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方法論記事

高強度トレッドミル運動トレーニング後の骨に対する赤外線療法の効果の調査

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DOI:

10.3791/68502

2025年8月22日

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

長時間の高強度トレッドミル運動トレーニングは、マウスの骨形成を阻害し、骨吸収を促進し、その結果、骨量が減少します。ここでは、高強度の運動誘発性骨代謝の変化に対する赤外線療法の効果を調べるプロトコルを提示します。根底にある分子経路を解明するには、さらなる機構研究が必要です。

要約

骨組織は人体の重要な耐荷重器官です。適度な運動は機械的負荷によって骨量を増加させますが、高強度の運動はそれを抑制する可能性があります。赤外線療法は血行を改善し、痛みや炎症を軽減し、組織の修復を助けます。本論文では、高強度の運動誘発性骨格代謝障害に対する赤外線療法の調節効果とその分子機構を解明するためのプロトコルを提示する。この研究では、生後 6 週間のマウス 24 匹を無作為に対照群 (CTR、N = 8)、高強度トレッドミル運動トレーニング (HIT、N = 8)、および高強度トレッドミル運動後の赤外線療法 (IRT、N = 8) 群に分けました。後者の 2 つのグループは 8 週間トレーニングされました。最初の週に、マウスはトレッドミル順応トレーニングを受けました。2週目に、マウスは24 m / minの速度で50分間運動し、毎週1 m / minと10分の速度で増加し、80分間28 m / minに達するまで、6日間5°の勾配で運動しました。5週目に、HIT群マウスに全身赤外線療法介入を施し、温度を42°Cから45°Cに制御しました。 治療プロセス全体は、週に 3 回、~40 分続きました。その結果、CTR群と比較して、HIT群では骨量/総体積および骨柱数が有意に減少し、小柱分離が有意に増加し、 Atf4Runx2およびOcn の骨形成関連遺伝子がダウンレギュレートされ、 Ctsk および Mmp9 の破骨細胞関連遺伝子がダウンレギュレートされたことが示されました引き上げられた。IRT群マウスのマイクロCT結果では有意差は見られなかったが、骨形成関連遺伝子 Alp、Atf4、Runx2、OcnOxx は大腿骨でアップレギュレーションされた。さらに、破骨細胞関連遺伝子 Ctsk がダウンレギュレーションされました。長時間の高強度のトレッドミル運動は、骨量を減らす可能性があります。赤外線療法は骨密度には影響しませんが、骨代謝を改善する可能性があります。

概要

骨粗鬆症 (OP) は、最も一般的な全身性代謝性骨疾患の 1 つであり、特に高齢者に蔓延しており、主要な世界的な健康問題を表しています1。OP は主に骨密度 (BMD)、骨質、および骨強度の低下を特徴とし、骨折のリスクを高めます2。OP の予防と治療は、薬物療法、カルシウムとビタミン D の適切な摂取、喫煙とアルコール摂取の削減、ピーク骨量レベルを増加および維持するための早期運動などのアプローチを含む、人間の生活の質を改善するために非常に重要です 3,4

骨は体の構造的枠組みとして、基本的な形状を提供し、内臓を保護します。神経系の調節下で、骨は筋肉の収縮中のさまざまな動きを促進します。骨は生涯を通じて、継続的な形成、吸収、改造を経ます。破骨細胞は古い骨を継続的に吸収し、骨芽細胞は新しい骨を形成して石灰化します。これらのプロセスは密接に結合され、相互に調節されており、骨代謝回転の動的バランスを維持します5。多くの研究は、適切な身体運動 (有酸素運動やレジスタンス トレーニングなど) が OP6 を効果的に予防および治療できることを示しています。運動は、骨格への機械的ストレス (地面への衝撃、衝撃、筋肉付着部位の緊張など) と血液循環の生化学的要因 (ホルモンやサイトカインなど) を調節することにより骨代謝に影響を与え、骨の健康を促進します7。しかし、長時間の高強度運動は骨の健康に悪影響を及ぼし、骨量減少につながる可能性があります。例えば、腱板損傷マウスモデルにおいて、高、中、低強度(速度15 m/min)でトレッドミルを8週間走行した後、骨量/総体積(BV/TV)、小柱数(Tb.N)、および骨柱厚(Tb.Th)は、対照群および中程度/低強度群と比較して、高強度群で最も低かった。 一方、小柱分離(Tb.Sp)が最も高かった。この発見は、高強度のトレーニングが腱板の回復と骨量に悪影響を与えることを示唆しています8

