生きたラベルフリー乳がん細胞の表現型解析を進めるためのマルチモーダルイメージングフレームワーク

サマリー

このプロトコルは、生きたヒト乳がん細胞のラベルフリー、非侵襲的な表現型解析のためのラマン分光法と断層撮影位相顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルアプローチを提示します。これには、迅速で定量的な形態化学分析のためのユーザーフレンドリーでヒューマンバイアスのない分析パイプラインが含まれており、がん研究や細胞生物学への応用で詳細な分子および構造の洞察を提供します。

要約

ヒト乳がん細胞(MDA-MB-231)の迅速な形態化学的表現型解析のためのマルチモーダル共焦点ラマン顕微分光法(RS)および断層撮影位相顕微鏡(TPM)を紹介します。これらの高度な顕微鏡技術の非摂動性を利用して、本来の生理学的環境にあるラベルのない生きた細胞から詳細な形態分子データをキャプチャしました。ハイパースペクトルラマン画像(600 ^cm-1 から1800 ^cm-1までのラマンモードにまたがり、広範囲の分子結合と細胞内構造を独自に特徴付ける)および3次元屈折率断層撮影からの形態学的データ(ナノメートル分解能で細胞体積、表面積、フットプリント、および真球度の測定を提供)を分析するために、ヒトバイアスのないデータ処理パイプラインが開発されました。 乾燥質量と密度と並んで)。RSとTPMが提供する豊富な単一細胞の詳細を体系的に分解することにより、腫瘍性乳がん細胞の表現型解析のためのこのようなマルチモーダル顕微鏡法の利点を定量的に実証します。また、当社のツールは、ラベルを使用せずに細胞内情報に関するさらなる洞察を提供します。最後に、RS および TPM から派生したデータセットが特徴とする一意または相関情報について研究し、議論します。当社のツールと定量的データ解析パイプラインは、培養中の生細胞に対する迅速かつ非摂動的な方法が必要な場合に、生物医学研究における表現型解析タスクに革命をもたらし、将来的には臨床および診断アプリケーションへの応用の可能性を秘めていると考えています。

概要

細胞の特性評価と表現型解析は、生物医学研究の極めて重要な側面です¹。形態学的レベルと分子レベルの両方で細胞を特徴付けることができることは、細胞の機能、分化、および病理学を理解するために最も重要です^1,2,3。腫瘍の診断、病期の決定、および最終的に治療標的の特定のために正確な細胞プロファイリングが必要な腫瘍学の分野で特に興味深いものです²。従来の細胞特性評価法は時間的ダイナミクスを提供できず、通常、染色や標識などの侵襲的な技術に基づいており、細胞の本来の状態に干渉し、データ内に潜在的なバイアスを導入する可能性があります⁴。したがって、生細胞の自然な摂動のない状態での正確かつ徹底的な表現型解析を提供する非侵襲的戦略がますます求められています。

これに関連して、ラベルフリーのマルチモーダルイメージング法は、相補的なモダリティを組み合わせて形態^学的情報と分子情報の両方をキャプチャすることにより、細胞生物学研究に革命をもたらしました^2,....

プロトコル

1. サンプル調製

1. MDA-MB-231細胞を石英ペトリ皿に播種します。
   1. MDA-MB-231ヒト乳がん細胞を3.5 cmの石英ガラス底ペトリ皿にプレートします。
   2. 細胞を5%CO₂ 環境で37°Cで、表面に完全に付着するまでインキュベートします(播種後少なくとも12時間)。
2. 細胞を洗浄し、測定の準備をします。
   1. 細胞がペトリ皿に付着したら、細胞から培地を取り除きます。
   2. 細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかに洗浄し、残留培地を除去します。
   3. 新鮮な細胞培養培地を追加し、測定手順全体を通して細胞を培地で覆い、細胞の生存率を確保します。
      注:培地として、この研究では、5%ウシ胎児血清(FBS)およびペニシリン(100 IU / mL)-ストレプトマイシン(100 μg / mL)を添加したフェノールレッドフリーDMEM / F-12を使用しました。

2. ハイスループットラマン顕微鏡システム

注:MDA-MB-231細胞の生細胞イメージングに関する現....

