方法論記事

インビボParamecium tetraureliaにおけるタンパク質相互作用研究のための近接ビオチン化

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DOI：

10.3791/68504

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2025年9月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

この記事について

サマリー

このプロトコルは、目的のタンパク質に融合したビオチンリガーゼへのビオチンの近接性に基づいて、タンパク質へのビオチンの in vivo 共有結合の方法を提示する。この修飾により、タンパク質相互作用研究で必要に応じてストレプトアビジンビーズを使用してタンパク質を選択的に濃縮することができます。

要約

ゾウリムシ は、減数分裂生殖中のプログラムされたゲノム再構成とトランスポゾン除去に関与する分子メカニズムの研究のための主要なモデル生物です。このプロセスの多くの詳細は、関与する分子機構の複雑さと一過性のタンパク質間相互作用のために謎のままです。ここでは、目的の標的タンパク質の近くに位置するビオチンによるタンパク質の時間分解標識の方法を提示します。この方法は、操作されたビオチンリガーゼに融合した標的タンパク質をコードするDNAを注入することによってビオチン化が達成されるため、さまざまな標的に簡単に適応できます。融合コンストラクトは、内因性遺伝子のプロモーターから発現され、天然タンパク質と同様の段階特異的発現プロファイルを可能にします。特に、共有結合したビオチン部分により、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを使用して標識タンパク質を選択的に濃縮できます。さらに、免疫蛍光染色により、効率的な標識には培養物にビオチンを補給する必要があることを示しています。プラグアンドプレイの操作型発現ベクターは、ここで実証された効率的な注入手順と組み合わされて、修飾タンパク質を発現する ゾウリムシ 系統の迅速な生成を可能にします。ここで示されているビオチン化手順は、標的タンパク質の相互作用するパートナーを含む濃縮タンパク質を同定するための質量分析でフォローアップすることができます。近接ビオチン化は、 ゾウリムシ におけるタンパク質間相互作用の発見を簡素化および加速し、そのゲノム編集機構を理解するための努力を強化する可能性を秘めています。

概要

繊毛単細胞生物ゾウリムシテトラウレリアは、遺伝情報を長期保存するための生殖細胞核と細胞の生理学的機能のための体細胞核の2つの異なるタイプの核を保有しています1。この生物の有性生殖には、新しい体細胞ゲノムの形成が必要です。このプロセスには、転移因子3およびその他のリピートを含む体細胞ゲノム2からの45,000を超えるDNA断片の不可逆的な切除が含まれます。特に印象的なのは、切除イベントが単一塩基対1までの精度で実行されることです。切除されたDNA断片はタンパク質コード領域4を破壊し、切除に欠陥があるとフレームシフト変異、早期停止コドン、またはタンパク質コード配列が変化する可能性があるため、この精度は生物学的に必要です。複雑なRNA比較メカニズムにより、細胞は新しい体細胞ゲノムに必要な配列を分化できます。これは、生殖細胞ゲノム全体の転写5から開始され、続いて25 bp6のサイズにトリミングされ、古い体細胞ゲノム7に輸送され、そこですべての相補的なRNAが破棄されます8。古い体細胞ゲノムに相補的な配列を欠いている残りのsRNAは、さらに新しく発達中の体細胞ゲノムに輸送され、そこで生殖細胞系に制限された配列に整列し、それらの切除を指示します9。この複雑な多段階プロセスには、多くの細胞成分の正確かつタイムリーな相互作用が必要であり、特に、低分子RNAが異なる核間を通過する際の一過性の弱い相互作用が必要です10,11。以前は、プロセスの分子力学を理解する試みは、推定成分がプロセスに不可欠であるかどうかを判断するためのノックダウン実験を使用して行われ、続いて必須タンパク質の相互作用を明らかにするための免疫沈降アプローチが行われました12,13,14。この方法は、プルダウン中の非生理学的条件にも耐える強力で連続的な結合の検出に役立ちますが、弱く一過性の相互作用の検出には、面倒な最適化が必要になる場合があります。ゲノム編集プロセスに関与する多くの相互作用は潜在的に一過性であるため、in vivo 法はそのような相互作用の検出を改善する可能性があります。さらに、一部のタンパク質は細胞外条件で効率的に可溶化できない15、これは、ビオチンによる近接標識などのin vivo相互作用ベースのタンパク質修飾によって解決できる問題を表しています。

