方法論記事

DNA蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析

DOI：

10.3791/68483

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2025年7月8日

 ,  , 
1Chemistry Department, University of Central Florida

この記事について

サマリー

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このプロトコールでは、蛍光灯アプタマーDAP-10-42をシグナルレポーターとして利用するスプリットハイブリダイゼーションプローブの設計と、核酸検出および単一ヌクレオチド置換を持つターゲット間の分化への応用について概説します。

要約

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DNAベースの蛍光発光アプタマー(FLAP)は、瞬時の核酸検出に使用される従来のハイブリダイゼーションプローブとは異なり、核酸シグナルレポーターを蛍光色素やクエンチャーで標識することなく、低コストの蛍光シグナル読み出しを提供できるため、バイオアナリシスアッセイに有望です。代わりに、FLAPは非共有結合的に色素リガンドに結合します。これは、水溶液中で本質的に低い蛍光を示しますが、FLAP結合すると高発光になります。このプロトコルは、これまでに報告された最も効率的なDNA FLAPであるDAP-10-42を利用して、分割ライトアップアプタマーセンサー(SLAS)を設計するアルゴリズムを記述しています。目的の核酸ターゲットに相補的な核酸配列を装備した場合、SLASは核酸解析の有望なツールであり、1つのヌクレオチドまで選択性を持つ核酸ターゲットの配列特異的検出を可能にし、単一ヌクレオチド置換(SNS)の解析を可能にします。SLASは、ラベルフリーの蛍光ベースの信号読み出しの利点を提供し、従来のキュベットベースの蛍光分光光度計、ポータブル蛍光光度計で測定したり、ハンドヘルド光源で励起時に目視観察したりできます。SLASアプローチは、疾患診断、環境モニタリング、生体分子研究におけるバイオセンシングアプリケーションに有益です。

概要

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ハイブリダイゼーションプローブを用いた核酸分析は、特定のDNA/RNA配列を検出および定量するために日常的に行われています1。最も成功したハイブリダイゼーションプローブの1つは、ヘアピン型のDNAであるMolecular Beacon(MB)プローブです
オリゴヌクレオチドは、反対側の末端2,3で蛍光色素とクエンチャーで標識されています。プローブのループフラグメントに相補的な核酸配列の存在を瞬時に(プローブの過剰からプローブ-ターゲット複合体を洗い流すことなく)検出し、定量的PCR(qPCR)で一般的に使用されます。プローブのオリゴヌクレオチド配列に2つの色素(フルオロフォアとクエンチャー)を共有結合させる必要があるため、特に新しい核酸配列を標的とする新しいMBプローブが必要な場合には、コストが増加します。あるいは、MBプローブは、2つの標識されていないオリゴヌクレオチドがターゲットおよびMBプローブレポーター4の両方と相互作用する多成分(スプリット)ハイブリダイゼーションプローブフォーマットのシグナルレポーターとして使用することができる。多成分プローブアプローチは、核酸認識のための選択性を高め、構造化された標的....

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プロトコル

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1. DAP-10-42をシグナルレポーターとしたスプリットライトアップアプタマーセンサー(SLAS)の設計

  1. SLASを構成する2本の未修飾DNAオリゴヌクレオチド鎖の配列を設計します。DAP-10-42のヌクレオチド(nts)4,6-39を含むフラグメントを使用してください(表1、図1A)。
  2. nt 5 の位置で膨らんだチミン残基を除去し、ステムを 4 bp に短縮し (nts 4,6-8 および 36-39)、末端 C-G bp を追加することで、ステム 1 (nts 1-8 および 36-42) の配列をステム 1' に変換します (図 1A、ステップ 1)。さらに、SLASストランドの1つにはDAP-10-42コア配列のnts 9-29が含まれ、別のSLASストランドには配列のnts 30-35が含まれています。
  3. nts 9-29を含むフラグメントの3'末端配列をd(GGTCAT)で拡張し、nts 30-35フラグメントの5'末端配列をd(ATGACC)で拡張して、6-bpステム2を形成します(図1A、ステップ2)。
    注:DAP-10-42のステム1の塩基対T4-A39、A6-T38、C7-G37、およびG8-C....

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結果

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DAP-10-42コアをシグナルレポーターとして用いたSLASの性能は、侵攻性の脳腫瘍である多形性膠芽腫(GBM)の進行に重要なNANOGP8遺伝子の断片を調べるように設計されたプローブを用いて実証された21。この断片は、がん細胞に由来するエクソソームのDNAカーゴにSNSが含まれていることが報告された22。そのため、SLASは遺伝子のSNS部位に合わせて調整されました。このプロトコルでSLAS性能を実証するために、それぞれnt 1423(GenBank NM_001355281.2)のGまたはCのいずれかを含むNANOGP8遺伝子の配列を模倣する合成DNAターゲットMまたはMMを使用しました。ターゲットMはSLAS-S鎖と完全に相補的でしたが、ターゲットMMはSLAS-SとG>Cの不一致を含んでいました(表1)。SLAS-Uのターゲット結合フラグメントの配列は、Mターゲットと<.......