結果

共焦点RSおよびTPMに基づく生細胞のラベルフリー形態化学的特性評価のワークフローについて説明しました。提案されたワークフローがヒト乳がん細胞株MDA-MB-231の分子組成と形態学的パラメーターを達成する能力をテストしました(図1)。

MDA-MB-231細胞を石英ガラス底ペトリ皿に播種しました。785nmの連続波レーザー励起で動作する特注の共焦点ラマン顕微鏡(図1A)を使用して、600 ^cm-1 から1800 ^cm-1の間のラマンシフト(Ω)範囲の単一細胞のラマンスペクトル、すなわち、生物学的物質のラマン振動プロファイルのフィンガープリント領域を達成しました²⁷。各単一セルラマン取得には約40分かかりました。細胞の生理学的状態は、測定中にオンステージインキュベーターを使用することによって維持されました。さらに、私たちの方法の非侵襲的な性質を実験的に検証するために、測定後.......

ディスカッション

私たちは、RSとTPMという2つの高度なラベルフリーイメージング技術を統合したマルチモーダルアプローチと簡単な分析パイプラインを提示しました。記載されているワークフローにより、外部標識を必要とせずに、生きたヒト乳がん単一細胞(MDA-MB-231)の迅速で非侵襲的な形態化学表現型解析が可能になりました。

RSは、分子9,27,34,35の振動モードの検出を通じて、生体サンプルの生化学的組成の特性評価を可能にする非破壊技術である。RSは、水からのラマン散乱が無視できるため、水性環境に適しています。この利点により、大規模なサンプル調製を行わずに、培養条件下での生細胞の正確な分子検査が可能になります^2,36

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CCDカメラ	プリンストン・インストゥルメンツ	PIXIS 100BR エクセロン	Raman散乱信号の検出器
CCDカメラ制御ソフトウェア	プリンストン・インストゥルメンツ	ライトフィールド
連続波Ti-Sapphireレーザー(波長:785nm)	スペクトル物理学	3900秒	ラマン顕微鏡励起に使用されます。
ダイクロイックミラー	ソーラボ	DMSP750B	749nmダイクロイックミラー、785nmのラマン励起をサンプルに偏向させ、蛍光と明視野の信号をフィルタリングします。
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A5256701
蛍光顕微鏡本体	オリンポス	IX83
レーザー(波長:532nm)	スペクトル物理学	ミレニア eV	785nm Ti-Sapphireレーザーシステム用の励起レーザー。
MATLABソフトウェア	マスワークス	2023年
MDA-MB-231細胞株	ATCCの	HTB-26
NIR分光器	アンドロール	ホロスペック HS-HSG-785-LF	後方散乱光のスペクトル解析に使用されます。
対物レンズ(60&1.2NA水浸)	オリンポス	UPLSAPO60×
ステージ上のインキュベーションチャンバー	東海ヒット	stxg-welsx-セット
オープンソースの顕微鏡制御ソフトウェア	&マイクロ;支配人	マイクロマネージャー-2.0
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
フェノールフリーDMEM/F-12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21041025
リン酸緩衝生理食塩水	ギブコ	10-010-023
石英ガラス底ペトリ皿	ウェイクンBテック	SF-S-D12
ラマンデータ解析ソフトウェア	ラムアプリ		Ramanハイパースペクトルデータ処理のためのWebベースのツール。
sCMOSカメラ	浜松ホトニクス	Orca フラッシュ 4.0 v2
シリンジポンプ	ケミックス	フュージョン720
断層相顕微鏡	株式会社トモキューブ	HT-2H	定量的位相画像を取得するための商用システム
TPMデータ解析ソフトウェア	株式会社トモキューブ	トモスタジオ	断層相顕微鏡(TPM)データの解析に用いるソフトウェア。