方法論記事

生きたラベルフリー乳がん細胞の表現型解析を進めるためのマルチモーダルイメージングフレームワーク

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DOI：

10.3791/68498

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2025年8月22日

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1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

この記事について

サマリー

このプロトコルは、生きたヒト乳がん細胞のラベルフリー、非侵襲的な表現型解析のためのラマン分光法と断層撮影位相顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルアプローチを提示します。これには、迅速で定量的な形態化学分析のためのユーザーフレンドリーでヒューマンバイアスのない分析パイプラインが含まれており、がん研究や細胞生物学への応用で詳細な分子および構造の洞察を提供します。

要約

ヒト乳がん細胞(MDA-MB-231)の迅速な形態化学的表現型解析のためのマルチモーダル共焦点ラマン顕微分光法(RS)および断層撮影位相顕微鏡(TPM)を紹介します。これらの高度な顕微鏡技術の非摂動性を利用して、本来の生理学的環境にあるラベルのない生きた細胞から詳細な形態分子データをキャプチャしました。ハイパースペクトルラマン画像(600 cm-1 から1800 cm-1までのラマンモードにまたがり、広範囲の分子結合と細胞内構造を独自に特徴付ける)および3次元屈折率断層撮影からの形態学的データ(ナノメートル分解能で細胞体積、表面積、フットプリント、および真球度の測定を提供)を分析するために、ヒトバイアスのないデータ処理パイプラインが開発されました。 乾燥質量と密度と並んで)。RSとTPMが提供する豊富な単一細胞の詳細を体系的に分解することにより、腫瘍性乳がん細胞の表現型解析のためのこのようなマルチモーダル顕微鏡法の利点を定量的に実証します。また、当社のツールは、ラベルを使用せずに細胞内情報に関するさらなる洞察を提供します。最後に、RS および TPM から派生したデータセットが特徴とする一意または相関情報について研究し、議論します。当社のツールと定量的データ解析パイプラインは、培養中の生細胞に対する迅速かつ非摂動的な方法が必要な場合に、生物医学研究における表現型解析タスクに革命をもたらし、将来的には臨床および診断アプリケーションへの応用の可能性を秘めていると考えています。

概要

細胞の特性評価と表現型解析は、生物医学研究の極めて重要な側面です1。形態学的レベルと分子レベルの両方で細胞を特徴付けることができることは、細胞の機能、分化、および病理学を理解するために最も重要です1,2,3。腫瘍の診断、病期の決定、および最終的に治療標的の特定のために正確な細胞プロファイリングが必要な腫瘍学の分野で特に興味深いものです2。従来の細胞特性評価法は時間的ダイナミクスを提供できず、通常、染色や標識などの侵襲的な技術に基づいており、細胞の本来の状態に干渉し、データ内に潜在的なバイアスを導入する可能性があります4。したがって、生細胞の自然な摂動のない状態での正確かつ徹底的な表現型解析を提供する非侵襲的戦略がますます求められています。

これに関連して、ラベルフリーのマルチモーダルイメージング法は、相補的なモダリティを組み合わせて形態学的情報と分子情報の両方をキャプチャすることにより、細胞生物学研究に革命をもたらしました2,5。これらのアプローチにより、個々の従来の技術では必ずしも提供できない細胞の統合的かつ非侵襲的な特性評価が可能になります2,5,6。たとえば、蛍光顕微鏡などの顕微鏡技術は形態学的および機能的な細胞イメージングに広く使用されていますが、固有の制限があります。蛍光法は、光退色、光毒性、および標的化可能な分子の量が少ないことが多く、分析の可能性が制限されます4。さらに、これらのアプローチでは外因性標識または色素の使用が必要になることが多く、天然の細胞状態を破壊したり、アーティファクトを引き起こしたりする可能性があります7。

複数のイメージングモダリティの長所を組み合わせたマルチモーダルイメージングプラットフォームは、標識を必要とせずに生細胞からさまざまな種類のデータを取得できるようにすることで、これらの制限を克服します。ラマン分光法 (RS) と位相差顕微鏡や断層撮影位相顕微鏡 (TPM) などの他のイメージング モダリティの統合は、単一の技術の限界を克服するための有望な戦略です。実際、マルチモーダルイメージングは、特に分子および構造特性が正確な特性評価に重要である癌のような複雑な生物学的状態や病状において、細胞表現型のより深い理解を提供します2,5。