ここでは、目的の標的タンパク質の近くに局在するタンパク質の特異的な in vivo ビオチン化を可能にする新しい方法について説明します。共有結合ビオチン修飾は、ストレプトアビジンベースのプルダウンアプローチを使用して効率的な濃縮に使用できます。この方法の開発は、ビオチンリガーゼTurboID16を使用して、 ゾウリムシテトラウレリアのタンパク質相互作用研究を行うことによって達成されました。私たちのアプローチは、プロトコルで概説されている手順に従って、あらゆる標的タンパク質に簡単に適用できます。したがって、この記事では、著名な原生動物モデル生物におけるハイスループットプロテオミクス研究に使用できる近接ビオチン化のための効率的でスケーラブルな戦略を提供します。

プロトコル

1. 一般的な方法

  1. 表1にリストされているバッファー、試薬、およびその他の材料を入手します。
  2. 前述のようにモノクローナルゾ ウリムシ 系統を培養します17.簡単に言えば、減数分裂周期の早期開始を防ぐために、細胞密度が500細胞/ mL未満に保たれるように、細菌化軽培地(0.8μg / mL β-シトステロール)を含む新しいうつ病スライドウェルに1つの細胞を移します。50回の細胞分裂で、細胞を細菌化リッチ培地培養物(0.8μg/mL β-シトステロールを含む)に移し、すべての細菌が消費されるまで放置し、それによって有性生殖(自家一妻制)を誘導します18。
    注:有性生殖サイクルが完了すると、細胞は新しい栄養源が提供されるまで、分裂しない自家婚後の状態のままになります。
  3. コドン最適化された3x HA turboID配列を上流の制限酵素カット部位で含むベクターを使用して、標的遺伝子の融合タンパク質を構築します。
    1. 適切な制限部位をコードするオーバーハングで設計されたプライマーを使用して、ゲノムDNAから標的遺伝子とそのプロモーター領域のPCR増幅を実行します。
    2. 標準的な制限分解を使用して、turboIDコーディング領域の上流にあるフレーム内互換カットサイト19 に製品を挿入します。
  4. 大 腸菌 DH5αで構築されたプラスミドDNAの配列決定、検証、増幅。プラスミドミディプレップキットを使用してプラスミドを単離し、制限消化によって100 μgのプラスミドDNAを線形化します。
  5. フェノールクロロホルム抽出を使用して精製し、遠心フィルター12でろ過します。エタノール沈殿を行い、DNAペレットを水に溶解して5mg/mLの濃度を得る。
    注:DNAは、以下のマイクロインジェクション手順を使用して、 ゾウリムシ 細胞の体細胞核に導入できます。

2. 体細胞核へのマイクロインジェクション (MAC)

