CRISPRベースのシャトルクローニング:ハイスループットクローニング法

Summary

ハイスループットクローニング法であるCRISPRベースのシャトルクローニング(CRISPRshuttle cloning)のプロトコールについて述べます。これにより、DNA断片のPCR増幅を必要とせずに、目的のDNA断片をベクター間で転写することができます。

Abstract

既存のゲノムリポジトリを使用したゲノムワイドプラスミドライブラリの開発は、多様な生物学的プロセスにわたる遺伝子の系統的な機能特性評価のための極めて重要な前提条件として機能します。しかし、現在のハイスループットなDNA断片転写法では、クローニング前に標的配列をPCR増幅する必要があるため、ゲノムスケールのプラスミドコレクションの生成は技術的に要求が厳しく、時間がかかります。CRISPRshuttleカセットを活用して、DNA断片のPCR増幅なしで、同一の骨格配列を共有するドナープラスミドからCRISPRshuttle適合ベクターへの多数のDNA断片の転写を容易にする新しいハイスループットクローニング法であるCRISPRベースのシャトルクローニング(CRISPRshreクローニング)を開発しました。ここでは、CRISPRshuttleのプロトコルを紹介します。このプロトコルには、細菌の形質転換に先立つ2つの連続した試験管反応が含まれます。まず、標的DNA断片は、Cas9を介した共有ベクターバックボーン配列の切断により、ドナープラスミドから切り出されます。次に、切り出されたDNA断片は、ギブソンアセンブリを介して直鎖化されたCRISPRshuttle適合ベクターに挿入されます。私たちの結果は、CRISPRshuttleの効率が94%を超え、2人の研究者がCRISPRshuttleを使用して7日間で約300のプラスミドを生成できることを示しています。CRISPRshuttleは、効率的で適応性があり、費用対効果の高いベクター間のDNAフラグメント転写を促進し、ゲノムワイドなプラスミドライブラリの生成を大幅に効率化します。

Introduction

利用可能なリソースからゲノムワイドなプラスミドライブラリーを構築することは、機能ゲノミクスを使用して生物学的プロセスを解剖するための基礎であり、前提条件です。Gateway、In-Fusion、Creator、Univectorクローニングシステムなどの現在のハイスループットクローニング法では、標的DNAフラグメント^{1、2、3、4、5}のPCR増幅が必要です。この前提条件には、オリゴヌクレオチドプライマーの設計、ゲル精製、シーケンシングによる配列検証など、複数の標準化された操作を含むフラグメント固有の処理ワークフローが含まれます。その結果、ゲノムワイドなプラスミドライブラリー(cDNA/ORF過剰発現ライブラリーなど)の構築は、手間と時間がかかり、機能ゲノミクスの進歩を妨げています。

これまでに、特定のDNAフラグメント(UASモジュールなど)を同一のベクターバックボーンを共有する複数のプラスミドに統合するように設計されたハイスループットクローニング法であるCRISPRmassを開発しました⁶。CRISPRmassを使用して、 ショウジョウバエ cDNA/ORFライブラリーである Drosophila Genomics Resource center(DGRC)Gold Collection⁶から、5,500を超えるGAL4/UASベースのUAS-cDNA/ORFプラスミドを構築しました。しかし、CRISPRmassにはベクター間でDNA断片を転写する能力がないため、ハイスループットクローニングへの応用が困難です。

これらの制限に対処するために、私たちは、ドナープラスミドから目的地ベクターへの複数の標的DNA断片の転写を容易にする新しいハイスループット法であるCRISPRベースのシャトルクローニング(CRISPRshuttle)を開発しました⁷。このプロセスでは、2回の連続した試験管反応のみが必要であるため、個別のDNAターゲット⁷のフラグメント特異的な取り扱いの必要性を回避できます。

CRISPRshuttleのプロトコルには、2つの連続した試験管反応が含まれます(図1)。まず、ドナープラスミドの共有ベクターバックボーン配列をCas9/sgRNAによって切断し、標的DNA断片を放出します。次に、これらのフラグメントをGibsonアセンブリを介してCRISPRshuttle適合ベクターのCRISPRshuttleカセットに移し、最終的なプラスミドを生成します。CRISPRshuttleカセットは、ドナープラスミドに由来するDNA断片の5'末端と3'末端に隣接する~20-40 bpのベクターバックボーン配列と、これらの隣接配列の間に位置する1つまたは2つのユニークな制限酵素認識部位で構成されています。CRISPRshuttle対応ベクターは、CRISPRshuttleカセットを目的ベクターに挿入し、その後、カセット内の制限部位を消化することで線状化することで構築されます。目的地ベクターは、ドナープラスミドのものとは異なる抗生物質耐性遺伝子を保有している必要があります。同一の場合、耐性遺伝子は使用前に別個のものと交換する必要があります。