赤外線療法 (IRT) は、中国のリハビリテーション理学療法装置で最も広く使用されている原理の 1 つです。局所的な血液循環を促進し、炎症性物質の吸収を促進し、栄養素の供給を高めます 9,10。IRTは非侵襲的な理学療法として、近年、スポーツ医学、リハビリテーション科学、骨代謝研究の分野で広く注目を集めています。IRT は、他の介入よりも臨床現場でより一般的に使用されています。研究によると、骨組織の治癒は炎症の解消や細胞再生を含む複雑なプロセスであり、炎症、増殖、リモデリングの 3 つの段階に分けることができます。炎症期は主に血管新生によって特徴付けられます。増殖期には、骨芽細胞の増殖と新しい骨の形成が含まれます。そして、リモデリング段階は、カルス内に新しく形成された小柱が徐々に増加することによって特徴付けられ、骨折ギャップを横切るブリッジカルスは完全に骨化します11。骨折後、血管から組織に流れる血液を急速に吸収する必要があり、骨芽細胞の増殖と骨形成が刺激されます。これらの重要なプロセスには、好ましい内部環境とサポートのための十分な栄養素が必要です。ある程度の温熱療法は、これらの機能を効果的に促進できます12.臨床現場では、赤外線療法は骨粗鬆症を治療し、関連する症状を緩和するための補助手段として使用できますが、骨量に関する研究は比較的限られています。本論文では、高強度の運動誘発性骨格代謝障害に対する赤外線療法の調節効果とその分子機構を解明するためのプロトコルを提示する。したがって、この研究は、以前の研究13 に基づいて構築され、マウスの高強度トレッドミル運動モデルを構築して、骨量の変化を観察し、温熱療法が高強度のトレッドミル運動によって引き起こされる骨量減少を軽減できるかどうかをさらに調査します。目的は、運動ベースの OP の予防と治療のための参考を提供することです。

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プロトコル

この研究は、上海体育大学の実験動物倫理委員会 (No. 102772023DW016) から倫理的承認を受け、国/施設の動物研究規則に準拠しました。生後5週間の雄C57BL / 6マウス24匹を、上海体育大学のSPFグレードの動物施設に収容しました。マウスは、22±2°C、湿度40〜70%で、12時間の明暗サイクルで飼育され、 自由に 餌/水を提供しました。骨、血液、RNA抽出試薬で処理されたサンプルを含むすべての生物学的材料は、バイオハザードレベルIIオートクレーブバッグに収集し、廃棄前に121°Cで60分間滅菌し、実験室の廃棄物ログに適切な文書を記載する必要があります。

1. 動物

  1. 順応1週間後、マウスを体重別に層別化し、対照群(CTR群、N = 8)、高強度トレッドミル運動訓練(HIT、N = 8)、および高強度トレッドミル運動後の赤外線療法(IRT、N = 8)群の3つのグループにランダムに割り当てます。