ラベルフリーRSは、細胞の化学イメージングに適しています8。分子振動モードを検出することにより、RSは細胞の分子組成に関する詳細な情報を明らかにすることができる生化学的フィンガープリントを提供します9,10,11。生体サンプルから取得されたラマンスペクトルには、脂質、タンパク質、核酸、代謝産物などのさまざまな生体分子に関する情報が含まれており、細胞の分子的性質を理解する上で重要な役割を果たします9,12。RS の主な強みの 1 つは、非侵襲的であり、生理学的状態を変えることなく、自然な状態で生細胞の特徴付けが可能であることです。

多くの利点があるにもかかわらず、RS にはいくつかの制限もあります。実際、RSは詳細な分子情報を提供しますが、細胞の形態や構造に関する定量的な情報は得られません2。ここで、TPM のような補完的なイメージング技術が重要な役割を果たします。

TPMは定量的位相イメージング(QPI)13,14の一種であり、細胞形態に関する高解像度のラベルフリーの定量的情報の視覚化を可能にします15,16。TPM は、造影剤を必要としないという点で従来の顕微鏡技術とは異なります。代わりに、サンプル17の屈折率(RI)の変化に起因する位相シフトを測定することによって動作します。位相シフトは、セルの体積、表面積、形状、内部構造など、セルの構造特性に関する情報を提供します2,18。TPMはナノメートルレベルまでの高い空間分解能を達成できるため、生細胞の高解像度の形態学的詳細を記録するための理想的な技術です。さらに、3D RI断層撮影を再構築する能力により、その生体内環境18における細胞内構造の可視化が可能になり、2D投影と比較してより正確な情報が得られます。ただし、TPM の主な制限の 1 つは、主に細胞の形態と相分布に関する情報を提供し、異なる化学成分を区別したり生化学的特徴を特定したりすることができないため、化学的特異性が欠如していることです。

マルチモーダル技術における RS と TPM の組み合わせは、細胞表現型解析に利点をもたらします。RS は豊富な分子情報を可能にしますが、TPM は構造的側面を追加し、細胞形態をかなり詳細に分析できるようにします。最近、RS と TPM の組み合わせは、がん研究 2,19,20 に焦点を当てたいくつかの研究で実証されています。たとえば、以前の研究では、ラマン分光法をホログラフィック位相顕微鏡データと同時登録すると、補完的な分子および形態学的情報が得られ、さまざまな細胞型と腫瘍発生段階を区別できることが報告されています2。これらの研究は、特に細胞の分子的および構造的特徴が細胞の悪性腫瘍および挙動と密接に関連している癌の文脈において、細胞表現型解析の精度を高めるマルチモーダルイメージングの力を強調しています2,20。

マルチモーダルイメージングの最近の進歩にもかかわらず、特にデータ処理と分析において、対処すべき課題がまだあります21。マルチモーダルイメージング技術によって生成される大量のデータは分析が面倒な場合があり、意味のある情報を抽出するには簡単な手順を採用する必要があります。この課題に対処するには、データの複雑さを処理し、分析における人間のバイアスを最小限に抑えるために、ユーザーフレンドリーなデータ処理パイプラインを確立する必要があります。このようなパイプラインは、結果の精度と再現性を達成し、これらのアプローチを臨床および診断アプリケーションに変換するために重要です。

本研究の目的は、生きた単一がん細胞のラベルフリー、高速、非摂動表現型解析のために、RS と TPM を融合する可能性を説明することです。これら 2 つの堅牢なイメージング アプローチを統合することにより、ヒト乳がん細胞 (MDA-MB-231) の分子的および形態学的特性の包括的かつ定量的な特性評価を提供します。この研究では、マルチモーダル データセットから抽出された情報が正確で信頼できるものであることを保証するために、人間に偏見のないデータ処理パイプラインを確立することの重要性も強調されています。ここでは、他の種類の細胞に一般化できるがん細胞表現型解析のための堅牢なプラットフォームの確立を目指しています。このアプローチの多用途性と感度により、基礎的な細胞生物学研究から診断に至るまで、幅広い生物医学応用の潜在的な候補となっています。