ここでは、CRISPRshuttleを使用してUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリを構築する詳細なプロトコルを紹介します。このプロセスでは、ヒトORFをCCSB-Broad Lentiviral Expression LibraryからDrosophilaトランスジェネシスベクターpBID-UASC ^8,9に移管します。CRISPRshuttleは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリーの構築を効率化し、機能ゲノミクス研究を促進します。

Protocol

1. cDNA/ORFに隣接するCas9/sgRNAの最適切断部位の決定

1. cDNA/ORFプラスミドの調製
   1. 公開リポジトリからcDNA/ORFクローンを取得します。
      注:このプロトコルは、ヒトCCSBブロードレンチウイルス発現^{ライブラリー8}のpLX304ベクターベースのORFクローンを使用します。
   2. プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドを単離し、分光光度計でその濃度を測定します。
2. sgRNAデザイン
   1. CHOPCHOPのホームページ(https://chopchop.cbu.uib.no/)にアクセスします。ORF 3'末端に隣接するpLX304ベクトルバックボーンの20-100 bp領域をターゲットフィールドに貼り付けます。
   2. 種として Drosophila melanogaster を選択し、[ターゲット サイトの検索] をクリックします。80%以上の効率が予測されるsgRNA候補を選択します。
3. sgRNA調製
   1. フォワードプライマー(5'-TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3')とリバースプライマーsgRNA-REV(5'- AAAAGCACCGACTCGTGCCACTT-3')を合成します。
      注:PAGE精製プライマーをお勧めします。
   2. PCRにより、sgRNA のin vitro 転写(IVT)用のDNAテンプレートを作製します。テンプレートpX330(Addgene plasmid 42230;0.1 ng/μL)、フォワードプライマー(10 μM)、およびsgRNA-REVプライマー(10 μM)をそれぞれ5 μL含む100 μLの反応液を調製します。50 μL の 2x High-Fidelity PCR マスターミックス。35 μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理された超純水。
   3. PCRサーマルサイクラーで増幅するには、次のプログラムを使用します:98°Cで30秒。98°Cで8秒、52°Cで15秒、72°Cで5秒の5サイクル。98 °C で 8 秒、72 °C で 20 秒の 30 サイクル。72°Cで2分間。
   4. 0.8%アガロースゲルでPCR産物を分離します。~120 bp のバンドを切除し、ゲル抽出キットを使用して精製します。
   5. 精製DNA断片300 ng、NTPバッファーミックス3.33 μL、T7 RNAポリメラーゼミックス0.67 μL、およびDEPC処理超純水を含む10 μL IVT反応液を調製します。37°Cで4時間インキュベートします。
   6. 分光光度法で未精製のsgRNAを定量し、DEPC処理した超純水で20 ng/μLに希釈し、少量のアリコートで-80°Cで凍結します。
      注:残留DNAが下流の反応を妨げないため、DNase処理は不要です。
4. sgRNAの評価
   1. 制限酵素を用いて、pLX304ベクター骨格を含むcDNA/ORFプラスミドを消化します。得られたDNA断片を0.8%アガロースゲルで分離します。ゲル抽出キットを使用してDNA基質を精製します。
   2. 0.2 μL の 1.22 μM 化膿性ブドウ球菌 Cas9、0.5 μL の 20 ng/μL sgRNA、0.015 pmol の DNA 基質、0.5 μL の 10x Cas9 Buffer、および DEPC 処理した超純水を含む 5 μL の Cas9 切断反応混合物を調製します。反応液を37°Cで1時間インキュベートします。
   3. 0.8%アガロースゲルを使用して切断産物を分離します。切断されていないDNA基質をネガティブコントロールとして含めます。
   4. デジタルイメージングシステムを使用して切断パターンを視覚化し、その後の実験のために、残存する未切断基質が最小のsgRNAを選択します(図2)。

2. 目的ベクターの抗生物質耐性遺伝子の入れ替え

注:このプロトコルでは、宛先ベクターpBID-UASCのアンピシリン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子と交換する例を使用し、それによりクロラムフェニコール含有宛先ベクターpBIDC-UASCを生成します。