2. 高強度トレッドミル運動トレーニングと温熱療法介入プロトコル

  1. 介入せずに静的条件下でCTRグループに餌を与えます。
  2. 順応の1週間後、HITおよびIRTグループのマウスに8週間の高強度トレッドミルトレーニングを施します。最初の週は適応段階と見なされます:トレッドミルグループのマウスを、それぞれ12、15、および18 m / minの速度で、0°の傾斜で20、30、および40分間走らせます。2週目に、マウスに24 m / minの速度で50分間運動させ、その後、毎週1 m / minと10分の速度で、80分間28 m / minに達するまで、5°の勾配で運動量を増やします。この運動計画を週 6 日実施し、日曜日は休憩します (表 1)。
  3. IRT グループの場合、4 週間のトレッドミル運動の後、5 週目に赤外線療法 (IRT) を導入します。
    注:赤外線照射中は、マウスの体温を42°Cから45°Cに厳密に維持してください。
    1. マウスに腹腔内注射で麻酔し、意識を失わせます。
    2. 赤外線治療装置を使用してマウスの全身を照射し、マウスの体温が42°C〜45°Cの間に保たれるようにします(温度検出器で検出)。サンプルが採取されるまで、週に3回(月曜日、水曜日、土曜日)~40分間、治療プロセス全体を4週間実行します。

3. 組織採取

注:解剖されたマウス骨サンプルは、RNAの完全性を維持するために、液体窒素または-80°Cで直ちに保存する必要があります。

  1. 血清サンプルの採取と保存
    1. 電子天びんを使用してすべてのマウスの体重を量ります。
    2. トリブロモエタノールの腹腔内注射によってマウスを麻酔します。
      注:トリブロモエタノールを取り扱うときは、ニトリル手袋と目の保護具を着用した状態で、常に化学ヒュームフードの下で新鮮な溶液を調製し、光から保護された琥珀色のバイアルに4°Cで保管し、未使用の部分は承認された化学廃棄物チャネルを介して廃棄してください。
    3. 心臓穿刺を使用して無菌的に血液サンプルを採取し、0.5〜0.6 mLの血液を採取します。まず、マウスの胸毛を剃り、ヨードフォアで消毒します。続いて、最大心拍動の点を触診し、注射器に取り付けられた4〜5 Gの針を左胸腔の第3および第4肋間腔の間に挿入します。最後に、血液が自発的に注射器に流れ込むことが観察されたら、穏やかな吸引を適用して採血手順を完了します。
    4. 血液サンプルを室温で10分間凝固させた後、1,000 × g で15分間遠心分離します。上清(血清)を分注し、-80°Cで保存します。
  2. 骨サンプルの収集と保存
    1. 滅菌マイクロハサミとピンセットを使用して、大腿骨と脛骨の両方を解剖します。骨膜をこすらずに、縦軸に沿って骨表面から筋肉や腱をそっと剥がし、成長板の保護に特に注意を払います。
    2. すべてのサンプルを1x PBS(pH 7.4)ですすぎます。左大腿骨を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で24時間固定します。さらに分析する前に、左大腿骨を使用して骨密度を測定します。
    3. 右大腿骨を事前に標識された1.5 mL微量遠心チューブに入れ、-80°Cで保存します。
    4. 骨代謝アッセイには、右大腿骨と両方の脛骨を使用します。