  1. ステップ1.2で得られた自家結合後培養物から、0.8μg/mLのβ-シトステロールを含む細菌化軽培地を含む新鮮なうつ病スライドに細胞を移します。注射前に27°Cで2日間インキュベートし、細胞を回収します。
  2. 実体顕微鏡を使用して、回収した培養物から洗浄培地で満たされた新しく調製されたくぼみスライドに細胞を移します。
  3. 細胞を洗浄培地に入れている間に、20 μLのddH2Oをスライドガラスに加え、カバーガラスで重ねます。
  4. カバーガラスの上に200 μLの鉱物油を加えます。
  5. この後、できるだけ少ない液体量を使用して、個々の洗浄細胞を鉱物油の下に液滴として移します。スライドごとに1つのセルを含む最大20個の気泡を配置し、準備したスライドを注射顕微鏡の台座に置きます。
  6. 吸引針を取り付けて所定の位置に移動し、ロボットアームと射出成形機を始動します。
  7. マイクロローダーピペットチップを使用して、ステップ1.5で調製したDNA溶液2〜3 μLを注射針に加えます。針をロボットアームに取り付けて所定の位置に移動し、射出成形機の圧力バルブに接続します。
  8. ロボットアームを使用して、スライド上の空の水滴に注射針を配置します。次に、 Clean を押して、DNAの流れが観察されるまで注射針に残っている空気をパージします。
  9. 細胞を含む液滴に移動し、吸引針を下げます。細胞が固定されるまで、この液滴から液体(水)をそっと取り除きます。
  10. 吸引針を上げて注射針を下げてから、より高い倍率に切り替えます。
  11. 体細胞核(MAC)が、注射針を挿入する必要がある食物液胞のない暗い領域( 図1cを参照)として見えることを確認します。
  12. 注射針でMACを完全に貫通することを目指し、数秒かけてゆっくりと針を引っ込めます。
    注:針がMACの内側にある場合、注射機によって加えられる一定の空気圧により、DNAはMAC内を流れます。注入されたDNAからなるびまん性液胞は、MACの境界内で見えるようになる可能性があります。
    注:注射を確実に成功させるために、同じ細胞を複数回注入することが可能です。
  13. 細胞注入が完了したら、手順2.9で吸引した水が入った吸引針を下げます。セルが再び動き始めるまで、流れを逆にして液滴に十分な水を戻します。
  14. 細胞を含むすべての液滴が処理されるまで続けます。
  15. スライドから液滴を収集し、それぞれを0.8 μg/mLのβ-シトステロールを含む細菌化軽培地で満たされた別々のウェルに移すことにより、注入された各細胞を回収します。
  16. 27°Cで一晩インキュベートし、各ウェルから新しいウェルに単一細胞を移し、バックアップとして元のウェルを18°Cに維持します。
  17. 移された細胞を27°Cで一晩1日間培養し、次に各モノクローナルウェルから5つの細胞をPCRチューブに移します。増幅にはコンストラクト特異的プライマーを使用して、細胞内に注入されたDNAの存在を確認します。

3. 正しいタンパク質局在とビオチンリガーゼ機能を検証するための免疫蛍光染色

  1. 選択したPCR陽性クローンを、0.8 μg/mLのβ-シトステロールを含む20 mLの細菌化培地で培養します。
  2. 培地の濁りが下がったら、培養物から50 μLのサンプルを採取します。1 μLのDAPI溶液(0.1 mg / mL)と1 μL EDTA(0.5 mM)をDNA染色用に添加し、自家一妻制の開始を確認します。
    注:オートガミーは通常、2,000細胞/ mLの細胞密度で始まります。
  3. ビオチン化が必要な場合は、細胞を採取する前に、少なくとも1時間、最終濃度500μMまで培養培地を補給します。
  4. 280 x g の洋ナシ型チューブを備えた油測定遠心分離機を使用して、適切な発生段階で細胞を2分間回収します。培地を廃棄し、PBSをチューブに加え、再度遠心分離してPBSを除去します。
  5. 細胞ペレットをPBSに再懸濁し、透明な1.5 mL微量遠心チューブに移します。
  6. 37%ストック溶液からPBSで3.7%PFA希釈液を調製します。
  7. 細胞ペレットを0.5 mLの3.7%PFAに再懸濁し、チューブローテーター上で室温で30分間インキュベートします。
  8. 目に見えるペレットが形成されるまで、600 x g で1分間遠心分離します。PFA溶液は、指定された専用廃棄物容器に廃棄してください。
  9. ペレットをPBS中の1 mLの50 mMグリシンに再懸濁します。チューブローテーターで5〜10分間インキュベートします。
  10. 600 x g で1分間遠心分離します。上清を取り除き、0.8 mLの1x PBSを加えます。オプションで、PBSでもう一度洗浄します。
    注:この時点で、必要に応じて細胞を4°Cで保存できます。
  11. 600 x g で1分間遠心分離し、PBSを除去し、500 μLの0.5%Triton X-100をPBSに加えます。チューブローテーターで20分間インキュベートします。
  12. ペレットが見えるようになるまで遠心分離し(1,000 x g 2分間)、Triton X-100溶液を取り出し、細胞をPBSに再懸濁します。
  13. 必要な抗体量に応じて、PBS中の5%BSA溶液を調製します。
  14. 細胞からPBS洗浄液を除去し、PBS中の5%BSAで希釈した一次抗体100 μLを細胞に加えます。使用する抗体に応じてインキュベーション時間を調整します。
    注:ほとんどの抗体では、室温で2時間インキュベートするだけで十分です。
  15. 600 x g で遠心分離し、一次抗体希釈液を除去し、細胞を 500 μL の PBS で洗浄します。
  16. PBS中の5%BSAで希釈した二次抗体100 μLを加えます。インキュベーション時間を調整します。一般的に、室温で1時間で十分です。蛍光色素を光から保護するために、チューブをアルミホイルで覆います。
  17. 二次抗体とのインキュベーションの最後の10分間に1 μLのDAPI溶液(0.1 mg/mL)を加えます。
  18. 600 x g で1分間遠心分離し、染色液を取り除き、PBSで2回洗浄します。2回目の洗浄液20 μLをチューブ内に残し、細胞を再懸濁します。
  19. 10 μLをスライドに取り付けて、顕微鏡で検査します。