1. pBID-UASCからアンピシリン耐性遺伝子を除去します。
   注:pBID-UASCのアンピシリン耐性遺伝子は、Cas9消化とf1Ori5-G4(標的配列:5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3')およびAmp3-G2(標的配列:5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3')の2つのsgRNAと併用して除去され、7,687 bpの線形pBID-UASCベクターバックボーンが得られました。これら2つのsgRNAは、それぞれアンピシリン耐性遺伝子の5'上流と3'下流を標的としています。
   1. 0.03 pmolのpBID-UASC、0.25 μLの1.22 μM S. pyogenes Cas9、20 ngのf1Ori5-G4、20 ngのAmp3-G2、1 μL 10x Cas9 Buffer、およびDEPC処理した超純水を含む10 μLの切断反応を準備します。37°Cで1時間インキュベートします。
      注:Cas9切断プラスミドは、精製せずに、直接ギブソンアセンブリにかけられます。
2. クロラムフェニコール耐性遺伝子をPCR増幅します。
   注:プラスミドpMartini-Cam⁶ から840 bpのクロラムフェニコール耐性遺伝子を、f1Ori5-Cam-F(5'-TTACAATTCACTGGCC)を使用したPCRにより増幅しました。
   GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3') および Amp3-CAM-R (5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
   GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3')プライマー。
   1. 840 bpのクロラムフェニコール耐性遺伝子をPCR増幅することにより、クロラムフェニコール耐性遺伝子を調製します。2 μL の pMartini-Cam (0.1 ng/μL)、1 μL の f1Ori5-Cam-F (10 μM)、1 μL の Amp3-Cam-R (10 μM)、4 μL の 5x バッファー、0.4 μL の dNTP (10 mM)、0.4 μL のハイフィデリティ DNA ポリメラーゼ (2.5 units/μL)、11.2 μL の超純水を含む 20 μL の PCR 反応液をセットアップします。
   2. 以下のサーモサイクル条件を用いてPCRを実施します:95°Cを1サイクルで1分間;95°Cで15秒、46°Cで15秒、72°Cで20秒の5サイクル。95 °C で 15 秒、61 °C で 15 秒、72 °C で 20 秒の 30 サイクル。72°Cを1サイクル、2分間サーマルサイクラーで反応を行います。
   3. 0.8%アガロースゲルで切断産物を分離し、ゲル抽出キットを使用して840 bp DNAフラグメントを精製します。
3. クロラムフェニコール耐性遺伝子を直鎖状のpBID-UASCベクターバックボーンに挿入し、pBIDC-UASCが得られます。
   1. 2 μL の Gibson アセンブリ反応を実行します: 0.008 pmol の 840 bp クロラムフェニコール耐性遺伝子、0.002 pmol の直鎖状 pBID-UASC (ステップ 2.1.1)、1.0 μL の 2x Gibson アセンブリ マスター ミックス。50°Cで1時間反応を行います。
   2. 10 μLの 大腸菌 コンピテントセルを1 μLのライゲーション反応産物で形質転換します。15 μg/mL クロラムフェニコールを添加した LB プレート上の形質転換体を選択します。
   3. 1つのコロニーを選び、その後の細菌培養とプラスミドミニプレップにかけます。制限解析とDNAシーケンシングにより、クロラムフェニコール含有目的ベクターpBIDC-UASCを確認します。

3. CRISPRshuttle対応デスティネーションベクターの構築

注:CRISPRshuttleカセットは、標的DNA断片の5'末端と3'末端の両方に隣接する約20-40 bpのベクターバックボーン配列で構成され、その間に1つまたは2つの固有の制限部位があります。

1. サーマルサイクラーを使用してオリゴヌクレオチドをアニールし、次のプログラムで:94°Cで2分間。(95-N)°Cで52秒を70サイクル、ここでNはサイクル番号を表します。
   注:アニールされたCRISPRshuttleカセットには、EcoRIおよびXbaIを補完する5'-オーバーハングが含まれています。
2. アニールしたCRISPRshuttleカセットをEcoRI/XbaI消化デスティネーションベクターpBIDC-UASCにライゲーションして、CRISPRshuttle対応デスティネーションベクターpBIDC-UASC-pLXvectを生成します。
   注:このライゲーションにより、複数のクローニング部位内の元のEcoRIおよびXbaI部位が排除され、CRISPRshuttleカセットの中央にあるEcoRIおよびXhoI部位が最終ベクターで一意になります。CRISPRshuttle カセットの固有の制限サイトにより、CRISPRshuttle と互換性のあるデスティネーションベクトルの線形化が可能になります。
   1. 14 ngの8,451 bp EcoRI/XbaI消化pBIDC-UASC、0.02 pmolのアニーリングされたCRISPRshuttleカセット、0.5 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、0.3 μLのT4 DNAリガーゼを含む5 μLのライゲーション反応を準備します。反応液を16°Cで一晩インキュベートします。
   2. 10 μL の 大腸菌 コンピテントセルを 1 μL のライゲーション反応産物で形質転換します。15 μg/mL クロラムフェニコールを添加した LB プレートで形質転換体を選択し、37 °C で一晩インキュベートします。
   3. 1つのコロニーを選び、その後の細菌培養とプラスミドミニプレップにかけます。制限解析とDNAシーケンシングにより、CRISPRshuttle適合デスティネーションベクターpBIDC-UASC-pLXvectを確認します。