4. パラメータの測定

  1. 血糖値測定
    1. 組織採取の前に、マウスの尾静脈から血液サンプルを採取します。ポータブルグルコース分析装置を使用して血糖値を測定します。
  2. 血中乳酸濃度測定
    1. 最後のトレッドミル運動セッションの直後に、尾静脈から血液サンプルを採取します。ポータブル乳酸分析装置を使用して血中乳酸レベルを測定します。
  3. ロタロードテスト
    注:すべての介入が完了した後、各グループのマウスでロータロッドテストを実施しました。ロータロッド試験を実施する場合、1 つのグループのマウスを最初にテストするのではなく、一貫した休息時間を確保するために、同時にテストするマウスの異なるグループを選択するため、休息時間による違いを排除できます。
    1. マウスを回転方向の反対方向に向けて回転装置に置き、1回の適応試験を可能にします。
    2. 回転速度を30rpmに設定します。始動後、装置は設定速度まで均一に加速します。
    3. マウスが最初に落ちるまでの時間を記録します。この測定を使用して、マウスの運動協調能力を評価します。
  4. 大腿骨梁骨量の測定
    1. 骨に付着した筋肉や結合組織を滅菌マイクロハサミと鉗子で取り除き、PBSで洗浄します。
    2. マイクロCTスキャンを実行して、次のスキャンパラメータを使用して左大腿骨の小柱骨のパラメータを評価します:マイクロCTスキャンは、9 μmの等方性ボクセル、31.0 mm FOV、250 ms露光、ネイティブ解像度(388層/セグメント)、および1,200 mgHA / cc BHキャリブレーションを使用して、連続回転モードで55 kVp / 145 μA(8 W)で実行されました。
    3. 小柱および皮質の微細構造の次の結果を測定します。
      1. 再構成された画像をCT-voxにインポートして、3次元(3D)レンダリングと視覚化を行います。
      2. 多平面ビュー(冠状面、矢状面、横方向)を使用して、皮質骨と小柱骨を分離して別々の組織領域に抽出し、それらの形態学的特性を独立して分析できるようにします。
      3. 骨量/総体積 (BV/TV)、小柱数 (Tb.N)、小柱厚 (Tb.Th) 小柱分離 (Tb.Sp) などの主要な微細構造パラメーターを定量化して、骨の発達と石灰化状態を評価します。
  5. パラフィン切片化と組織学的染色
    1. 各グループの3つの左大腿骨をPBSで洗浄し、完全な脱灰が起こるまで10%EDTA(pH 7.15)で脱灰します。
    2. 段階的なエタノール濃度(70%、90%、95%、および100%)でサンプルを脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンを浸透させ、埋め込みます( 表2を参照)。
    3. 厚さ5.0μmの連続切片を切断します。
    4. ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色
      1. スライスを最初にキシレン脱ろう、グラジエントエタノール再水和にかけ、次にヘマトキシリンに5分間浸します。
      2. 洗浄して余分な染色を取り除き、1%塩酸アルコールで3秒間分化し、エオシンで3分間染色し、段階的なエタノールで脱水し、キシレンでクリアし、中性ガムでマウントします( 表3を参照)。
      3. 顕微鏡画像を撮影して、骨髄腔内の骨組織構造と細胞の形態と分布を観察します。
    5. 酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色
      1. スライスをキシレンで脱ワックスし、グラデーションエタノールで再水和します。
      2. スライスをTRAP試薬とともに37°Cのオーブンで1時間インキュベートし、脱水し、透明化します( 表4を参照)。
      3. スライドガラスに中性樹脂を一滴垂らし、気泡の形成を最小限に抑えるために、カバーガラスを片方の端から 45° の角度で慎重に下げます。取り付けられたスライドをヒュームフード内で完全に乾燥させてから、顕微鏡観察とイメージングに進みます。
  6. 脛骨組織における遺伝子発現解析
    1. 骨髄分離
      1. マウスの脛骨を解剖し、滅菌ツールを使用して余分な筋肉/筋膜を除去します。
      2. 洗浄した脛骨を1.5 mLの微量遠心チューブに入れます。
      3. 滅菌ハサミで骨の両端を切り開きます。
      4. 1x PBSを使用して、滅菌粉砕ビーズを含む粉砕チューブに骨髄を洗い流します。
        注:空洞が青白く見え、目に見える骨髄組織がすべて除去されるまで、骨髄腔をPBSで洗い流します。
    2. RNA抽出
      注:クロロホルム/イソプロパノール廃棄物は、指定されたハロゲン化溶媒容器に分離し、有毒ガスの形成のために漂白剤と混合しないでください。
      1. チューブあたり1 mLのRNA抽出試薬を加えます。卓上ホモジナイザー(30秒パルス、4°C)を使用してサンプルを均質化します。ライセートを室温で5分間インキュベートします。
      2. 200 μLのクロロホルムを加え、15秒間ボルテックスし、4°Cで30分間インキュベートします。
      3. 12,000 × g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。
      4. 上部水相を新しい微量遠心チューブに移します。500 μLのイソプロパノールを加え、10倍反転させて混合し、4°Cで20分間インキュベートします。
      5. 12,000 × g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。 RNAペレットを乱さずに、上清を慎重に廃棄します。
      6. ペレットを1mLの75%エタノール(DEPC処理水で調製)で洗浄します。短時間ボルテックスし、7,500 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
      7. ペレットをヒュームフードで5〜10分間自然乾燥させます(過度の乾燥は避けてください)。
      8. RNAを20〜50 μLのDEPC処理水に溶解します。
      9. 分光光度計を使用して濃度と純度(A260/A280比≥1.8)を測定します。
    3. cDNA合成
      1. 1 μgのトータルRNAと逆転写キットを使用してcDNAを合成します。
      2. qPCR分析のためにcDNAを-20°Cで保存します。
    4. qPCR分析
      1. 骨形成マーカーの遺伝子発現を分析します:Alp、Atf4、Runx2、Ocn、Osx。破骨細胞マーカー: Nfatc1、Mmp9、Ctsk;サイトカイン: Tnf-α、Il-1β、Il-10 ( 表5を参照)。
      2. 表6にリストされているプライマー配列を使用します(アニーリング温度を含む)。