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プロトコル

1. サンプル調製

  1. MDA-MB-231細胞を石英ペトリ皿に播種します。
    1. MDA-MB-231ヒト乳がん細胞を3.5 cmの石英ガラス底ペトリ皿にプレートします。
    2. 細胞を5%CO2 環境で37°Cで、表面に完全に付着するまでインキュベートします(播種後少なくとも12時間)。
  2. 細胞を洗浄し、測定の準備をします。
    1. 細胞がペトリ皿に付着したら、細胞から培地を取り除きます。
    2. 細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかに洗浄し、残留培地を除去します。
    3. 新鮮な細胞培養培地を追加し、測定手順全体を通して細胞を培地で覆い、細胞の生存率を確保します。
      注:培地として、この研究では、5%ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン(100 IU / mL)-ストレプトマイシン(100 μg / mL)を添加したフェノールレッドフリーDMEM / F-12を使用しました。

2. ハイスループットラマン顕微鏡システム

注:MDA-MB-231細胞の生細胞イメージングに関する現在の研究に使用されている自作のラマン顕微鏡の技術的詳細は、以前に22で説明しました。簡単に言えば、利用されたカスタムビルドのハイスループットラマン顕微鏡システムは、532nmレーザーによって励起された785nmのTi-Sapphireレーザーを備えています(図1A)。785 nmのラマン励起レーザーは、倒立蛍光顕微鏡本体IX83に結合され、励起は749 nmダイクロイックミラーを使用したUPLSAPO60×1.2 NAの水浸対物レンズを介してサンプルに向けられます。偏光子は、顕微鏡の背面ポートで平均レーザー出力を調整します。明るい視野イメージングは、同様の方法で白色光を結合することによって可能になります。ダイクロイックフィルターを自動的に変更することで、ラマンモードと明視野モードを切り替えます。このシステムは、ガルボミラーベースとステージスキャンを組み合わせて、ハイスループットイメージングを実現します。カスタム MATLAB スクリプトは、オープンソースの顕微鏡制御ソフトウェア、データ収集 (DAQ) ボード、および信号検出システムと対話して、データ収集プロセスを自動化します。後方散乱ラマン光は同じ対物レンズによって収集され、可視光は785 nmのダイクロイックミラーによってフィルタリングされ、NIR分光器と電荷結合素子(CCD)検出器に向けられます。このセットアップにより、多次元イメージングが可能になり、さまざまな位置およびZスタック2,22にわたって明視野、蛍光、およびラマン信号をキャプチャします。

  1. ラマンイメージング手順
    1. サンプルの調製と生理学的条件の保存
      1. サンプルをオンステージインキュベーターに設置して、生理学的状態を維持します。インキュベーターが37°Cに設定され、温度制御のためのリアルタイムフィードバック調整が行われていることを確認します。
      2. 蒸留水で満たされた内部の周辺バスユニットを使用して、チャンバー内の湿度レベルを>95%に維持します。CO2 ガスコントローラーをセットアップして、5%のCO2 と95%の空気を混合し、インキュベーターチャンバーに供給します。
    2. 自動水浸管理
      1. 自家製の自動水浸フィーダーのスイッチを入れ、対物レンズの先端に接着されたシリンジポンプとシリンジニードルを使用して、2 μL/minの流量で対物レンズに水を供給します。
      2. 蒸発を避けるために水位を定期的にチェックし、測定全体を通じて一貫した画像状態を確保してください。
    3. ラマン分光法によるデータ取得
      1. 励起レーザーの電源を入れ、その出力を調整して、サンプル面で75 mWのレーザー出力を実現します。
      2. Micro-managerオープンソースの顕微鏡制御ソフトウェアを開きます。[設定]設定で、[BF]を選択し、ソフトウェアウィンドウの左側にある[ライブ]をクリックして、明視野画像を視覚化します。ラマンスペクトルを取得する目的の単一セルを選択します。次に、[停止] をクリックして明視野ビジュアライゼーションを終了します。
      3. CCDカメラの信号数を最大化して、ラマン撮像面のZ座標を設定します。
      4. これを行うには、CCDカメラ制御ソフトウェア(LightField)を開きます。実験設定で、露光時間を1.5秒に設定します。次に、[実験] ツールバーの [実行] をクリックし、レーザー ビームをオンにします。
      5. 次に、Z位置を調整して、フィンガープリント領域のシグナルカウントを600 cm-1から1800 cm-1まで最大化し、生物学的シグネチャに関連するラマンピークの視覚化を最適化します。次に、レーザーをオフにし、CCDカメラソフトウェアの実験バーで[停止]をクリックして、ソフトウェアを終了します。
        注:CCDカメラの最大ラマン信号数は、焦点が石英のかなり内側にあるため、細胞関連のラマンピークの痕跡を示さないイメージ面に対して+8μmと一致するZ軸に沿った位置に対応していることが観察されました。この値は、セルの種類とステータスによって異なる場合があります。
    4. MATLAB スクリプトを使用してデータ収集プロセスを開始すると、多次元測定でラマン チャネルが自動的に処理され、ハイパースペクトル ラマン データが保存されます。
    5. 視野を50×50μm2、40×40ピクセルに設定し、各ピクセル領域を1.25×1.25μm2に対応させます。各ラマンスペクトルの露光時間を1.5秒に設定します。
      注:アセトアミドフェノールサンプルを使用して定期的に波数校正を実行し、既知のラマンピークに注釈を付けます。2 次補間によってラマン シフト軸をキャリブレーションします。
      注意: レーザーの取り扱いには注意してください。セットアップおよび操作中は、レーザー波長に適合した適切な保護メガネを常に使用してください。