4. CRISPRshuttleを用いたUAS-cDNA/ORFプラスミドの作製

注:CRISPRshuttleプロトコルでは、細菌の形質転換前に2段階の試験管反応を並行して実施します(図1)。

1. 試験管反応ステップ1
   1. Cas9 と 2 つの sgRNA、pLX304-CMV-G1⁶ (標的配列: 5'-GAGCTCTCTCTGGCTAACTGTC-3'、ORF 5' 末端に隣接する pLX304 ベクターバックボーンに局在) および pLX304-3'-G1 (標的配列: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCGG-3'、ORF 3' 末端に隣接する pLX304 ベクターバックボーンに局在する) と組み合わせた Cas9 を使用してベクターバックボーンを切断することにより、pLX304-ORF プラスミドから ORF を切除します。
      1. (N+1) x 0.4 μL の 1.22 μM 化膿性ブドウ球菌 Cas9、(N+1) x 0.5 μL の 80 ng/μL pLX304-CMV-G1、(N+1) x 0.5 μL の 80 ng/μL pLX304-3'-G1、(N+1) x 0.4 μL の 10x Cas9 バッファー、(N+1) x 1.45 μL の DEPC 処理超純水。
      2. よく混ぜて、マスターミックスをスピンダウンします。マスターミックス3.75μLを各チューブに分注します。0.75 μL の 0.03 μM pLX304-ORF プラスミドを各チューブに添加します。十分に混合し、反応液を37°Cで1時間インキュベートします。
         注:各pLX304-ORFプラスミドをDEPC処理した超純水で0.03μMの濃度に希釈します。濃度が0.03 μM未満の場合は、プラスミドDNAを直接反応液に添加します。Cas9切断プラスミドは、切断反応後に精製する必要がなく、その後のギブソンアセンブリに直接使用できます。
2. 試験管反応ステップ2
   1. 切り出したORFをGibsonアセンブリを介してCRISPRshuttle対応のデスティネーションベクターpBIDC-UASC-pLXvectに挿入すると、UAS-cDNA/ORFプラスミドが得られます。
      1. pBIDC-UASC-pLXvectをEcoRIおよびXbaIで分解します。直鎖状化されたpBIDC-UASC-pLXvectをアガロースゲル電気泳動で分離し、ゲル抽出キットを用いて精製します。
      2. 所定の数 (N) の Gibson アセンブリ反応に対して、次のようにマスターミックスを調製します:(N+1) x 0.14 μL の 3.36 μM 直鎖状化 pBIDC-UASC-pLXvect、および (N+1) x 1.8 μL の Gibson アセンブリマスターミックス。
      3. よく混ぜて、マスターミックスをスピンダウンします。マスターミックス1.94μLを各チューブに分注します。各チューブに1.66 μLのCas9切断プラスミドを添加します。十分に混合し、反応液を50°Cで1時間インキュベートします。
         注:インキュベーション前にマスターミックスとチューブを氷にしてください 50°C。
3. ギブソン組立製品で 大腸菌 を変形させます。
   注:ギブソンアセンブリの製品は、 大腸菌 形質転換前に精製する必要はありません。
   1. 氷上で細菌のコンピテントセルを解凍します。10 μLの細胞を、あらかじめ冷却した各1.5 mLチューブに分注します。
      注:形質転換効率が少なくとも1 × 10⁸ CFU/μgのpUC19 DNAを持つコンピテント細菌細胞が推奨されます。
   2. 10 μLのコンピテントセルと1 μLのGibsonアセンブリ製品と穏やかに混合します。氷の上に30分間置きます。
   3. 42°Cで1分間ヒートショックし、その後氷上で2分間冷やします。
   4. 予熱したSOC培地100μL(37°C)を各チューブに加えます。250rpmで37°Cで1時間振とうします。
   5. 15 μg/mL のクロラムフェニコールを含む LB プレートに細胞を置きます。37°Cで一晩インキュベートします。
      注:これらの手順を大規模に実行するには、通常、数時間かかります。特に明記されていない限り、試薬と反応セットアップの両方を氷上に保管してください。
4. UAS-cDNA/ORFプラスミドの検証。
   1. 4.5 mLのLB培地に1つのコロニーに15 μg/mLのクロラムフェニコールを接種します。250 rpmで37°Cで一晩振とうします。
   2. プラスミドミニプレップキットを使用してプラスミドDNAを単離します。
   3. 300-500 ngのプラスミドDNA、0.3 μLのPvuII、2 μLの10xバッファー、および超純水を含む各プラスミドについて、20 μLの制限酵素消化反応を調製します。反応を37°Cで1時間行いましょう。
   4. DNA断片を0.8%アガロースゲルで分離します。UV光下での画像(図3)。