5. 統計分析

  1. すべてのデータを平均値±平均値(SEM±平均値)として表示します。
  2. 事後テストには Bonferroni と Tamhani を使用します。
  3. 一元配置分散分析を実施して、グループ間の差異を評価します。
  4. P < 0.05 を統計的に有意と見なします。

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結果

長時間の高強度トレッドミル運動トレーニングによる疲労
運動中の骨格の変化と赤外線療法の骨への影響を研究するために、長期の高強度プラットフォームランニング運動モデルを確立しました(図1A)。介入の最後に、マウスの体重の変化を観察しました。CTR群のマウスの体重と比較して、HIT群では有意な変化は認められなかったが、IRT群では有意な減少が見られた(図1B)。3つのグループ間で血糖値に有意差は存在しませんでした(図1C)。ロタロッド試験データでは、HIT群のマウスの落下時間はCTR群よりも有意に低く、IRT群の落下時間はHIT群よりも有意に高いことが示されました(図1D)。

血中乳酸濃度の上昇と疲労の間には強い関係が存在します14。高強度の身体活動中に形成される高...

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ディスカッション

すべての代謝性骨疾患の中で、OP は最も一般的であり、主要な世界的な公衆衛生上の問題です11。OP は、骨芽細胞および破骨細胞の機能が機能不全であり、その有病率が高い場合に発生します18。運動は、低コストで副作用が少なく、将来の OP の治療と予防における大きな可能性を考慮して、OP の予防と治療のための潜在的な戦略として医師や研究者によってますます強調されています。運動が骨代謝を調節するメカニズムは、直接的および間接的な影響を含め、よく研究されています19。運動中に発生する機械的負荷は、骨芽細胞の分化と石灰化の主要な刺激であり、骨量を促進する可能性があります20。さらに、運動は、骨代謝に関与するエストロゲン、PTH、およびグルココルチコイドのレベルを調節することにより、骨量の調節に役割を果たすことができ、エストロゲンは破骨細胞形成性サイトカインの産生を調節し、それによって骨芽細胞...

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開示事項

著者には報告すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金(第82172475、82222046、82272608号)の支援を受けました。上海人間スポーツ能力開発・維持重点研究所(上海体育大学)(No.11DZ2261100)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
遠赤外線治療器 Cofoe メディカルテクノロジー次に、皮下毛細血管網内の血液を温めるための熱源として赤外線を適用しました。治療温度は 42 度の間で制御されました。Cおよび45°C、治療全体は週に 3 回、約 40 分間続きました
マイクロCTSCANCO Medical AGVIVACT80マイクロ CT スキャンを実行して、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、および皮質の厚さ (Ct.Th) を含む左大腿骨の骨梁のパラメーターを評価しました。
マウストレッドミル安徽正華生物装置設備有限公司マウスで走る高強度トレッドミル
パラフィン包埋機ライカパラフィン包埋機は組織を埋め込むことができます
パラフィンスライサーライカパラフィンミクロトームは組織をスライスできます
PrimeScript RT試薬キット 
SPSS 
トリブロモエタノール アバーチン
トリゾル 正確な生物学AG21101/AG21102

参考文献

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