3. RSデータ解析

  1. RamApp Webベースのツール(https://ramapp.io/)によるラマンハイパースペクトルマップの後処理:
    1. Web ベースのツールにログインします。
    2. ハイパースペクトルデータをインポートします。[ マイ分析 ]タブで、[ 新規] をクリックし、空間およびスペクトルデータ変数とx軸変数(つまり、ラマンシフト値)を含む.matファイルをアップロードします。
    3. ラマンシフトで指定された領域にスペクトルを切り捨てるには、[ クロップと回転 ]ドロップダウンメニューで、[ スペクトルクロップ ]をクリックし、ラマンシフト領域の下境界と上境界をそれぞれ600 cm-1 と1800 cm-1に定義します。
      注:このスペクトル切り捨てを実行することにより、ペトリ皿の石英材料に関連する広くて振幅の高いピークが分析から除外されます。
    4. 宇宙線のラマンスペクトルを補正するには、[ノイズ除去]オプション内で[デスパイク]をクリックし、[方法]として[Zスコア]を選択し、[しきい値]を8に設定します。
      注: Despike 前処理機能は、宇宙線によって生じる信号にスパイクを含むピクセルの問題に対処するのに役立ちます。
    5. [ 最初の差分を使用して 、スペクトルに沿った強度の最初の離散差分を使用して外れ値を見つけるには] オプションをオンにし、[ スパイクの補正] オプションをオンにします。各不良ピクセルのスペクトルは、隣接するピクセルの中央スペクトルに置き換えられます。
    6. [ 実行] をクリックしてスパイクを修正します。
    7. 各波数に対応するマップからノイズを除去するには、[ ノイズ除去 ]オプション内で[ マップをスムーズにする]をクリックし、[ メディアンフィルター]を選択して、マップの各ピクセルにフィルターを適用するときに考慮される正方形の辺のサイズを3ピクセルに設定します。次に、[ 実行] をクリックします。
    8. フィルターを適用して各ピクセルのスペクトルを滑らかにするには、ノイズ除去選択内のスペクトルを滑らかにします。[方法] として [Savitzky-Golay フィルター] を選択し、フィルター ウィンドウの長さを 7 に、フィルターの多項式次数を 2 に設定します。次に、[実行] をクリックします。
      注:Savitzky-Golayフィルターでは、フィルターウィンドウの長さ(正の奇数整数)と多項式の次数を指定する必要があります。
    9. フォアグラウンドから平均バックグラウンド信号を削除するには、[ 光学基板の除去] パネルを開き、[ 基板の識別]をクリックします。 k-means を メソッド として設定し、クラスターの数を2に等しくします。
      注:この関数は、クラスタリングアプローチを使用して細胞(「前景」)とその基質をセグメント化します。その後、フォアグラウンドから平均バックグラウンド信号を削除したり、一部のステップをフォアグラウンドピクセルでのみ機能するように制限したりできます。選択するクラスターの数は、特定の標本によって異なる場合があります。
    10. 詳細オプションで、形態学的クリーニングをオンにして、前景からいくつかの小さなブロブ(スプリアスセルパーツなど)を削除します。次に、[実行] をクリックします。
    11. [ 光学基板の除去 ]パネルで、平均バックグラウンド信号を差し引くには、[ 基板の除去]をクリックし、[ グローバル平均(値の中央の95%の平均)] を選択して [実行]をクリックします。