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ディスカッション

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報告されたプロトコルでは、重要なステップには(i)SLAS設計が含まれます。(ii)アッセイ温度;(iii)一価および二価の金属カチオン(K + およびMg2 +)の存在。(iv)SLASストランドの濃度。

SLAS設計
SLAS鎖を設計する際には、ターゲットの不在下、および特異的または非特異的なターゲットの存在下(SNS分化が必要な場合)で、SLAS-S鎖とSLAS-U鎖によって形成される複合体の熱力学的安定性を考慮することが重要です。SLAS-S/U複合体の安定性は、ステム1'とステム2の配列を変更することで調整できます(図1)。ステムのヌクレオチド配列は、標的核酸配列が存在しない状態でSLAS-S鎖とSLAS-U鎖が結合しないように設計し、分析した標的が存在しない状態でバックグラウンドシグナルを低く抑える必要があります。しかし、配列を短くしたり変更したりすることによる.......

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開示事項

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著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

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AKのためのUCF学部研究室(OUR)からの資金は大歓迎です。 NANOGP8 遺伝子のLATE-PCR条件の最適化に関する研究は、Florida Cancer Innovation Fund(助成金MOABC)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オーラミンOMPバイオメディカル 195064シグナルレポートに使用される蛍光色素
ケーリー・エクリプス蛍光光度計アジレントテクノロジーズG9800Aサンプルの蛍光シグナルを測定するため
ジメチルスルホキシドMPバイオメディカル 196055Auramine Oの原液を調製するための溶媒
DNAオリゴヌクレオチド(プライマー、SLAS鎖、PCR用合成テンプレート)IDTの該当なしベンダーによってカスタムメイドおよび脱塩され、それ以上の精製なしで使用されます
dNTPミックス、10 mMサーモフィッシャーサイエンティフィックR0191LATE PCR反応用
塩化マグネシウムインビトロゲンAM9530Gバッファコンポーネント;プローブの鎖と分析対象物との正しい関連付けに必要
マイクロ遠心チューブ(1.5mL)フィッシャーブランド02-681-320サンプル前処理用プラスチック
マイクロピペット(0.1-2.5µL)エッペンドルフK56877Gサンプル前処理に使用
マイクロピペット (100-1000 & micro;L)エッペンドルフK13160Fサンプル前処理に使用
マイクロピペット(20-200µL)エッペンドルフJ05253Mサンプル前処理に使用
マイクロピペット(2-20µL)エッペンドルフG24675Gサンプル前処理に使用
ミニ遠心分離機コーニング 6770サンプル&NBSPをスピンダウンするために使用されます。
ヌクレアーゼフリー水(DEPC処理されていない)サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9932PCRおよびSLASアッセイのサンプルに使用
PCRチューブ(0.5mL)インビトロゲンAM9932Quantus蛍光光度計を使用して蛍光を測定する
ピペットチップ(20-200µL)VWRの76322-150サンプル前処理用プラスチック
ピペットチップ(1-10 uL)VWRの76322-528サンプル前処理用プラスチック
塩化カリウム インビトロゲンAM9640Gバッファコンポーネント;プローブの蛍光ライトアップアプタマードメインを正しく折りたたむために必要
Quantus蛍光光度計プロメガE6150蛍光測定に使用できるポータブル低コスト蛍光光度計
クォーツキュベットスターナ16.50F-Q-10/Z15Cary Eclipse蛍光光度計を使用した蛍光測定に使用します。
標準Taqバッファーを含むTaq DNAポリメラーゼニューイングランドバイオラボM0273SSLASアッセイ で分析する遺伝子断片の増幅用。
Tris-HClバッファー(pH 7.4)ボストンバイオプロダクツR-314バッファコンポーネント
UVランプUVP (紫外線)95-0016-14視覚信号観察のためのAOを励起する
ボルテックスミキサーVWRの10153-838サンプルの混合に使用

参考文献

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  1. Wetmur, J. G. DNA Probes: Applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol. 26 (3-4), 227-259 (1991).
  2. Tyagi, S., Kramer, F. Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization. Nat Biotechnol. 14

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Split Hybridization ProbeDNA Light Up AptamerSequence Specific DetectionNucleic Acid AnalysisLabel Free FluorescenceSingle Nucleotide SubstitutionFluorescent SpectrophotometerPortable FluorometerMelting Temperature AnalysisTarget Binding Duplex

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