Results

私たちは、CRISPRshuttleを利用して、 ショウジョウバエ⁷に保存されている1,397のヒト遺伝子を網羅するUAS-cDNA/ORFプラスミドコレクションを構築しました。制限分析の結果、CRISPRshuttleは、2つの反復配列を含むCRISPRshuttle適合デスティネーションベクターの使用で94.5%、反復配列のないデスティネーションベクターの使用で96.1%の効率に達することが明らかになった⁷。私たちのデータは、通常、2人の研究者が^{7日以内に}CRISPRshuttleを介して~300プラスミドを作成できることを示しました7。CRISPRshuttleを介したcDNA/ORFフラグメント導入の成功は、診断用制限酵素処理によって確認されました。CRISPRshuttle適合ターゲットベクター(pBIDC-UASC-pLXvect)骨格特異的フラグメント(PvuIIによる消化の場合は1,072 bpおよび1,820 bp)を生じる反応は、陽性と見なされました(

Discussion

CRISPRshuttleプロトコルの重要なステップは、線形化されたCRISPRshuttle適合デスティネーションベクターの調製です。完全な消化を確実にするためには、過剰な制限酵素を使用してベクターを消化し、消化されたベクターのゲル精製を強く推奨します。もう一つの重要なステップは、Cas9によるcDNA/ORFプラスミドの消化です。プラスミドの構築に失敗した場合は、アガロースゲル電気泳動を使用して、ドナープラスミドから少なくとも部分的なcDNA/ORFが放出されているかどうかを確認します。あるいは、Gibsonアセンブリに進む前に、電気泳動によるすべてのプラスミドの消化を確認してください。CRISPRshuttleは、通常、部分的なcDNA/ORFが放出される限り、効果的に機能します。cDNAs/ORFがドナープラスミドからほとんど放出されない場合は、プラスミドを再抽出します。

ヒトCCSB-Broad Lentiviral Expression LibraryのpLX304ベクターにクローニングされたORFから...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
寒天粉末	ケムベース	KBS-001H
アガロース	サンゴン	A600014-0100
自動デジタルゲル画像解析システム	タノン	タノン-2500B
クロラムフェニコール	サンゴン	A100230-0010
E.Z.N.A. ゲル抽出キット	オメガ	D2500-02
E.Z.N.A. プラスミドDNAミニキットI	オメガ	D6942-02
エコリ-HF	NEB	R3101S
ギブソンアセンブリマスターミックス	NEB	E2611S型
HiScribe T7 クイックハイ収率RNA合成キット	NEB	E2050
NEBuilder HiFi DNAアセンブリマスターミックス	NEB	E2621X型
PCRサーマルサイクラー	ロングジーン	T20
Platinum SuperFi II DNAポリメラーゼ	サーモサイエンティフィック	12361010
PVUII-HF型	NEB	R3151L
Q5 ホットスタート ハイファイ 2x マスターミックス	NEB	M0494
S. pyogenes Cas9	ジェンスクリプト	Z03386
シェイキングインキュベーター	ジチュウ	ZQLY-180V
分光 光度 計	島津製作所	バイオスペックナノ
T4 DNAリガーゼ	プロメガ	M1801
Trans 10 化学的コンピテントセル	トランスジェネーション	CD101-02
トリプトン	オキソイド	LP0042
XbaI	NEB	R0145S
酵母エキス	オキソイド	LP0021