      注:K-meansは通常、非決定論的ではありますが、より高速です(ただし、ランダムシードは固定されているため、他のすべてが等しい場合、各実行で同じ結果が得られます)。前景の特定の部分が背景として認識されている場合は、クラスターの数を 2 を超えて増やすことができます。平均信号が最も低いクラスターがバックグラウンドとして定義されます。
    12. ベースライン蛍光を補正するには、 ベースライン パネルを開き、 ベースラインの補正をクリックします。 asPLS(Adaptive Smoothness PLS) を選択し、λを5000000に設定します。次に、[ 実行] をクリックします。
      注: 選択できる方法は 7 つあり、そのうち 5 つはペナルティ付き最小二乗法 (PLS) に基づいています。これらのPLS法では、平滑化パラメータ(λ)が必要です。λ の値を大きくすると、ベースラインが滑らかになります。
    13. 各ラマンハイパースペクトルマップをフロベニウスノルムで割って正規化するには、[その他]をクリックし、[正規化]オプションを選択します。次に、「メソッド」として「Frobenius」を選択し、「実行」をクリックします。
      注:フロベニウスノルムは、データ行列全体を正規化するために利用されます。
    14. 細胞内成分の空間分布を示す偽色画像を取得するには、右側の 画像 パネルの強度 画像で、 メニューを開く 記号をクリックします。次に、 画像を編集 編集パネルを開くオプション。
    15. 編集パネルで、単一バンドを選択し、スペクトル範囲を定義します(例:細胞質の場合は715-725 cm-1)。カラーマップで「ダブルカラー」を選択し、カラー、強度しきい値、不透明度を定義して、「確認」をクリックします。
    16. シングルポイントスペクトルをダウンロードするには、画像上の目的のピクセルをクリックして選択します。次に、[ スペクトルの凡例] パネルの [カーソル] セクションで、[ スペクトルのダウンロード] をクリックします。異なる細胞内成分に対して同じ手順を繰り返します。
    17. 前景と基板のラマンスペクトルをエクスポートするには、スペクトルの凡例パネルの基板識別セクションで、前景セクションと基板セクションの両方のスペクトルをダウンロードをクリックします。
      注:前述のRSデータ解析のプロトコルでは、主要な細胞内成分の空間分布、前景と基板の両方からのラマン強度スペクトル、および細胞内構造の単一点スペクトルを示す偽色画像を生成するために、前処理ステップと単変量解析が説明されました。下流分析は特定の生物学的問題に合わせて調整されることがよくありますが、この研究では、使用されているWebベースのツールの マップ分析 セクションを介してアクセスできる代表的な多変量および分類方法に焦点を当てています。これらには 、クラスター分析、主成分分析 (PCA)、多変量曲線分解能 (MCR)、N-FINDR、 および スペクトル フィッティングが含まれます。スペクトルフィッティングにより、ピアソン相関係数やスペクトル角マッパーなどの距離ベースのアプローチを使用して、スペクトル特徴の定量化と比較が可能になります。クラスター分析は、k-means、Mini-batch k-means、階層集積クラスタリングなどのアルゴリズムを使用して実行でき、スペクトル類似性に基づくハイパースペクトルデータのセグメンテーションを容易にします。PCAはデータの次元を下げて分散パターンを強調表示するために適用できますが、MCRは混合信号を純粋な成分スペクトルに分解することができます。N-FINDRアルゴリズムは、最初にPCAを適用して次元を減らすことでエンドメンバースペクトルの抽出を支援し、ハイパースペクトルデータセットに特に適しています。これらのツールは、ラマンスペクトルデータにエンコードされた生物学的パターンの下流探索のための堅牢なフレームワークを提供します。

