健康な接着細胞の典型的な扁平な外見とは異なる...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アジレントバイオテックシテーション1細胞イメージングマルチモードリーダー	アジレント	BTCYT1V
化合物1(デヒドロアビエチルアミン、CAS 1446-61-3)	エナミネ	EN300-7409771
化合物2(バクチオール、CAS 10309-37-2)	ケムフェイス	CFN99047
ヘレウス・メガフュージ16R	サーモ・サイエンティフィック	75004271
Ibidi Gmbh-スライド96ウェルプレート	イビディ	80826
MDA-MB-231細胞株	ATCC	ATCC HTB-26
リン酸塩緩衝塩水pH 7.4	ATCC	ATCC 30-2200
タンパク質合成アッセイキット(グリーン)	アブカム	Ab239725