4. ビオチン化タンパク質の選択的濃縮

  1. 3.4で説明されているように、正しい発生段階で1 x 106 細胞を採取します。
  2. ペレットを3 mLの溶解バッファーに再懸濁します。
  3. ダウンスホモジナイザーに移し、100回の乳棒ストロークで細胞を溶解します。
  4. ライセートを2本の微量遠心チューブに移し、21,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  5. 20 μL(サンプルあたり)のパルスボルテックス再懸濁ビーズスラリーを微量遠心チューブ内で1 mLの溶解バッファーと混合し、2分間インキュベートすることにより、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを平衡化します。
  6. 磁気スタンドを使用してビーズから溶解バッファーを取り出し、溶解バッファーに再懸濁します。
  7. 手順 4.6 を繰り返します。
  8. 溶解バッファーを取り出し、平衡化したビーズをステップ4.4の上清(清澄化ライセート)と混合します。
    注:ビーズに結合するための最適な塩濃度と界面活性剤の割合は異なる場合があり、実験的に検証する必要があります。さらに、ペレットを50 μLの2%SDS中4.4から60°Cで10分間インキュベートして不溶性画分からタンパク質を抽出し、続いて21, 000 x g で10分間遠心分離することができます。この抽出物を清澄化したライセートとビーズに加えます。
  9. 管回転器で室温で1〜2時間インキュベートします。
  10. チューブを短時間遠心分離(<1秒)して、すべての液体をチューブの底に回収し、ビーズを磁気スタンドに回収し、上清(フロースルー)を洗浄バッファー1と交換します。
  11. チューブローテーターで5分間インキュベートし、ステップ4.10のように2回目の洗浄を繰り返します。
  12. 洗浄バッファー1を洗浄バッファー2に交換して、さらに2回の洗浄(洗浄3と4)を行います。
  13. 洗浄バッファー2を洗浄バッファー3に交換して、2回の最終洗浄(洗浄5および6)を行います。
  14. 最終洗浄液を除去した後、ビーズを-20°Cで保存してから下流処理します。
    注:ビーズは、ウェスタンブロット分析のためにLaemmliバッファーで溶出し、タンパク質同定のためのオンビーズペプチド調製のために質量分析サービスに提出することができます。