4. TPM測定プロトコル

  1. 顕微鏡のセットアップを準備します。
    1. 顕微鏡の対物レンズに蒸留水を一滴垂らします。サンプルを顕微鏡の移動ステージに置きます。サンプルの位置を調整して、対物レンズに合わせます。
  2. 対物レンズとコンデンサーレンズを位置合わせします。
    1. 顕微鏡の電源を入れ、TomoStudioイメージングソフトウェアを起動します。ツールバーの顕微鏡アイコンをクリックします。初期化後、[設定] をクリックします。[ジョブ]パネルで[LiveCell]を選択し、培地として[PBS]を選択します。
      メモ: PBS を媒体として選択すると、[媒体] パネルの RI 値は自動的に 1.337 に設定されます。
    2. イメージングソフトウェアのコントロールパネルにある キャリブレーション タブにアクセスします。対物レンズとコンデンサーレンズの軸位置を設定するには、それぞれ [フォーカス] と [表面]を選択します。
    3. [ スキャンモード] をクリックしてレンズを手動で調整し、照明パターンが視野の中央に集中し、ほとんど静止して見えるようにします。
  3. サンプルを見つけます。
    1. [標準モード] をクリックし、移動ステージを調整してセルを視野に配置します。サンプルの境界が画面上でほとんど見えなくなるまで、対物レンズの軸位置を調整して、サンプルに焦点を合わせます。
    2. 移動ステージを調整してセルのない領域を見つけ、遮るもののない視界を確保します。
  4. システムをキャリブレーションします。
    1. イメージングソフトウェアで[ キャリブレーション ]を選択して、さまざまな照明角度で複数の2Dホログラムをキャプチャします。
  5. 3D RI断層撮影を取得します。
    1. 移動ステージを調整して、セルを視野内の中央に配置します。[ 取得] タブに移動し、[ 3Dスナップショット ]を選択して、細胞の断層撮影をキャプチャします。
      注:単一細胞の3D RI断層撮影の取得時間は、RSデータに必要な取得時間と比較して、大幅に短くなります(秒単位)。したがって、TPM用のオンステージインキュベーターの採用は通常必要ありません。ただし、多数の細胞で測定を行う場合、または特定の条件で測定を行う場合は、生理学的条件を提供する専用の市販のインキュベーションチャンバーが利用可能であり、TPMシステムに統合できます。

5. TPMデータ分析

  1. TomoStudioソフトウェアを使用してTPMマップを後処理します。
    1. ホログラフィック断層撮影を視覚化するには、[ データナビゲーション] パネルでデータを選択し、データを右クリックして [ 開く] をクリックします。[ 調査 ] タブが自動的に開き、さらに分析できます。 [データマネージャ ]パネルで、[ RIトモグラフィー]をクリックします。
    2. [ボリュームの視覚化] パネルで [RI] を選択し、RI キャンバス内に 4 つの長方形のカラーボックスを描画します。
      注:各カラーボックスでは、 ディスプレイ パネルに表示される断層撮影で、RIキャンバスのボックスで識別されるRI範囲によって特徴付けられる細胞成分に特定の色を関連付けることができます。各カラーボックスを描画すると、RIキャンバスの下のテーブルに関連情報が自動的に表示されます。
    3. RIキャンバスの下のパネルで、各カラーボックスの RI範囲 の最小値と最大値を設定します(つまり、最初のカラーボックス:MinRI = 1.3450およびMaxRI = 1.3499、2番目のカラーボックス:MinRI = 1.3506およびMaxRI = 1.3571、3番目のカラーボックス:MinRI = 1.3586およびMaxRI = 1.3650、4番目のカラーボックス:MinRI = 1.3688およびMaxRI = 1.3866)。不透明度の値と色を (各ボックスをダブルクリックして色を選択する) を各ボックスに関連付けます。これにより、3D RI分布に従ってトモグラフィーを視覚化することができます。
    4. [保存] をクリックして、定義した RI 範囲とカラー ボックスを保存します。
      注:RI範囲は、特定のサンプルに応じて調整する必要があります。
    5. 細胞形態の定量的記述子(体積[V]、表面積[S]、投影面積[A]、平均RI、密度[D]、乾燥質量[DM]、真球度[Φ])を取得するには、 分析 インターフェイスを利用します。
      注:定量的パラメータの理論的計算の詳細については、2,23を参照してください。
      1. ツールバーで、[解析]をクリックします。右側の [分析] パネルで、[セグメンテーション] パネルの [手動] を選択し、1.3450 を [RI しきい値] として設定します。次に、[適用] をクリックします。
        注:RII(fl / pg)とベースラインRIの値がそれぞれ0.19(以前の調査24で広く確立されている屈折増分)と1.3370(PBSバックグラウンドキャリブレーションのRIに使用されるPBSのRI)であることを確認してください。イメージングソフトウェアは、設定されたRI閾値に従ってターゲット細胞の体積セグメンテーションを実行し、形態学的指標(V、S、A、平均RI、D、DM、およびΦ)を計算し、 測定 パネルの出力テーブルに報告します。
      2. [保存] をクリックして、計算された形態学的インデックスを保存します。
        注:使用されているソフトウェアに加えて、TPMデータから形態学的形質を定量化するために、いくつかのオープンソースツールを使用できます。CellProfiler(https://cellprofiler.org/)は、位相差画像と互換性のあるセグメンテーションや特徴抽出などの画像解析のためのツールを提供します。フィジー(https://fiji.sc/)は、セグメンテーションと形態学的パラメータの計算のためのプラグインを備えたオープンソースソフトウェアです25。Napari (https://napari.org/) は、セグメンテーションと分析のための機械学習モデルの統合をサポートする多次元画像ビューアです。Ilastik (https://www.ilastik.org/) は機械学習ベースのセグメンテーション ツールを提供し、DeepImageJ (https://deepimagej.github.io/) はディープラーニング モデルを ImageJ/Fiji と統合して高度な分析を提供します。さらに、MorphoLibJ (https://imagej.net/plugins/morpholibj) は、フィジーでの 2D および 3D 形態学的操作のためのツールを提供します。Cellpose326 は、位相差イメージングに適用できる細胞セグメンテーション用の別の深層学習ベースのツールです。

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結果

共焦点RSおよびTPMに基づく生細胞のラベルフリー形態化学的特性評価のワークフローについて説明しました。提案されたワークフローがヒト乳がん細胞株MDA-MB-231の分子組成と形態学的パラメーターを達成する能力をテストしました(図1)。

MDA-MB-231細胞を石英ガラス底ペトリ皿に播種しました。785nmの連続波レーザー励起で動作する特注の共焦点ラマン顕微鏡(図1A)を使用して、600 cm-1 から1800 cm-1の間のラマンシフト(Ω)範囲の単一細胞のラマンスペクトル、すなわち、生物学的物質のラマン振動プロファイルのフィンガープリント領域を達成しました27。各単一セルラマン取得には約40分かかりました。細胞の生理学的状態は、測定中にオンステージインキュベーターを使用することによって維持されました。さらに、私たちの方法の非侵襲的な性質を実験的に検証するために、測定後...

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ディスカッション

私たちは、RSとTPMという2つの高度なラベルフリーイメージング技術を統合したマルチモーダルアプローチと簡単な分析パイプラインを提示しました。記載されているワークフローにより、外部標識を必要とせずに、生きたヒト乳がん単一細胞(MDA-MB-231)の迅速で非侵襲的な形態化学表現型解析が可能になりました。

RSは、分子9,27,34,35の振動モードの検出を通じて、生体サンプルの生化学的組成の特性評価を可能にする非破壊技術である。RSは、水からのラマン散乱が無視できるため、水性環境に適しています。この利点により、大規模なサンプル調製を行わずに、培養条件下での生細胞の正確な分子検査が可能になります2,36

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、MIT-Italy財団のProgetto Rocca、NIH助成金(P41EB015871、UH3CA275687、R01DC021326)、Apollon(韓国、ソウル)、および韓国国立がんセンター(NCC-24H1170)から資金提供を受けました。レオナルド・ビアンキは、マサチューセッツ工科大学とミラノ工科大学で共同研究を行うためのプロジェット・ロッカ・ポスドク・フェローシップの授与を認めました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CCDカメラプリンストン・インストゥルメンツPIXIS 100BR エクセロンRaman散乱信号の検出器
CCDカメラ制御ソフトウェアプリンストン・インストゥルメンツライトフィールド
連続波Ti-Sapphireレーザー(波長:785nm)スペクトル物理学3900秒ラマン顕微鏡励起に使用されます。
ダイクロイックミラーソーラボDMSP750B749nmダイクロイックミラー、785nmのラマン励起をサンプルに偏向させ、蛍光と明視野の信号をフィルタリングします。
ウシ胎児血清サーモフィッシャーサイエンティフィックA5256701
蛍光顕微鏡本体オリンポスIX83
レーザー(波長:532nm)スペクトル物理学ミレニア eV785nm Ti-Sapphireレーザーシステム用の励起レーザー。
MATLABソフトウェアマスワークス2023年
MDA-MB-231細胞株ATCCのHTB-26
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TPMデータ解析ソフトウェア株式会社トモキューブトモスタジオ断層相顕微鏡(TPM)データの解析に用いるソフトウェア。

参考文献

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