結果

私たちのプロトコルは、標的タンパク質の近傍にあるタンパク質に共有結合ビオチン修飾を導入するための簡略化された方法を記述しています。 Paramecium (図1A).これらのビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンプルダウンを使用してさらに濃縮され、質量分析を使用して同定できます20.この方法の実際のユースケースを実証するために、プロトコルをNowa1タンパク質に適用しました。このタンパク質はゲノム再構成プロセスに不可欠であり、その局在化に動的な変化があります12.初期段階では、古い体細胞核と断片に残りますが、後に新しい発達中の核に位置します。特に、Nowa1相互作用タンパク質のタグ媒介濃縮に関する以前の試みは失敗しました(未発表の結果)。これは、プルダウン手順中に最適でない条件下で自己凝集を引き起こす可能性のあるプリオンタンパク質PrP27との類似性を持つ複合反復によるものと考えられます21.プロモーターを含む上流の非コード領域とともに、Nowa1コード領域をPCRで増幅しました。次に、生成物をコドンに最適化されたturboIDエンコード配列(図1B).環状DNAの注入によって引き起こされる導入遺伝子誘発性サイレンシングを回避するには、 Paramecium、ベクターは注入前に線形化されました。次に、線形化および精製されたDNAを、このプロトコルに記載されているように体細胞核(MAC)にマイクロインジェクションしました。体細胞核の暗い領域内に閉じ込められた分散した液滴は、成功した注射のいくつかで見えるようになりました(図1C).次に、細胞分裂中の細胞による注入の成功と細胞によるDNAの増幅をPCRによって検証しました。予想通り、細胞の40〜50%は、Nowa1コンストラクトの注入されたDNAに対して陽性でした(予想される製品サイズ685 bp)(図 2).次のステップは、注入されたDNAによってコードされるタンパク質の存在を確認することでした。レシピエントベクターには、トリプルHAタグが隣接するturboID配列が含まれているため、免疫蛍光染色を使用してタグを検出しました。これにより、注入された細胞が融合タンパク質を発現しているかどうか、およびそれが適切に局在しているかどうかを確認することができました。野生型のNowa1タンパク質で以前に観察されたように、2つの新たに発達中の核に融合タンパク質の局在を示した後期細胞を使用しました12.注射された個々の細胞株は、異なるレベルの融合タンパク質を示しました(図 3).バックグラウンドの低減が望ましいアプリケーションには、低い発現レベルが有益ですが、この場合、最大シグナルを選択し、最も高い発現を示したクローン2に進みました。次に、融合タンパク質の局在を追跡するために、さまざまな発生段階でサンプルを収集しました。このタンパク質は当初、古い体細胞核から形成されたかせと、オートワイアミーの初期段階で分離された核断片に局在していました。核アンラーゲンの出現時に、融合タンパク質はこれらの新しく発達中の核に移行しました(図4).さまざまな段階で近位プロテオームのビオチン化を促進するために、IF用の細胞を回収する前に、培養物に500μMビオチンを2時間補充しました。蛍光タグ付きストレプトアビジンを使用したIF染色を介してビオチン標識タンパク質を視覚化しました。観察されたシグナルは、HAタグ付き融合タンパク質の局在に対応していました。重要なことに、ビオチンとの短いインキュベーションでも有意なビオチン化を達成するのに十分であるため、さまざまな核発生段階に特異的なビオチン化局在化を得ることができたことです(図4).さらに、補足のビオチンを添加しない場合、注入された細胞では無視できるビオチン化しか検出できませんでした。野生型細胞では、補足のビオチンを添加しても検出可能なビオチン化は発生しませんでした(図5A).特に、ビオチンは単に発達中の核に蓄積しただけでなく、変性条件下でもタンパク質に付着したままです。(図5B).ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用して、ビオチン化タンパク質(図 6).濃縮されたタンパク質は、質量分析を使用して同定できます。これらのその後のタンパク質同定実験では、非添加培養物、および非融合ターボIDタンパク質を発現する細胞をバックグラウンド対照群として使用できます。

figure-results-1
図1:P.テトラウレリアにおける近接ビオチン化の手順の概要。 (A) プロトコルの一般化された概要。(B)プラグアンドプレイのturboIDレシピエントベクターのクローニング原理と、Nowa1融合タンパク質のコンストラクト。このプラスミドで使用される3'UTR領域は、CenH3aに由来します。(C)DNAの注入が成功した場合、体細胞核(MAC)に対応する暗い領域内に含まれる目に見えるびまん性液滴。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:注射が成功したためのPCR検査。 アンピシリン耐性(アンプスタート)をコードする上流領域に特異的なフォワードプライマーとNowa1を相補的なリバースプライマーを有する生成物のPCR反応のアガロースゲル分析矢印は予想される製品サイズを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-3
図3:turboID融合タンパク質の正しい局在を検証するための免疫蛍光染色。 Nowa1-HA-turboID融合タンパク質をコードするDNAのPCRシグナル陽性を持つモノクローナルゾウリムシ株のウサギ抗HA一次抗体(1:100)およびヤギ抗ウサギAlexa Fluor 568標識二次抗体(1:1000)を用いた免疫蛍光染色。スケールは20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図4:さまざまな発生段階におけるNowa1特異的ビオチン化。 新しい体細胞核形成中の進行段階におけるモノクローナルライン2の免疫蛍光染色培地には、最適な turboID 活性を得るために 500 μM ビオチンを添加しました。 HAタグは図3のように検出され、ビオチンはStreptavidin-FITC(1:200)を使用して検出されました。スケールは20μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-5
図5:turboIDによる効率的な近接標識には、培養物中のビオチンの補足が必要です。 (A)発生後期のwtおよび注入細胞の免疫蛍光染色により、Nowa1-HA-turboIDの発現と500 μMの補足ビオチンによる観察されたビオチン化が示されました。HAタグとビオチンは 図4のように検出されました。スケールは20μm。(B)500 μMビオチンで培養したwt細胞と、ビオチンの有無にかかわらずturboID注入細胞のHRP-ストレプトアビジンを使用したビオチンのウェスタンブロット分析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:ストレプトアビジン磁気ビーズによるビオチン化タンパク質の濃縮。 ストレプトアビジン被覆磁気ビーズを用いたプルダウン実験からの試料のビオチンのウェスタンブロット分析サンプルは、Nowa1-HA-turboID細胞ライセート(入力)、結合していない画分(フロースルー)、洗浄ステップ(洗浄1〜6)、およびビーズに結合したタンパク質(出力)です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで提示するプロトコルは、目的のタンパク質の近傍にあるタンパク質にビオチン部分を結合させるための技術を説明しています。ストレプトアビジンのビオチンに対する強い親和性に基づいて、これにより、修飾タンパク質の迅速かつ効率的な濃縮が可能になります。提示された方法は、目的のさまざまなタンパク質への迅速な適応性と組み合わせることで、 ゾウリムシにおけるマルチタンパク質相互作用の研究を容易にすることができます。このモデル生物は、減数分裂生殖中のトランスポゾンと宿主の相互作用に関する研究のために十分に確立されています3。さらに、プログラムされたゲノム再構成中に 45,000 を超える配列を切除するため、正確なゲノム編集のための新しい分子ツールを提供する可能性があります。このプロセスは、複雑な多成分機構によって調整され、各世代にわたって再現可能な切断部位を持つこれらのDNA断片のRNA指向性の正確な切除を可能にします。ここで紹介する方法は、このプロセスを研究するための2つの大きな利点を提供します。これにより、一過性のタンパク質間相互作用の発見が簡素化されます。さらに、プラグアンドプレイのレシピエントベクターにより、多くの機能的融合タンパク質を迅速に作成できます。 さまざまな段階でプロセスには複数の要因が関与している可能性が高いため、適応性により、切除機構の一部となる可能性のある多くのタンパク質の相互作用を明らかにすることができます。重要なことに、融合コンストラクトは内因性遺伝子のプロモーターから発現するため、天然発現の時間経過と僅差で一致します。さらに、このモデル生物への外因性遺伝物質の送達のためのマイクロインジェクションの使用が実証されているため、均質なモノクローナル集団の生成が可能になります。このような集団は、新しい体細胞核の発達が起こるオートパミープロセスのより同期的な開始を可能にします。

turboID融合コンストラクトを導入するための実証された手順は堅牢ですが、ビオチン化のメカニズムにより、下流のタンパク質濃縮プロトコルで特定の最適化が必要になる場合があります。融合した turboID 酵素は、酵素から拡散する反応性ビオチン-AMP 部分を生成するため、これらは近くの求核部分と反応する可能性があります。したがって、この方法論の重要なステップは、バックグラウンドヒットと、実際の相互作用パートナーではないターボID融合タンパク質の一般的な近傍に局在するタンパク質から真の相互作用パートナーを特定することです。これを達成するために、ビオチン16とのインキュベーション期間など、パラメータのバリエーションを調整することができます。さらに、培地中にビオチンを補給しない対照群を含む実験セットアップは、バックグラウンド結合を示す可能性があります。実証されているように、このような対照群は実際の実験と遺伝的に同一になりますが、ビオチンの存在量が少ないため、turboIDによるビオチン化は大幅に減少します。その他の重要な対照群には、非融合ターボIDタンパク質と野生型グループが含まれ、どちらもビオチンを添加した培地で培養されます。さらに、ストレプトアビジンのビオチンに対する強い親和性は、抗体ベースのプルダウンよりも大きな利点ですが、塩と界面活性剤の濃度が異なると、濃縮の純度と効率に影響を与える可能性があります。

優れたプロテオミクスアプローチは、ゾウリムシ、そして潜在的に他の繊毛虫の独特の分子機構についての理解を深める可能性があります。新しい機能を持つ分子成分は、合成生物学のツールとして再利用されることが期待されており、したがってバイオテクノロジーの開発を促進する可能性があります22,23。操作された合成タンパク質は、多くの場合、以前は実行不可能だった治療用途を可能にする新しい特性を持つ機能ドメインの組み合わせで構成されています。人工タンパク質は、医薬品製造プロセスでも使用できます24。ゾウリムシからのRNA指向ゲノム切除システムは、そのような開発のために特に興味深いものです。このシステムは、数千のDNA断片のRNA依存性切除を、1塩基25までの精度で実現します。このようなパラメータにより、ヒト細胞におけるゲノム編集の精度を向上させることが興味深いものになります。提示された近接ビオチン化法は、新規タンパク質成分の発見とマルチタンパク質分子マシン内でのそれらの相互作用の発見をスピードアップし、促進するために使用できます。

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、ベルン大学のDigiK助成金とスイス国立科学財団の助成金によって資金提供され、229074 B.-A.S.に授与されました。スイス国立科学財団の助成金214853 M.N. に授与されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
顕微鏡 Axiovert 40 CFL (10倍、40倍レンズ)ツァイスナ
b-シトステロールシグマ・アルドリッチ567152
ウシ血清アルブミン(BSA)シグマ・アルドリッチA9647
セルトラムオイルエペンドルフナ
コドン最適化3xHA-turboID DNA配列ツイストバイオサイエンスナGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGTTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGTgt
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTTT t
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTGTGTGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA
TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
、TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPIのシグマ・アルドリッチD9542
EDTAのフィッシャーサイエンティフィックAAA151610B
epT.I.P.S.マイクロローダーチップエペンドルフ5242956003
エタノールグロッグケミー1009832500
フェムトジェット4iエペンドルフナ
フェムトチップIIキャリバーサイエンティフィック5242957000
ホルムアルデヒド溶液シグマ・アルドリッチF8775
グリシンアプリケム10021259
ヤギ抗ウサギIgG抗体、Alexa Fluor 568サーモフィッシャーサイエンティフィックA-11011
HAタグ(C29F4)ウサギ用mABセルシステム3724
インジェクトマンNI2エペンドルフナ
ライトミディアムナナ2.5 mM Na2HPO4中の0.2x小麦草粉末溶液
鉱油シグマ・アルドリッチM8691
Na2HPO4シグマ・アルドリッチ71643
フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコホールシグマ・アルドリッチ77617
蛍光体緩衝生理食塩水&nBSP;フィッシャーサイエンティフィック10722497
プラスミドとミディプレップキットキアゲーン12945
リッチミディウムナナ2.5 mM Na2HPO4中の1xウィートグラス粉末溶液
ストレプトアビジン-FITCサーモフィッシャーサイエンティフィック11-4317-87
Ultrafree-MC GV遠心フィルター EMDミリポアUFC30GV00
洗浄液ナナボルビック水の0.1%BSA 
ウィートグラスパウダー溶液パインズ・インターナショナルナ前述のように粉末から20倍のストックとして調製します(0.5g / 10mL)。
ストレプトアビジン-HRPアブカムAB7403
ストレプトアビジンコーティングされたマグナティックビーズシグマ・アルドリッチLSKMAGT02
プルダウン用溶解バッファーナナ50 mM トリス pH 8;150 mM NaCl;0.5%デオキシコール酸ナトリウム;1% トリトン X-100;5 mM MgCl2;2x cOmplete プロテアーゼ阻害剤 (Roche); 
プルダウン用の洗浄バッファー1ナナ50 mM トリス pH 8;150 mM NaCl;0.5%デオキシコール酸ナトリウム;1% トリトン X-100;5 mM MgCl2;
プルダウン用洗浄バッファー2ナナ10 mM トリス pH 7.4;150 mM NaCl;0.01%NP40;1 mM MgCl2
プルダウン用洗浄バッファー3ナナ10 mM トリス pH 7.4;150 mM NaCl;

参考文献

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